胡真明，張雅君，沈天文，徐根娣，江麗，呂洪飛

（1.浙江省永康市舟山鎮(zhèn)林業(yè)站，浙江金華321308；2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；3.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

鹽脅迫對(duì)貫葉連翹種子萌發(fā)及幼苗POD的影響

胡真明1，3，張雅君2，沈天文3，徐根娣3，江麗3，呂洪飛3

（1.浙江省永康市舟山鎮(zhèn)林業(yè)站，浙江金華321308；2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；3.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

為研究貫葉連翹的抗鹽生理，本研究利用不同濃度的NaCl溶液及相同濃度不同比例、不同鹽分的混合溶液處理貫葉連翹種子進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn).結(jié)果表明:鹽脅迫對(duì)貫葉連翹種子萌發(fā)具有抑制作用，其中Na2CO3的抑制作用最顯著.采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳，研究了貫葉連翹幼苗在不同濃度NaCl溶液處理下不同時(shí)期過氧化物同工酶（POD）的變化情況.結(jié)果表明:不同時(shí)期的貫葉連翹在鹽脅迫下，同工酶酶帶有一定的差異.不同鹽濃度下，同一時(shí)期貫葉連翹的同工酶酶帶也有所差異.結(jié)論:鹽脅迫對(duì)貫葉連翹種子萌發(fā)具有抑制作用，并對(duì)過氧化物同工酶（POD）有一定的影響.

貫葉連翹；鹽脅迫；種子萌發(fā)率；幼苗；過氧化物酶同工酶

貫葉連翹（Hypericum perforatum L.）為藤黃科（Guttiferae）金絲桃屬（Hypericum L.）多年生草本植物，種子黑褐色，花期7—8月，果期9—10月［1］.貫葉連翹除作為傳統(tǒng)的中藥材外，其活性成分在治療抑郁癥、肝炎和艾滋病及抗癌等方面的重要利用前景使其成為近年來世界最暢銷植物藥之一［2］.研究表明，貫葉連翹含有雙蒽酮衍生物、黃烷酮醇類、黃酮及黃醇酮類、香豆素類、酚酸類、間苯三酚衍生物、揮發(fā)油類等物質(zhì).雙蒽酮衍生物中的金絲桃素具有抑制中樞神經(jīng)、抗病毒、增強(qiáng)免疫的功能［3-4］.貫葉連翹在自然條件下主要分布于西北、中南、西南、華東，生長于海拔800～1200 m，喜向陽、濕潤土壤，耐寒［5-6］，除營養(yǎng)繁殖外，它主要靠種子繁殖，而自然條件下其種子萌發(fā)率較底，研究還表明，貫葉連翹是需光性種子，在萌發(fā)初期進(jìn)行光預(yù)處理能有效提高萌發(fā)率［2］.

鹽脅迫是植物種子萌發(fā)和生長發(fā)育過程中經(jīng)常遇到的一種脅迫，特別是在鹽堿化較為嚴(yán)重的區(qū)域.鹽脅迫對(duì)植物造成的主要影響表現(xiàn)在以下兩方面：一是細(xì)胞質(zhì)中金屬離子（主要是Na+）的大量積累，它會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)離子平衡并抑制細(xì)胞內(nèi)生理生化代謝過程，使植物光合作用能力下降，最終因碳饑餓而死亡；二是鹽堿土壤是一個(gè)高滲環(huán)境，它能阻止植物根系吸收水分，從而使植物因“干旱”而死亡.同時(shí)鹽堿土壤pH值較高，這使得植物體與外界環(huán)境酸堿失衡，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞內(nèi)溶物外滲而使植物死亡［7］.

土壤鹽堿化主要是土壤中的Na+、Ca2+、Mg2+3種陽離子和CO32-、HCO3-、Cl-、SO42-4種陰離子組成的鹽分過多所造成的［8］.國內(nèi)外對(duì)星星草、棉花、甜菜等植物的抗鹽性都有所研究，這些研究都促進(jìn)了上述植物在鹽堿地的適應(yīng)性栽培［7］.但至今尚未有研究報(bào)道貫葉連翹種子在鹽脅迫下的萌發(fā)狀況及生理生化變化過程.本文擬通過對(duì)不同濃度和組分的鹽處理下貫葉連翹種子萌發(fā)和生理變化的研究，以期了解貫葉連翹的抗鹽性，為人工栽培貫葉連翹提供科學(xué)依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料

本次實(shí)驗(yàn)所用的貫葉連翹種子采自浙江師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)苗圃.

1.2方法

1.2.1種子發(fā)芽試驗(yàn)

選取顆粒飽滿、顏色深（黑色）、有光澤的貫葉連翹種子，用0.1%HgCl2消毒1 min，蒸餾水清洗4～5次.以不同濃度及不同組合的鹽溶液浸種處理36 h.單鹽處理NaCl溶液濃度分別為50，100，150，200，250，300，350 mmol/L，設(shè)蒸餾水為對(duì)照（CK）.混合鹽處理中用以混合的各鹽濃度均為為5 mg/ml，混合鹽的配方分別為：NaCl（1），Na2SO4（1），Na2CO3（1），NaCl-Na2SO4（3：1）…….

在洗凈、烘干的玻璃培養(yǎng)皿（d=120 mm）中放入濾紙，分別加入上述濃度溶液至濾紙飽和為止.然后擺入相應(yīng)溶液浸種處理過的種子100顆，各3次重復(fù).移入25℃±1℃的人工氣候箱中進(jìn)行萌發(fā).開始10 d 24 h光照，隨后進(jìn)行24 h更替.以胚芽長度達(dá)到種子一半為種子發(fā)芽的判斷標(biāo)準(zhǔn)［9］.萌發(fā)過程中每24 h檢測1次，記錄發(fā)芽種子數(shù)，并補(bǔ)充蒸發(fā)的水分，使各種處理鹽溶液濃度相對(duì)維持不變.

1.2.2幼苗生長過氧化物同工酶試驗(yàn)

讓貫葉連翹種子先在培養(yǎng)皿（d=120 mm）中發(fā)芽，等發(fā)芽后（約7 d），將種子移入沙子（沙子洗凈后用蒸餾水浸泡24 h，然后烘干）中，每天澆蒸餾水，使沙子濕度保持在80%左右，移栽一周后，每周定時(shí)澆1次營養(yǎng)液.當(dāng)幼苗長至10對(duì)葉片時(shí)，開始用鹽溶液處理幼苗，處理NaCl溶液濃度分別為50，100，150，200，250，300，350 mmol/L；設(shè)蒸餾水為對(duì)照（CK）.采用將鹽溶液噴到葉片上的方法，每天定時(shí)定量（每次15 ml）噴1次，處理7 d后，用于POD同工酶測定.

將實(shí)驗(yàn)苗圃中自然條件下生長的貫葉連翹幼苗（幼苗均具有20對(duì)葉片）移栽至實(shí)驗(yàn)室的潔凈沙子中，每天澆蒸餾水，7 d后同樣采用噴鹽溶液的方法，每天定時(shí)定量（每次15 ml）噴1次，處理7 d后，用于POD同工酶測定.處理NaCl溶液濃度同樣分別為50，100，150，200，250，300，350 mmol/L；設(shè)蒸餾水為對(duì)照（CK）.

用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳法［11-12］分離貫葉連翹POD同工酶.分離膠濃度7.5%，濃縮膠濃度3.3%，凝膠厚1.5 mm，濃縮膠電流強(qiáng)度1 mA/cm膠寬，分離膠電流強(qiáng)度2 mA/cm膠寬.Tris-甘氨酸緩沖液為電極緩沖液，pH值8.3.點(diǎn)樣液（樣品上清夜與400 mg/g蔗糖2∶1混合）每槽點(diǎn)樣30 μl，以0.3 mg/g溴酚藍(lán)水溶液作前沿指示劑.電泳約3～4 h，當(dāng)指示劑達(dá)到凝膠底部0.5 cm時(shí)停止.Rf=酶帶遷移距離/溴酚藍(lán)遷移距離.

用抗壞血酸-聯(lián)苯胺染色法.抗壞血酸0.0704 g，聯(lián)苯胺溶液20 ml（2 g聯(lián)苯胺溶于18 ml溫?zé)岜姿?，再加蒸餾水72 ml），0.6%過氧化氫20 ml，蒸餾水60 ml.染色10 min，即可得酶譜，用去離子水沖洗，保存于7%冰醋酸中.凝膠采用THETMAL IMAGING FTI-500掃描記錄，根據(jù)掃描記錄再繪制模式圖.

2　結(jié)果與分析

2.1鹽脅迫對(duì)貫葉連翹種子發(fā)芽率的影響

貫葉連翹種子的發(fā)芽率在不同的鹽濃度和不同的萌發(fā)時(shí)間下，有較大差異（圖1）.從圖1中可以看出，隨著鹽濃度的增加，種子的萌發(fā)曲線越低，表明隨著鹽濃度的增加，發(fā)芽率呈降低趨勢(shì).貫葉連翹種子在CK、50 mmol/L和100 mmol/L鹽濃度下最終萌發(fā)率變化不大，但起始萌發(fā)時(shí)間和萌發(fā)整齊度依次下降，從150 mmol/L鹽濃度開始萌發(fā)率明顯下降，150 mmol/L的最終萌發(fā)率為45%.當(dāng)NaCl溶液的濃度為350 mmol/L時(shí)，發(fā)芽率接近0.貫葉連翹種子在相同濃度的單鹽及相同濃度不同比例、不同鹽分混合液中的發(fā)芽率見表1.其中以Na2CO3的抑制作用最顯著，NaCl-Na2CO3次之，NaCl的抑制作用最小.各種鹽溶液處理下種子的最終萌發(fā)率顯著低于蒸餾水（CK）中的萌發(fā)率（見圖1、表1）.

圖1　單鹽脅迫下貫葉連翹種子的萌發(fā)曲線

表1　混合鹽脅迫對(duì)貫葉連翹種子發(fā)芽率的影響

2.2鹽脅迫對(duì)貫葉連翹幼苗生長過氧化物同工酶的影響

圖2和圖3為鹽脅迫對(duì)貫葉連翹10葉期和20葉期幼苗過氧化物同工酶的凝膠圖.

圖2　鹽脅迫對(duì)貫葉連翹10葉期幼苗過氧化物同工酶的影響

圖3　鹽脅迫對(duì)貫葉連翹20葉期幼苗過氧化物同工酶的影響

使用Image Master TotFelb軟件分析，可獲得鹽脅迫處理的幼苗過氧化物同工酶的模式圖（圖4、圖5）.

從圖2和圖3可看出，20葉期的貫葉連翹植株的過氧化物同工酶的酶帶數(shù)要明顯多于10葉期時(shí)的，而且鹽脅迫對(duì)20葉期植株的影響要大于10葉期的.雖然10葉期貫葉連翹的幼苗都只出現(xiàn)了一條酶帶（見圖4），但是酶的活性卻不同，濃度為100 mmol/L的NaCl溶液對(duì)貫葉連翹幼苗過氧化物同工酶的影響最大，酶活性最低，濃度為300，350 mmol/L時(shí)的貫葉連翹植株P(guān)OD同工酶卻保持著較高的活性.從圖5可看出，各濃度鹽處理對(duì)貫葉連翹幼苗的影響變化較為明顯.第3位的酶帶每個(gè)處理都有；高鹽濃度對(duì)貫葉連翹幼苗的抑制作用更為明顯，用濃度為350 mmol/L的NaCl溶液處理的貫葉連翹幼苗過氧化物同工酶的酶帶數(shù)和酶的活性明顯低于對(duì)照組；而用150 mmol/L濃度處理的貫葉連翹幼苗過氧化物同工酶的3、4位酶帶的活性要高于對(duì)照組，且為最高.

3　結(jié)果和討論

3.1鹽脅迫對(duì)貫葉連翹種子萌發(fā)率的影響

鹽脅迫對(duì)植物整個(gè)生長發(fā)育時(shí)期都有很大的影響，鹽分進(jìn)入細(xì)胞中對(duì)參與代謝的酶活性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致膜透性、光合作用、呼吸作用等生化過程混亂，從而使植物的生長受到抑制，尤其受到抑制的是細(xì)胞的分裂和分化［13］.一般認(rèn)為，中性鹽（NaCl）脅迫的傷害作用主要是通過離子本身的毒性效應(yīng)、高濃度鹽的滲透效應(yīng)和營養(yǎng)效應(yīng)來完成的［14］.

鹽能抑制植物種子萌發(fā)，其抑制程度隨鹽濃度的增大而增大［15］.在NaCl脅迫下，種子萌發(fā)過程中吸水受阻，將會(huì)進(jìn)一步抑制細(xì)胞內(nèi)正常的代謝活動(dòng)，而且細(xì)胞內(nèi)Na+的濃度要高于Cl-的濃度，從而引起種子萌發(fā)受阻［16-17］.閆先喜［18］認(rèn)為大麥在種子吸脹過程中鹽脅迫會(huì)破壞細(xì)胞膜，膜透性增大導(dǎo)致溶液外滲，導(dǎo)致種子萌發(fā)受阻.本研究結(jié)果表明，鹽脅迫處理對(duì)貫葉連翹種子發(fā)芽有很強(qiáng)的抑制作用，隨著鹽濃度的升高，種子的發(fā)芽率減小.混合鹽處理，在一定程度上具有減輕Na2CO3的抑制作用.表現(xiàn)在混合鹽處理的貫葉連翹種子發(fā)芽率均低于同濃度Na2CO3處理結(jié)果.

圖4　鹽脅迫對(duì)貫葉連翹10葉期幼苗過氧化物同工酶的影響的模式圖

圖5　鹽脅迫對(duì)貫葉連翹20葉期幼苗過氧化物同工酶的影響的模式圖

3.2鹽脅迫對(duì)貫葉連翹幼苗過氧化物同工酶的影響

清除過氧化物的POD包括許多種類，其中AsAPOD是植物抗氧化脅迫中起重要作用的酶，類黃酮POD可利用植物體內(nèi)普遍存在的類黃酮物質(zhì)清除H2O2［19］.一般認(rèn)為，在鹽脅迫條件下，植物通過吸收、積累無機(jī)鹽和合成有機(jī)物質(zhì)作用滲透劑進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，以適應(yīng)鹽漬環(huán)境［20］.SOD、POD、CAT等是酶促防御系統(tǒng)保護(hù)酶，它們協(xié)同作用，防御活性氧或其他過氧化自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害.鹽脅迫下植物細(xì)胞內(nèi)Na+、Cl-和其他離子如K+、Ca2+運(yùn)輸?shù)膭?dòng)態(tài)平衡被破壞［21］.細(xì)胞內(nèi)過量的Na+還可以破壞體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除系統(tǒng)之間的動(dòng)態(tài)平衡，啟動(dòng)膜脂過氧化或膜脂脫酯化作用，破壞膜脂和膜蛋白［22］.

POD同工酶是一種對(duì)外界不良環(huán)境條件反應(yīng)十分敏感的酶.Dash［23］在研究鷹嘴豆時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著NaCl濃度的增加POD的活性會(huì)降低，環(huán)境中高濃度的鹽可以誘導(dǎo)或抑制某些同工酶的產(chǎn)生［24］，一些學(xué)者把植物的這種特性稱作“適應(yīng)性”反應(yīng).植物在處于諸如高鹽等不良生活環(huán)境時(shí)，通過誘導(dǎo)或抑制某些同工酶的產(chǎn)生來適應(yīng)環(huán)境而使其得以生存.大量的脅迫處理試驗(yàn)和在分子水平上的基因調(diào)控研究證據(jù)已經(jīng)證實(shí)大部分的POD合成屬于誘導(dǎo)表達(dá)型［25］.本研究中也觀察到這一現(xiàn)象，從兩張酶譜圖中，當(dāng)貫葉連翹植株為10葉期時(shí)，低濃度鹽可以抑制POD的活性，而高濃度鹽卻增強(qiáng)POD的活性.可以推測：在高鹽濃度下，貫葉連翹體內(nèi)的一些調(diào)控基因啟動(dòng)，進(jìn)行了表達(dá)，使得保護(hù)系統(tǒng)抗逆能力有所增強(qiáng)，表現(xiàn)在300 mol/L濃度處理時(shí)，POD的活性比對(duì)照組還要高.反之，當(dāng)貫葉連翹植株為20葉期時(shí)，低濃度鹽增強(qiáng)POD的活性，高濃度鹽卻抑制了POD的活性，據(jù)此推測，20葉期幼苗要比10葉期幼苗對(duì)鹽更敏感.

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The Effect ofsaltstress onseed Germination andseedling Growth of Hypericum perforatum L.

HU Zhenming1，3，ZHANG Yajun2，SHEN Tianwen3，XU Gendi3，JIANG Li3，Lü Hongfei3
（1.Zhoushan Town Forestrystation of Yongkang City，Zhejiang Province，Jinhua 321308；2.School of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500；3.College of Chemistry and Lifesciences，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China）

In order to understand thesalt resistance of Hypericum perforatum L.，and to prove whether it issuitable forsaline alkalisoil cultivation，theseed was treated by different concentration NaClsolution or mixedsolution ofsame concentration with differentsalts.The resultshowed thatsaltstress inhibited H.perforatumseed germination.The effect of Na2CO3 inhibition was the mostsignificant in allsalt treatments.The effect ofsaltstress on isoenzymes of POD inseeding growth of H.perforatum was analyzed through polyacrylamide gel electrophoresis.The resultsshowed that there existsome differences in the isoenzymatic patterns of POD in differentstage.Andsome differences in the isoenzymatic patterns of POD also occurred in differentsalt concentrations on thesamestage.Therefore，a conclusion was reached thatsaltstress inhibited H.perforatumseed germination and effect on Peroxidase isoenzyme（POD）activities of theseedling.

Hypericum perforatum L.；salt-stress；seed germination；seedling；POD

Q945.78

A

1008-2794（2015）04-0120-05

2016-04-12

江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“規(guī)?；鷳B(tài)雞在循環(huán)經(jīng)濟(jì)體系中的應(yīng)用及推廣示范”（BE2012416）

呂洪飛，教授，博士，研究方向：植物學(xué)，E-mail：luhongfei0164@163.com.