叢漢卿 龍婭麗 齊堯堯 張振文 陳松筆 喬飛

摘 要 為研究木薯中調(diào)控支鏈淀粉合成的DBE和SBE基因如何被茉莉酸信號調(diào)控，首先對木薯基因組數(shù)據(jù)庫中的MeDBE和MeSBE2.1基因進行序列分析，二者都具有α淀粉酶催化結(jié)構(gòu)域且啟動子區(qū)都具有茉莉酸響應(yīng)元件等多種響應(yīng)元件。以木薯品種‘華南八號懸浮培養(yǎng)細胞為材料，利用qRT-PCR檢測木薯MeDBE和MeSBE2.1基因在茉莉酸甲酯處理后的表達特性。結(jié)果顯示：MeDBE基因的表達在最初短暫上調(diào)后持續(xù)下調(diào)，而MeSBE2.1則持續(xù)上調(diào)后又恢復(fù)最初水平，說明MeDBE和MeSBE2.1基因可被茉莉酸信號調(diào)控，進一步推測表明，其受到不同激素信號整合后的綜合調(diào)控，以影響支鏈淀粉的生物合成。

關(guān)鍵詞 木薯 ；DBE基因 ；SBE基因 ；茉莉酸 ；表達分析

中圖分類號 S533 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.010

木薯（Manihot esculenta Crantz） 屬大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot Miller）植物，原產(chǎn)熱帶南美洲[1]，是世界三大薯類作物之一，也是第六大糧食作物，具有重要的食用和工業(yè)價值。木薯作為一種高光效、高淀粉含量和高水分利用率的熱帶作物，研究其淀粉合成過程并進一步改善其品質(zhì)，具有重要的科學(xué)和經(jīng)濟價值。

在高等植物中，淀粉是儲藏碳水化合物的主要形式，一般由直鏈淀粉和支鏈淀粉2種葡萄糖多聚體組成。直鏈淀粉主要由顆粒結(jié)合的淀粉合成酶 （Granule-bound starch synthase， GBSS） 催化合成[2]，而支鏈淀粉的合成非常復(fù)雜，在可溶性淀粉合成酶 （Soluble starch synthase， SSS） 的作用下通過α-1，4糖苷鍵進行葡聚糖鏈的延伸達到一定長度后，在淀粉分支酶 （Starch branching enzyme， SBE） 作用下，在線性糖鏈的內(nèi)部引入α-1，6糖苷鍵形成分支，并進一步在SSS催化下延長分支，最后淀粉去分支酶（Starch debranching enzyme， DBE）對分支進行修飾，最終合成具有一定結(jié)構(gòu)特性的淀粉結(jié)晶體[2]。植物中DBE和SBE都有多種同工酶。根據(jù)系統(tǒng)進化關(guān)系SBE可以分為SBEI和SBEII 2種類型，它們不僅結(jié)構(gòu)有差異，而且作用于特異的底物：SBEI傾向作用于直鏈淀粉，主要催化轉(zhuǎn)移相對較長的多糖鏈，而SBEII傾向作用于支鏈淀粉，催化轉(zhuǎn)移較短的多糖鏈[3]。DBE同樣存在2種類型，一種為水解普魯藍（Pullulan）和極限糊精的α-1，6糖苷鍵的普魯藍酶或稱極限糊精酶（Pullulanase；Limit dextirnase），但對糖原和變性支鏈淀粉的α-1，6糖苷鍵無活性或弱活性；另一種為以變性支鏈淀粉、糖原和支鏈淀粉類似物為底物，催化α-1，6糖苷鍵的水解的異淀粉酶（Isoamylase），但不能水解普魯藍。

茉莉酸（jasmonic acid， JA）是植物逆境響應(yīng)的信號分子，在涉及植物對生物性和非生物性逆境脅迫和植物生長發(fā)育過程中的基因調(diào)控上發(fā)揮著重要的作用。JA作為一種逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，具有對非生物脅迫反應(yīng)的功能[4-5]。江月玲和潘瑞熾[6]發(fā)現(xiàn)，不同濃度茉莉酸甲酯處理后，花生幼苗中的淀粉、還原糖和可溶性糖降低。Sarkar[7]發(fā)現(xiàn)，在離體條件下，茉莉酸甲酯與馬鈴薯塊莖中淀粉的積累相關(guān)，脅迫信號可直接影響到淀粉合成酶的活性，并會使淀粉的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[8-10]。然而，相關(guān)分子機制迄今尚不清楚，為進一步探索茉莉酸信號如何影響木薯淀粉的生物合成，本研究選取了木薯DBE和SBE基因，初步研究其受茉莉酸信號的影響情況。于JGI的木薯基因組數(shù)據(jù)庫v6.1中獲得淀粉去分支酶DBE基因序列MeDBE（Manes.05G073400）[11]，和一個淀粉分支酶MeSBE2.1（Manes.09G059400）同時進行分析[12]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MeDBE啟動子區(qū)具有一個茉莉酸響應(yīng)元件；MeSBE2.1具有2個茉莉酸響應(yīng)元件。同時利用木薯懸浮培養(yǎng)細胞對其茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）誘導(dǎo)表達特性分析中也發(fā)現(xiàn)，MeDBE和MeSBE2.1基因可受JA信號調(diào)控，并呈現(xiàn)不同的表達趨勢。本研究旨在通過序列分析和表達分析，確定JA信號能對MeDBE和MeSBE基因表達造成影響，并探索表達變化特性及其機制，為進一步研究逆境信號通過MeDBE和MeSBE在木薯支鏈淀粉合成過程中所發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯品種‘華南八號（‘SC8） 懸浮培養(yǎng)細胞，該細胞通過葉片愈傷組織建立。現(xiàn)保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院熱帶作物品種資源研究所。吸取處于指數(shù)增長期的懸浮培養(yǎng)細胞1 mL于離心管中并置于搖床25℃穩(wěn)定 30 min，分為2組并分別以濃度400 μL/L茉莉酸甲酯（Sigma-Aldrich） 處理，另一組不進行任何處理作為對照。選取0 h未處理和處理后0.5、1、2、4、8 h共6個時間點的樣品，微離心后棄上清液氮速凍-80℃冰箱保存。此步驟重復(fù)3次，獲得3批生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 SBE和DBE基因及啟動子區(qū)序列分析

使用JGI的木薯基因組數(shù)據(jù)庫（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias=Org_Mesculenta_er）獲得MeDBE及MeSBE_2的CDS序列（coding sequence）和DNA序列（genomic sequence）[11]。用Spidey（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/）和NetGene2 V2.4（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/）分析基因結(jié)構(gòu)[13-14]。用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）分析內(nèi)含子相位[15]。用TSSP（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=tssp&group=programs&subgroup=promoter）分析轉(zhuǎn)錄起始位點[16]，用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）綜合分析啟動子區(qū)序列，尋找順勢作用元件位點[17]。

1.2.2 SBE和DBE基因的蛋白分析

使用BLAST工具對預(yù)測的氨基酸序列進行比對分析，用PortParam（http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測其蛋白分子量和等電點[18]，使用InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）預(yù)測結(jié)構(gòu)域[19]。用TMHMM Server在線工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行跨膜區(qū)預(yù)測[20]，使用SubLoc（http：//www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/）和WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）進行蛋白亞細胞定位預(yù)測[21-22]。使用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測信號肽[23]。使用PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預(yù)測二級結(jié)構(gòu)[24]。利用Swiss-model（http：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測三維結(jié)構(gòu)[25]。使用PFP（http：//kiharalab.org/web/pfp.php）預(yù)測蛋白功能[26]。

1.2.3 序列比對和進化樹分析

鑒于Pei等已對木薯SBE基因家族進行了系統(tǒng)進化關(guān)系分析[17]，故本研究只對DBE基因做進化樹分析，選取了與木薯DBE蛋白序列同源性較高的13種其它作物DBE蛋白序列共同進行進化樹分析，它們分別來自：蓖麻（Ricinus communis，XP_002533079.1）、可可（Theobroma cacao，XP_007050677.1）、野生大豆（Glycine soja，KHN19871.1）、馬鈴薯（Solanum tuberosum，NP_001274804.1）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，XP_013449701.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_171830.1）、豌豆（Pisum sativum，AAZ81836.1）、樹棉（Gossypium arboreum，KHG10947.1）、玉米（Zea mays，ACG48178.1）、籽粒莧（Amaranthus cruentus，BAQ22171.1）、小麥（Triticum aestivum，AEV92948.1）、水稻（Oryza sativa，BAD

19754.1）、大麥（Hordeum vulgare，BAD89532.1）。使用MEGA6對其氨基酸進行序列比對，并構(gòu)建鄰接（neighbor-joining，N-J）聚類進化樹，使用bootstrap方法1 000次重復(fù)對進化樹進行驗證。

1.2.4 誘導(dǎo)表達的qRT-PCR檢測

使用Axygen 總RNA小量制備試劑盒（Axygen）提取總RNA；使用PrimeScriptTM Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）合成cDNA；使用SYBR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）實時定量試劑盒（Takara）進行qRT-PCR；以檢測DBE和SBE基因在懸浮培養(yǎng)細胞中受茉莉酸甲酯誘導(dǎo)表達情況，所有的qRT-PCR反應(yīng)均來自同一批反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物，18S rRNA為內(nèi)參。所用目的基因及18s rRNA的引物為Primer premier 5.0軟件設(shè)計，序列如表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，MeDBE基因僅有一個外顯子，無內(nèi)含子存在，而MeSBE2.1具有22個外顯子（圖1）。轉(zhuǎn)錄起始位點預(yù)測顯示：MeDBE基因的轉(zhuǎn)錄起始位點位于起始密碼子上游565 bp處，而MeSBE2.1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點位于起始密碼子上游457 bp處。順勢作用元件位點分析發(fā)現(xiàn)：MeDBE基因啟動子區(qū)域包含2個茉莉酸響應(yīng)元件和1個乙烯響應(yīng)元件ERE，同時，還有可受缺氧環(huán)境誘導(dǎo)的ARE元件及受高溫誘導(dǎo)的HSE和受低溫誘導(dǎo)的LTR；而MeSBE2.1也有2個可受茉莉酸誘導(dǎo)的元件CGTCA-motif和TGACG-motif，此外，還有1個可受脫落酸（abscisic acid，ABA）誘導(dǎo)的ABRE、1個可受赤霉素（gibberellin，GA）誘導(dǎo)的GARE-motif和1個可受水楊酸（salicylic acid，SA）誘導(dǎo)的TCA-element（表2）。

2.2 蛋白分析

MeDBE有883個氨基酸，分子量為99.057 3 ku，理論等電點為5.73。MeSBE2.1有827個氨基酸，分子量為94.851 4 ku，理論等電點為5.72?？缒^(qū)分析顯示，2個蛋白可能無跨膜結(jié)構(gòu)。亞細胞定位預(yù)測表明，2個蛋白都可能定位在葉綠體上。信號肽分析發(fā)現(xiàn)，二者無明顯的信號肽結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，MeDBE有12個螺旋結(jié)構(gòu)和31個折疊結(jié)構(gòu)，MeSBE2.1則有14個螺旋結(jié)構(gòu)和28個折疊結(jié)構(gòu)，可參考其三維預(yù)測結(jié)構(gòu)（圖2）。MeDBE具有DBE典型的保守結(jié)構(gòu)域，如AmyAc_plant_IsoA、E_set_GDE_Isoamylase_N、glgX_debranch等；而MeSBE2.1具有SBE典型的保守結(jié)構(gòu)域，如AmyAc_bac_euk_BE、E_set_GBE_euk_N、Alpha-amylase_C等。蛋白功能預(yù)測顯示：MeDBE和MeSBE2.1基因皆最符合Gene Ontology（GO）中的GO：0003824條目，具有催化酶活性。

2.3 基因進化樹分析

通過序列比對發(fā)現(xiàn)，本實驗中的DBE是以變性支鏈淀粉、糖原和支鏈淀粉類似物為底物的異淀粉酶。從進化樹可以看出，同一科植物的DBE基因基本聚為一類，木薯作為大戟科植物，與同一科的蓖麻處于相同分支（圖3）；豌豆、野生大豆、蒺藜苜蓿3種豆科植物處于同一分支；大麥、小麥和水稻作為禾本科植物同處一分支，且連同莧科的籽粒莧4種作物處于一個獨立的大分支上。較為有趣的是，梧桐科的可可和錦葵科的樹棉處于同一分支；且禾本科的玉米并沒有與其它3 種禾本科作物在另一大分支上；其余作物都單獨分支。另外研究已知，MeSBE2.1和MeSBE2.2與蓖麻等作物SBEII有很高的同源性，可歸于雙子葉SBEII家族[12]。

2.4 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的MeDBE和MeSBE2.1表達水平變化

MeDBE在MeJA處理0.5 h后先上升到本底水平的1.5倍，后持續(xù)下降，到8 h時已降到接近只有本底水平一半（圖4）。而MeSBE2.1在MeJA處理0.5 h后表達量出現(xiàn)了約1.4倍的上升，并在4 h處繼續(xù)上升達到高于3倍后，又在8 h快速下降至最初水平?？梢钥闯?，MeDBE和MeSBE2.1呈現(xiàn)出較大差異，二者在處理0.5 h內(nèi)都呈現(xiàn)出略微上調(diào)，但之后MeDBE表達繼續(xù)上升后又下降，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而MeSBE2.1則呈現(xiàn)出持續(xù)下調(diào)。鑒于前面的啟動子區(qū)分析中，兩基因都有茉莉酸響應(yīng)元件，可能是造成0.5 h之內(nèi)上調(diào)的原因，而后期二者完全不同的表達趨勢，則說明必然有其它的調(diào)控途徑的參與。

3 討論與結(jié)論

有學(xué)者認為，SSS和SBE的相互作用影響了淀粉的分支頻率和鏈長[27]。雖然有觀點認為，SBE和DBE能直接催化淀粉分子中分枝鏈的形成或去除，但這2個酶可能只影響支鏈淀粉的精細結(jié)構(gòu)，而不影響支鏈淀粉占總淀粉的比例[28]。但大量實驗證實，DBE和SBE功能的缺失將嚴重影響淀粉顆粒的形成和支鏈淀粉的比例。如擬南芥中DBE1基因的突變限制了葉內(nèi)淀粉的正常積累，水稻中DBE同工的su1基因突變后會產(chǎn)生畸形淀粉粒[29]。而SBE的缺失則導(dǎo)致如豌豆、玉米、小麥和馬鈴薯植株中極高的直鏈淀粉含量且淀粉顆粒的形態(tài)和組成均有改變[30]。這些結(jié)果都表明，DBE和SBE基因的變化改變了支鏈淀粉的生物合成過程。

MeJA處理后，2個基因各自呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)趨勢，表明雖同為逆境信號物質(zhì)，卻對2個基因有不同的調(diào)控作用。在啟動子區(qū)元件分析時已知，MeDBE和MeSBE2.1都具有茉莉酸響應(yīng)元件，這在一定程度上說明了為何MeJA處理后這2個基因在0.5 h內(nèi)出現(xiàn)了一定程度的上調(diào)；Pei等[12]在研究木薯MeSBE家族基因在不同脅迫條件下的表達特性時，選擇了5、15 min，0.5、1、2 h共5個時間點，其中MeSBE2.1在MeJA處理后的2 h內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢，而本試驗中，MeSBE2.1前期表現(xiàn)類似并且表達水平在4 h達到最高點后開始下降，并在8 h降至本底水平附近。植物在接受外源信號后上調(diào)相關(guān)基因表達時，往往呈現(xiàn)先上升后下降的特點。因為上調(diào)后基因產(chǎn)物開始積累，達到滿足自身需求的數(shù)量或濃度后，上調(diào)停止，開始逐漸降低，這一現(xiàn)象在植物中極為普遍。而MeDBE表達量維持上調(diào)的時間更短，在0.5 h之后便開始下行。說明茉莉酸響應(yīng)元件的作用并不持久，其表達量會被其它調(diào)控方式下調(diào)?？偠灾?，直接施加MeJA無法長時間維持MeDBE和MeSBE2.1長期的高表達，進而調(diào)控木薯支鏈淀粉合成。

另外，MeDBE表達量在0.5 h后的持續(xù)下調(diào)說明，在其上游的茉莉酸響應(yīng)元件發(fā)揮作用引起上調(diào)后，應(yīng)存在其它負調(diào)控機制導(dǎo)致上調(diào)趨勢被扭轉(zhuǎn)，其具體機制還需進一步探索。本研究已知，MeDBE和MeSBE2.1的啟動子區(qū)還有一些各自獨有的其它調(diào)控元件，如赤霉素、脫落酸、水楊酸等響應(yīng)元件。同時，鑒于2個基因的啟動子區(qū)具有大量受逆境信號調(diào)控的元件，說明多種脅迫都可以調(diào)控這2種酶的表達。植物中茉莉酸與其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的激素的交叉相互作用在整個生活周期內(nèi)、不同組織器官間、不同類型細胞中一直存在。不同激素信號的整合共同介導(dǎo)了植物的生長發(fā)育、對環(huán)境的反應(yīng)及衰老死亡。茉莉酸、水楊酸和乙烯之間存在著復(fù)雜的相互作用，既協(xié)作又對抗[31]，如乙烯和茉莉酸具有協(xié)同作用，而水楊酸對茉莉酸有拮抗作用。鑒于MeSBE2.1同時具有茉莉酸響應(yīng)元件和乙烯響應(yīng)元件，而MeDBE則同時具有茉莉酸響應(yīng)元件和水楊酸響應(yīng)元件，2個基因后期表達趨勢的差異可能源于不同信號的綜合作用。鑒于調(diào)控方式的復(fù)雜性，推測2種不同逆境信號施加后可與其它不同激素綜合作用，產(chǎn)生了迥異的調(diào)控模式，最終造成MeDBE和MeSBE2.1基因不同的表達特性。同時，因為DBE和SBE基因可以影響淀粉積累、直鏈淀粉的比例以及淀粉顆粒的形態(tài)和組成[29-30]，推測茉莉酸作為一種逆境信號，如長期施加，可能通過影響這2個基因的表達進而影響到植物淀粉的積累。

作為重要的糧食作物及工業(yè)酒精和淀粉來源，木薯淀粉的合成具有重要的科研意義和經(jīng)濟價值，DBE和SBE作為控制支鏈淀粉合成的重要基因，研究逆境信號如何對其造成影響并探索相關(guān)機制，有助于更好地理解木薯淀粉合成的分子機制，對木薯淀粉品質(zhì)改良具有重要意義，并為培育出品質(zhì)更高的新品種奠定基礎(chǔ)。目前僅知木薯的MeDBE和MeSBE2.1和茉莉酸信號影響后的表達特性，但具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑和調(diào)控機理，仍需進一步探索和驗證。

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