彭欣怡 程琴 黃秋偉 李慧敏 王麗萍

摘 要 從鋸葉棕成熟種子中成功實現(xiàn)體細胞胚胎發(fā)生和植株再生。成熟種子放在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，加入0.15%活性炭，452 μmol/L 2，4-D和14.7 μmol/L N6-2iP，所有成熟合子胚培養(yǎng)5周后長出體胚簇，12周后，外植體轉移到2，4-D濃度減到90.4 μmol/L的MS培養(yǎng)基中進行體胚增殖，之后體胚轉移到含有0.9， 9 μmol/L TDZ或沒有生長調(diào)節(jié)劑的基本培養(yǎng)基中轉化成小植株。9 μmol/L TDZ對植株再生是無效的，然而，在0.9 μmol/L TDZ中作次培養(yǎng)有12%胚胎能長成完整植株，沒有生長調(diào)節(jié)劑中35%胚胎長出嫩枝，這些嫩枝轉移到含有22.2 μmol/L NAA的培養(yǎng)基中全部都會生根。picloram和2，4-D對鋸葉棕幼苗愈傷的誘導效果最佳，6-BA次之，對子葉來說，picloram和2，4-D對愈傷的誘導起不到任何作用，而對莖尖的誘導效果最好。

關鍵詞 離體培養(yǎng) ；鋸葉棕 ；體細胞胚胎 ；愈傷誘導

中圖分類號 S792.91 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.011

鋸葉棕[Serenoa repens（bartram）small]，又名鋸棕葉或鋸棕櫚，學名“沙巴棕”，屬于棕櫚科灌木植物，主要生長在佛羅里達州以及南北美洲的氣候炎熱地區(qū)[1]。鋸葉棕是最理想的景觀植物，它是一種堅韌，低維護的綠色植物，其生長少受水分脅迫及植物病害和蟲害的影響[2]。其成熟的干燥果實可供藥用，近年來發(fā)現(xiàn)其提取物治療良性前列腺增生（BPH）和下尿路（LUTS）癥狀效果顯著，現(xiàn)已成為最有效的3種治療BPH植物藥物之一[3-4]。鋸葉棕作為草藥制劑價值連城，受歡迎程度也正在日益增長。

鋸葉棕通過傳統(tǒng)種子繁育存在一定的局限性[5]，自然萌發(fā)需4～6個月，幼苗生長緩慢，一般需要2～6年[6]，將種子繁育溫度提高到35℃，萌發(fā)時間縮短至約1個月[5]，然而，很少人清楚鋸葉棕在自然條件下的最佳生長和結果條件。

植物組織培養(yǎng)是植物快速繁育的重要技術手段，通過組織培養(yǎng)可以大規(guī)模繁育基因優(yōu)良物種，進行種質資源保護，也可以進行遺傳轉化實驗。國內(nèi)尚無鋸葉棕組織培養(yǎng)的報道。本研究的宗旨是為了發(fā)展鋸葉棕體外再生的組織培養(yǎng)體系，以期為快速繁育國內(nèi)優(yōu)良稀缺植物資源提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

廣西亞熱帶作物研究所與美國加州灣食品科技公司合作引種、試種生長10年的鋸葉棕種子[7]。

1.2 方法

1.2.1 外植體準備

將收獲放置在陰暗干燥環(huán)境下保存1年的種子，剝?nèi)スず头N皮，在超凈臺上用無菌水洗1遍，再用0.1% 升汞搖晃消毒8 min，去掉消毒液，用無菌水沖洗3遍，每次5 min。將消毒好的種子用枝剪進行橫切和縱切，露出種子凝膠狀的胚乳和圓錐形的胚。1粒種子1個培養(yǎng)皿。

1.2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

用1.0 mol/L NaOH 將全部培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié) 為5.8，121℃高壓滅菌20 min。根據(jù)不同試驗在基礎培養(yǎng)基中添加不同種類和濃度的激素，26℃黑暗培養(yǎng)。鋸葉棕體胚再生培養(yǎng)基和愈傷組織誘導培養(yǎng)基見表1。

1.2.3 愈傷組織的誘導

選取已經(jīng)萌發(fā)成苗的小植株的莖尖、根尖及側根、子葉等部位以及胚簇進行愈傷組織的誘導，并設置不同激素進行實驗，26℃暗培養(yǎng)40 d，觀察愈傷組織分化情況，比較愈傷組織誘導的結果，以確定根系外植體的最佳部位。

2 結果與分析

2.1 體細胞胚胎發(fā)生與植株再生

機械破損處理能大幅度提高鋸葉棕發(fā)芽率，發(fā)芽率可達到90%，機械破損處理是鋸葉棕最有效的促芽方式[11]，用枝剪進行橫切和縱切，露出種胚以提高種子的萌發(fā)率。將處理好的種子每6周轉接一次新鮮MS1培養(yǎng)基（圖1a）。12周后，外植體轉移到2，4-D濃度減到90.4 μmol/L的MS2培養(yǎng)基中增殖，每個原始合子胚增殖為大約200個體細胞胚胎（圖1b），在35周內(nèi)，增殖會繼續(xù)，但在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)不能再維持。

將體細胞胚胎分別轉移到TDZ濃度為0，0.9和9 μmol/L 的MS3培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃，光照16 h/d（圖1c）。每個處理用100個體細胞胚胎實驗，在TDZ為0的培養(yǎng)條件下，35%的胚胎長出嫩芽，但不長根；在0.9 μmol/L TDZ的培養(yǎng)中有12%的胚胎產(chǎn)生芽與初級根（圖1d），在含有9 μmol/L TDZ培養(yǎng)基中既不出芽也不生根。沒有生長調(diào)節(jié)劑和含有0.9 μmol/L TDZ培養(yǎng)基中誘導得到的小苗轉移到含有22.2 μmol/L NAA的MS4培養(yǎng)基中誘導生根，培養(yǎng)8周后，所有的47株外植體都能產(chǎn)生初級根和次生根（圖1e）。

2.2 體胚愈傷組織誘導

棕櫚科植物誘導愈傷難，時間長，但近期報道從油棕未成熟雄性花序成功誘導愈傷，其中加有激素picloram的愈傷誘導率為82%，萘乙酸的誘導率為54%[10]。鐵皮石斛已經(jīng)建立了一個高效愈傷誘導率的體系，將原球莖片段放在1/2 MS培養(yǎng)基上，輔有NAA，6-BA，2，4-D等激素，其中以8.8 μmol/L 6-BA的培養(yǎng)基中愈傷誘導率最高[9]。綜合以上信息，采用愈傷誘導培養(yǎng)基對已經(jīng)萌發(fā)成苗的小植株的莖尖、根尖及側根、子葉等部位以及胚簇進行愈傷組織的誘導，結果顯示（表2），子葉和莖尖部位可以形成愈傷，根部和剛萌發(fā)出的體胚不能形成愈傷組織。picloram和2，4-D誘導莖尖效果最好，6-BA次之，picloram和2，4-D對子葉愈傷組織誘導無效，結果表明，莖尖是鋸葉棕最佳的愈傷誘導材料。

3 討論

鋸葉棕跟其他棕櫚一樣，是多年生木本單子葉植物，未成熟合子胚是胚胎發(fā)生最好的外植體。但本試驗利用的是成熟的種子，體胚的形成也只需約1.5月。油棕成熟合子胚添加450 μmol/L picloram和2.5 g/L活性炭的胚性愈傷組織誘導率可以達到97.5%[10]?；钚蕴坑捎谄淠芪椒枷阕寤衔铮虼丝梢晕椒宇愇镔|，使多酚氧化酶和過氧化物酶失活[12]，此特性在棕櫚組織培養(yǎng)中降低外植體的褐化、增強再生方面起到非常重要的作用[13]。因此，棕櫚組培中加活性炭是常見的方法[14]。不加活性炭的培養(yǎng)基，氧化性太高，所有的合子胚都褐化而不能萌發(fā)，一旦加有活性炭，沒有氧化和酶類積累，在2周內(nèi)胚可以膨大到原來體積的4倍。5周后所有的外植體開始長出半透明的胚簇。由于活性炭也可以吸附植物生長調(diào)節(jié)因子，它也可能對組培產(chǎn)生負面影響。通過放射性示蹤劑顯示，100 μmol/L 2，4-D在5 d內(nèi)被0.25%的活性炭吸附掉99.5%[15]，然而，本試驗使用半固體培養(yǎng)基、減少活性炭濃度和增加2，4-D濃度可以增加2，4-D可利用率。雖然還不清楚在含有0.15%活性炭的半固體培養(yǎng)基中，452 μmol/L 2，4-D可利用的準確百分比，但是這些培養(yǎng)條件大大增加了自由2，4-D的數(shù)量，這樣就有足夠的可利用2，4-D來誘導胚胎發(fā)生。

棕櫚植物主要用種子進行繁殖，棕櫚植物的種子播種后發(fā)芽難，發(fā)芽時間長，出苗不整齊是其特點，也是生產(chǎn)中的難點[16]。幼苗的愈傷誘導中，莖尖是最好的誘導材料，2，4-D和picloram是最佳的激素誘導劑，但在實驗中發(fā)現(xiàn)，從1粒種子誘導出的愈傷組織只分化成2～3株小苗，從接種到分化成苗，花時間半年有余，還達不到擴大數(shù)量的目的，所花時間、物力和人力也不少，所以在短期內(nèi)用少量珍稀珍貴的引種品種，進行大量繁殖推廣較難，后續(xù)工作還需進一步研究。

4 小結

本研究中，鋸葉棕不經(jīng)過愈傷過程直接再生，可以維護外植體來源的完整性，體細胞無性系變異較少，因此，這種再生體系更有利于繁殖棕櫚獨特基因型和種質資源保護。更多的研究旨在考察不同生長調(diào)節(jié)劑組合，以及不同基因型的響應，以便建立鋸葉棕最優(yōu)的體外再生系統(tǒng)。

參考文獻

[1] 林有潤. 觀賞棕櫚[M]. 哈爾濱：黑龍江科學技術出版社，2003.

[2] Tanner G W， Mullahey J J， Maehr D. Saw-palmetto： an ecologically and economically important native palm[M]. Florida Cooperative Extension Service， IFAS，University of Florida， 1996.

[3] 王 萍，馬子龍，劉立云. 鋸葉棕的藥用價值及市場前景分析[J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè)，2007（3）：41-42.

[4] Taofikat B A， Max H P，Barbara W，et al. Serenoa repens （Saw Palmetto）A Systematic Review of Adverse Events[J]. Drug Safety， 2009， 32 （8）： 637-647.

[5] Gallo-Meagher M， Green J. Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryos of saw palmetto， an important landscape and medicinal plant[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2002， 68： 253-256.

[6] 何潔英. 棕櫚科植物種子繁殖及移栽技術初探[J]. 廣東園林，1998（1）：26-27.

[7] 周全光，黃錦媛，黃麗君. 美國鋸葉棕的引進與適應性觀測[J]. 廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2007（5）：21-22.

[8] Dias A C， Guerra M P， Cordoba A S，et al. Somatic embryogenesis and plant regeneration in the tissue culture of Geonoma gamiova（Arecaceae）. Acta Hort，1994， 360： 167-171.

[9] Zhao P， Wu F， Feng F S， et al. Protocorm-like body （PLB） formation and plant regeneration from the callus culture of Dendrobium candidum， Wall ex， Lindl[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant， 2008， 44（3）： 178-185.

[10] Talita A B， Zanderluce G L， Jonny E S P. New approaches to improve the efficiency of somatic embryogenesis in oil palm （Elaeis guineensis Jacq.） from mature zygotic embryos.In Vitro Cellular Developmental Biology Plant， 2013， 49： 41-50.

[11] 尚秀華，謝耀堅，張沛健，等. 藥用植物鋸葉棕種子萌發(fā)條件初探[J]. 種子，2014，33：70-73.

[12] Pan M J， van S J. The use of charcoal in in vitro culture-A review[M]. Plant Growth， 1998， 26： 155-163.

[13] Tisserat B. Date palm[M]//Sharp W R， Evans D A， Ammirato P V. Handbook of Plant Cell Culture. New York： Macmillan Publishing Company， 1984（2）： 505-545.

[14] Veramendi J， Navarro L. Influence of physical conditions of nutrient medium and sucrose on somatic embryogenesis of date palm. Plant Cell Tiss. Org. Cult， 1996， 45： 159-164.

[15] Ebert A， Taylor F ，Blake J. Changes of 6-benzylaminopurine and 2，4-dichlorophenoxyacetic acid concentrations in plant tissue culture media in the presence of activated charcoal[J]. Plant Cell， Tiss. Org. Cult， 1993， 33： 157-162.

[16] 何潔英. 棕櫚植物種子貯藏和繁殖研究[J]. 廣東園林，2002（3）：37-40.