張燕萍，鄭紅梅，邵芳，韓曉磊，徐建榮，顧志良

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；

2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院腫瘤研究所，江蘇常州213003）

沙塘鱧線粒體基因組全序列的測(cè)定和分析

張燕萍1，鄭紅梅1，邵芳2，韓曉磊1，徐建榮1，顧志良1

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；

2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院腫瘤研究所，江蘇常州213003）

為揭示沙塘鱧（Odontobutis）線粒體基因組特征，采用PCR擴(kuò)增和測(cè)序的方法獲得沙塘鱧（Odontobutis）線粒體基因組全序列.通過生物信息學(xué)軟件（tRNAscan-SE、RNAfold）定位沙塘鱧線粒體基因組基因結(jié)構(gòu)及預(yù)測(cè)tRNA和rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu).沙塘鱧線粒體基因組全長(zhǎng)16 930 bp，結(jié)構(gòu)組成和其他硬骨魚基本一致，包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，22個(gè)tRNA，2個(gè)rRNA和1個(gè)D-loop區(qū). 13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，除了CO1是以GTG作為起始密碼子，ND6以TTA作為起始密碼子以外，其余都以ATG起始.沙塘鱧線粒體基因的終止密碼子有3種類型，分別為完全密碼子TAA、不完全密碼子TA和T.除了tRNASer（AGN）和tRNACys外，其余20個(gè)tRNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)都是典型的三葉草結(jié)構(gòu).識(shí)別了沙塘鱧終止序列區(qū)、中央保守區(qū)D、E、F和保守序列區(qū)CSB-1、CSB-2和CSB-3.比較沙塘鱧cytb基因序列與其他物種同源性發(fā)現(xiàn)，沙塘鱧與平頭沙塘鱧的同源性最高（87.03%），河川沙塘鱧次之（83.57%），與人的同源性最低（70.64%）.該研究結(jié)果可為深入探討沙塘鱧屬及塘鱧科魚類的系統(tǒng)分類提供依據(jù)，更真實(shí)地反映了沙塘鱧的分類地位和進(jìn)化關(guān)系.

沙塘鱧；線粒體DNA序列；D-Loop區(qū)；系統(tǒng)進(jìn)化

魚類是脊椎動(dòng)物中最原始而在種屬數(shù)量上又最占優(yōu)勢(shì)的類群，其起源復(fù)雜，分布廣泛，擁有豐富的遺傳多樣性［1］.在分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于魚類分類之前，人們主要從魚類化石資源、形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特征等方面探求魚類的遺傳進(jìn)化歷程，但由于多種客觀條件限制，使得傳統(tǒng)的分類學(xué)方法難以徹底解決魚類遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化等問題.近年來，隨著魚類線粒體DNA（mitohondrial DNA，mtDNA）研究技術(shù)的不斷發(fā)展成熟，使其成為魚類學(xué)相關(guān)研究的重要標(biāo)記，并在魚類進(jìn)化遺傳學(xué)、種群遺傳結(jié)構(gòu)、分子生態(tài)學(xué)和保護(hù)生物學(xué)等方面取得了很多有意義的成果［2］.mtDNA同其他脊椎動(dòng)物一樣，是細(xì)胞核外具自主復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯能力的共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA.與核DNA相比，魚類mtDNA具有分子較小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快、遺傳相對(duì)獨(dú)立性和母系遺傳等特點(diǎn)，是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的復(fù)制單位［3-4］.

目前已經(jīng)報(bào)道了上百種魚類線粒體DNA的全序列，發(fā)現(xiàn)魚類mtDNA分子大小在15～19 kbp之間，主要包括37個(gè)編碼基因13個(gè)蛋白基因、2個(gè)rRNA基因、22個(gè)tRNA編碼基因）、1個(gè)負(fù)責(zé)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起始的控制區(qū)（D-loop）和1個(gè)輕鏈復(fù)制起始區(qū)［5］.蛋白質(zhì)和tRNA基因的進(jìn)化速度適中，適合于從種間到種內(nèi)遺傳差異分析，作為線粒體上唯一的結(jié)構(gòu)和功能被了解得較為清楚的蛋白質(zhì)編碼基因，Cytb基因容易用一些通用引物擴(kuò)增和測(cè)序，因而Cytb基因被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)進(jìn)化研究［6］.

沙塘鱧屬鱸形目（Perciformes）、蝦虎魚亞目（Gobioidei）塘鱧科（Eleotridae）、沙塘鱧屬（Eleotris），是分布于我國(guó)長(zhǎng)江中下游以及錢塘江、閩江水系的中小型溪流經(jīng)濟(jì)魚類.沙塘鱧肉質(zhì)鮮美，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，由于自然環(huán)境的改變，其數(shù)量急劇衰減.目前對(duì)沙塘鱧的養(yǎng)殖技術(shù)研究廣泛，但其基因水平的研究甚少，基因庫中線粒體基因序列公布很少.本實(shí)驗(yàn)采用PCR擴(kuò)增和測(cè)序的方法，獲得沙塘鱧線粒體DNA的全序列，確定了沙塘鱧線粒體基因組編碼的所有基因，還分析了沙塘鱧線粒體基因組的堿基組成、基因排列和密碼子使用情況.本研究擴(kuò)充了魚類線粒體基因組數(shù)據(jù)庫，為其系統(tǒng)分類提供分子水平證據(jù)，同時(shí)為沙塘鱧群體遺傳學(xué)和生物資源的合理利用等提供有價(jià)值的資料.

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料和總DNA的提取

沙塘鱧由蘇州市長(zhǎng)江特色水產(chǎn)繁殖工程中心提供，活魚宰殺后，采集肌肉組織放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?采用經(jīng)典的酚-氯仿法提取沙塘鱧肌肉總DNA，用NanoDrop2000和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度及完整性，于-20℃保存?zhèn)溆?

1.2引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增、測(cè)序

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布塘鱧科線粒體部分序列以及其他相關(guān)物種的同源性保守序列設(shè)計(jì)引物.引物由上海生工生物工程有限公司合成（表1）.PCR反應(yīng)體系為10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，DNA模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Taq酶0.2 μL，然后加去離子水17.3 μL至終體積25 μL.PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存.另外，依據(jù)引物的長(zhǎng)短對(duì)退火溫度、延伸時(shí)間和循環(huán)次數(shù)做了相應(yīng)的調(diào)整.將所有PCR產(chǎn)物均用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化.將PCR得到的回收產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，測(cè)序均由上海生工生物工程有限公司完成.

表1　PCR擴(kuò)增引物序列

1.3序列拼接、注釋和分析

使用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)、拼接，再經(jīng)測(cè)序峰圖結(jié)果分析軟件Chromas仔細(xì)校正后，得到沙塘鱧線粒體全序列.使用Gene Runner軟件統(tǒng)計(jì)全序列的各堿基百分比，蛋白質(zhì)編碼基因的堿基使用情況.使用軟件tRNAscan-SE（http：//lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/）定位tRNA基因、蛋白質(zhì)編碼基因、rRNA基因和D-loop區(qū)，以確定沙塘鱧線粒體基因組的基因結(jié)構(gòu).用RNAfold軟件（http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/ RNAfold.cgi）預(yù)測(cè)rRNA基因的空間二級(jí)結(jié)構(gòu)和自由能值.

1.4進(jìn)化分析

將獲得的沙塘鱧線粒體Cytb基因DNA序列與GenBank已經(jīng)公布的中華烏塘鱧等17個(gè)物種線粒體全基因組的Cytb基因序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建分子進(jìn)化樹.

2　結(jié)果與分析

2.1線粒體基因組結(jié)構(gòu)

沙塘鱧線粒體基因組全長(zhǎng)為16930 bp，共編碼37個(gè)基因包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，22個(gè)tRNA基因，2個(gè)rRNA基因及一個(gè)介于tRNAPro和 tRNAPhe之間的D-loop區(qū)，沙塘鱧線粒體基因組結(jié)構(gòu)如圖1所示.這37個(gè)編碼基因在沙塘鱧線粒體基因組中的分布呈不均一性，L鏈上編碼9個(gè)基因，包括8個(gè)tRNA基因（tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer（UCN）、tRNAGlu、tRNAPro）和一個(gè)編碼蛋白的基因ND6；其余的28個(gè)基因則由H鏈編碼.

圖1　沙塘鱧線粒體基因組結(jié)構(gòu)組成

沙塘鱧線粒體基因組有15處基因間隔區(qū)域，長(zhǎng)度范圍在1～336 bp之間，共518 bp，最大的基因間隔出現(xiàn)在tRNALeu（CUN）和tRNAHis這兩個(gè)基因之間.基因組中還存在5處重疊，長(zhǎng)度范圍在1～7 bp之間，共計(jì)20 bp，最大基因重疊出現(xiàn)在ATPase8和ATPase6及ND4L和ND4之間.既沒重疊，也沒有間隔的緊密排列基因?qū)灿?jì)18處.沙塘鱧線粒體基因各個(gè)基因大小及分布見表2.

加下劃線“_”的基因在L鏈上編碼；tRNA基因用氨基酸單字母表示；L1、L2和S1、S2分別表示tRNALeu（CUN）、tRNALeu（UUR）和tRNASer（AGN）、tRNASer（UCN）

表2　沙塘鱧線粒體基因組的基因組成

2.2線粒體堿基組成

沙塘鱧線粒體基因組堿基百分含量見表3.蛋白編碼基因4種堿基百分含量與整個(gè)線粒體基因組最為相似.在不同密碼子堿基含量的問題上，密碼子第一位點(diǎn)的4種堿基含量較為接近，沒有堿基使用偏好；第二位點(diǎn)T的含量最高，為36.5%，G含量最低，為12.5%，顯示出T偏倚和反G偏倚；第三位點(diǎn)反G偏倚最明顯，平均含量?jī)H為9.2%.

2.3蛋白編碼基因及密碼子使用

沙塘鱧的13個(gè)蛋白編碼基因總長(zhǎng)度為11 419 bp，占線粒體全長(zhǎng)的67.4%.13個(gè)蛋白編碼在堿基組成上都有明顯的反G偏倚.所用的起始密碼子除CO1基因?yàn)镚TG，ND6基因?yàn)門TA外，其余均為ATG.常用的終止密碼子有3種類型，包括完全密碼子TAA和不完全密碼子TA以及T，如：CO1、ATPase8、ND4L、ND5是以TAA為終止密碼子；ND2、ATPase6、CO3是以TA為終止密碼子，其余都是以T終止的.

2.4tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

沙塘鱧線粒體基因組有22個(gè)tRNA基因，全長(zhǎng)1 565 bp，單個(gè)基因長(zhǎng)度為67～81 bp，其中14個(gè)由L鏈編碼，8個(gè)由H鏈編碼.通過tRNAscan-SE軟件預(yù)測(cè)并確定了沙塘鱧線粒體22個(gè)tRNA基因的位置及二級(jí)結(jié)構(gòu).除tRNASer（AGN）和tRNACys基因的結(jié)構(gòu)比較特殊外，其余均能形成典型的三葉草結(jié)構(gòu).其中氨基酸臂最保守，長(zhǎng)度都為7 bp，TψC臂和反密碼子臂為4～5 bp，DHU臂為2～4 bp.TψC環(huán)為7 bp（除Lys為9 bp，Phe為8 bp），反密碼子環(huán)為7 bp（除Thr、Val為9 bp），而DHU環(huán)的堿基數(shù)差別很大，在4～11 bp之間.沙塘鱧的20個(gè)tRNA基因中共有16對(duì)不匹配的堿基配對(duì).其中位于氨基酸臂上的有10對(duì)，分別為tRNAAsn、tRNAAsp、tRNAHis、tRNAIle、tRNALeu（CUN）、tRNAPhe、tRNASer（UCN）、tRNAThr、tRNATrp、tRNAVal；4對(duì)在TψC臂上，分別為tRNAHis、tRNAMet（有2對(duì)）、tRNATrp；2對(duì)在反密碼子臂上，分別為tRNAAla、tRNAVal.其中6個(gè)AC錯(cuò)配，3個(gè)UC錯(cuò)配，3個(gè)UU錯(cuò)配，2個(gè)AA錯(cuò)配，2個(gè) CC錯(cuò)配.

2.5rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

沙塘鱧rRNA基因由12S rRNA和16S rRNA兩種組成，分別位于tRNAPhe和tRNAVal、tRNAVal和tRNALeu（UUR）之間，其長(zhǎng)度分別為951 bp和1 654 bp.rRNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)很保守，形成多個(gè)大小不一的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其進(jìn)化速度在線粒體各基因組分中最慢.通過RNAfold在線軟件預(yù)測(cè)出了沙塘鱧兩種rRNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中，12S rRNA基因的自由能值為-234.90 kcal/ mol，16S rRNA基因的自由能值為-422.30 kcal/mol.一般而言，自由能值越低則代表其分子結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，表明沙塘鱧12S rRNA基因比16S rRNA基因更保守.

2.6D-loop控制區(qū)

沙塘鱧D-loop控制區(qū)長(zhǎng)度為844 bp.A+ T含量（64.34%）顯著高于基因組全序列的A+ T含量（55.5%）.這與其他魚類A、T含量高，G、C含量低的特點(diǎn)很一致.沙塘鱧線粒體D-loop區(qū)分為終止序列區(qū)（termination associatedsequence，TAS）、中央保守區(qū)（central conserved dormain，CD）和保守序列區(qū)（conservedsequence block，CSB）3個(gè)區(qū)段.以CSB-F和CSB-1的起點(diǎn)分別作為終止序列區(qū)，中央保守區(qū)和保守序列區(qū)的分界線見圖2.

接表1

表3　沙塘鱧線粒體不同基因的堿基組成

終止區(qū)是控制區(qū)變異最大的區(qū)域，沙塘鱧的終止結(jié)合序列區(qū)長(zhǎng)度為280 bp，在此區(qū)段中識(shí)別了2個(gè)終止相關(guān)序列（TAS），其中包括核心序列TACAT及其反向互補(bǔ)序列ATGTA，其二級(jí)結(jié)構(gòu)可形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這一現(xiàn)象在許多類群中存在.經(jīng)比對(duì)得到沙塘鱧的ETAS序列為：TACAT-TATGTATTA-CCATATAT-ATATAACCATA（“-”表示發(fā)生變異的堿基，即轉(zhuǎn)換、顛換或缺失）.

沙塘鱧中央保守區(qū)為355 bp，分為CSB-F、E、D.其中CSB-F是分開終止序列區(qū)和中央保守區(qū)的標(biāo)志，關(guān)鍵形式為：ATGCAGATAAG-A-ACATTC，但存在變異.緊跟其后是CSB-E，關(guān)鍵序列為：AGGGACAA-TTGTGGGGGTTTCAC，含有GTGGG-box .CSB-D，序列為：GTGAACTATTCCTGGCATTTGGTTCCTATTTCAGGGCCATT-，CSB-D和CSB-E保守性都要高于CSB-F.

沙塘鱧的保守序列區(qū)總長(zhǎng)為209 bp，包括CSB-1、CSB-2和CSB-3.研究表明CSB-1與mtDNA的復(fù)制起始相關(guān)，3段CSB序列都被確定，其中CSB-1的關(guān)鍵序列為：-TTGCATAACTGATATCAAGAGCATA-；CSB-2的關(guān)鍵序列為：AAACCCCCCTACCCCCCACTC；CSB-3的關(guān)鍵序列為：TCCTGAAACCCCCCGGAAACAGGAA.

圖2　沙塘鱧線粒體基因組控制區(qū)序列與特征

中央保守序列（CSB-F，CSB-E，CSB-D）、保守序列（CSB-1，CSB-2，CSB-3）用下劃線表示；終止相關(guān)序列（TAS）用陰影表示，它的反向互補(bǔ)序列（ATGTA）用雙下劃線表示.

2.7基于Cytb基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.7.1沙塘鱧與其他物種的同源性

利用DNAMAN軟件，將沙塘鱧Cytb基因序列分別與其他參照物種的Cytb基因進(jìn)行比對(duì)，得到沙塘鱧與其他物種的同源性系數(shù)（見表4）.可見沙塘鱧與平頭沙塘鱧的同源性最高（87.03%），河川沙塘鱧次之（83.57%），與人的同源性最低（70.64%）.

表4　沙塘鱧與對(duì)照物種的同源性系數(shù)

2.7.2基于Cytb基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

利用MEGA 4.1軟件構(gòu)建表4中17個(gè)物種的分子進(jìn)化樹（圖3）.結(jié)果表明，所有硬骨魚形成一個(gè)大的分支，哺乳類形成另一個(gè)分支.硬骨魚又分為4個(gè)獨(dú)立的小分支，沙塘鱧首先與平頭沙塘鱧聚成一支，接著與河川沙塘鱧、暗色沙塘鱧聚類，這4種魚類都屬于鱸形目沙塘鱧科沙塘鱧屬，接著這4種沙塘鱧屬魚類與葛氏鱸塘鱧（鱸塘鱧屬）聚類，再與小黃黝魚（小黃黝魚屬）聚類，這6種沙塘鱧科魚類形成獨(dú)立的分支；黑塘鱧、彩塘鱧、中華烏塘鱧、巧塘鱧和脂塘鱧則單獨(dú)形成另一個(gè)小的分支，這5種魚類同屬于鱸形目的塘鱧科；鱸形目鯖科魚類形成另一個(gè)分支；而屬鰈形目的石鰈和屬鲉形目的松江鱸則形成其他分支.結(jié)果從另一個(gè)方面證實(shí)沙塘鱧在魚類分類系統(tǒng)中的位置，此外還說明鱸形目不同科的魚類親緣關(guān)系有遠(yuǎn)近之分，沙塘鱧科魚類與鯖科魚類親緣關(guān)系較遠(yuǎn).這與動(dòng)物形態(tài)學(xué)分類基本一致.

圖3　基于沙塘鱧cytb基因序列構(gòu)建的NJ法系統(tǒng)樹

3　討論與結(jié)論

3.1沙塘鱧線粒體基因組分析

本研究測(cè)定了沙塘鱧的線粒體基因組全序列，全長(zhǎng)為16 930 bp，共編碼37個(gè)基因.沙塘鱧線粒體基因組的基因排列順序與已公布的其他魚類線粒體基因組的基因排列順序完全一致，各基因長(zhǎng)度也大致相等［4，7-8］，其mtDNA的分子大小在種間存在差異主要是由于串聯(lián)重復(fù)序列的存在以及長(zhǎng)度不等的堿基插入和缺失，如沙塘鱧在基因tRNATrp和tRNAAla之間間隔6 bp，巖原鯉（Procypris rabaudi）只有2 bp的重復(fù)［9］.沙塘鱧線粒體基因組A、T、C、G這4種堿基的含量都非常接近，且A+T含量高于C+G含量，這與已報(bào)道的絕大多數(shù)魚類線粒體基因組堿基含量分布一致；蛋白編碼基因4種堿基百分含量與整個(gè)線粒體基因組最為相似［8，10-11］.13個(gè)蛋白編碼基因分3種類型終止密碼子，除了CO1、ATPase8、ND4L、ND5是以完全密碼子TAA為終止密碼子外，其余都是以不完全終止密碼子TA或T終止翻譯.這種以不完整的密碼子終止翻譯的現(xiàn)象在后生動(dòng)物的線粒體基因組中較為常見，這些不完整的終止密碼子可以通過轉(zhuǎn)錄為mRNA后由3′端的多聚腺苷酸化作用將其補(bǔ)全變成完整的終止密碼子（TAA）［12］.

沙塘鱧的22種tRNA除了tRNACys以及tRNASer（AGN）DHU臂發(fā)生缺失外，其余20種tRNA均呈典型的三葉草結(jié)構(gòu).沙塘鱧12S rRNA基因比16S rRNA基因自由能值低，說明12S rRNA比16S rRNA更保守，這和大多數(shù)魚類的研究結(jié)果一致.魚類二級(jí)結(jié)構(gòu)總體差異較大，沒有明顯規(guī)律，因此不利于對(duì)物種間的rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)做詳細(xì)比較［13］.

線粒體DNA控制區(qū)又稱D-環(huán)區(qū)（D-loop），位于tRNAPro和tRNAPhe基因之間，是整個(gè)線粒體DNA序列中長(zhǎng)度變異最大的區(qū)域，也是線粒體基因組上進(jìn)化最快的部分.魚類線粒體D-loop區(qū)分為H-鏈復(fù)制起始區(qū)OH、TAS區(qū)、CD、CSB區(qū)、L-鏈啟動(dòng)子和H-鏈啟動(dòng)子.D-loop區(qū)是mtDNA中替換率最高和堿基數(shù)量最易發(fā)生變化的區(qū)域.目前識(shí)別了D-loop的中央保守區(qū)的保守序列B、C、D、E、F .Randi等發(fā)現(xiàn)保守序列C、D、E、F在鳥類中存在［14］.Lee等對(duì)眾多魚類序列進(jìn)行比較時(shí)，僅識(shí)別了CSB-D的存在［15］，隨后相繼有人識(shí)別出了魚類的CSB-E和CSB-F［16］.本實(shí)驗(yàn)識(shí)別出了沙塘鱧控制區(qū)的終止序列區(qū)，這是控制區(qū)最易發(fā)生變異的區(qū)域，還識(shí)別了中央保守區(qū)序列CSB-F、CSB-E、CSB-D和保守區(qū)序列CSB-1、CSB-2、CSB-3并給出關(guān)鍵序列.然而金逍逍等人發(fā)現(xiàn)包括刺蓋塘鱧、中華烏塘鱧在內(nèi)的26種蝦虎魚存在不同的缺失現(xiàn)象，未能識(shí)別到CSB-F［16］.多數(shù)魚類識(shí)別到CBS-E的核心序列（GTGGG），CSB-D序列則相對(duì)較為保守，這可能與其參與線粒體代謝及重鏈復(fù)制有關(guān)聯(lián)［15］.

3.2沙塘鱧進(jìn)化分析

沙塘鱧科魚類隸屬鱸形目蝦虎魚亞目，而蝦虎魚類是鱸形目魚類中最大的一個(gè)類群.塘鱧科產(chǎn)于中國(guó)有5個(gè)屬，其中包括沙塘鱧屬（Odontobutis）和鱸塘鱧屬（Perccottus）等，這兩個(gè)屬常見的經(jīng)濟(jì)種類有河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）、鴨綠沙塘鱧（Odontobutis yaluensis）、中華沙塘鱧（Odontobutissinensis）、葛氏鱸塘鱧（Perccottus glenii）等［17］.伍漢霖等從形態(tài)學(xué)上將中國(guó)沙塘鱧屬魚類分為河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧、中華沙塘鱧、海豐沙塘鱧（Odontobutis haifengensis）4個(gè)種［18］.但由于蝦虎魚類形態(tài)上的多樣性以及不同程度的退化與特化，導(dǎo)致單純依據(jù)形態(tài)學(xué)對(duì)其鑒定顯得較為困難，很多分類結(jié)果一直存在爭(zhēng)議［19-20］.

鑒于以上種種原因，線粒體基因作為分子標(biāo)記應(yīng)用到魚類的物種鑒別、分類及系統(tǒng)發(fā)育等領(lǐng)域，相比于形態(tài)學(xué)研究，分子生物學(xué)分析方法能很好地克服魚類形態(tài)特征多樣性、特性特征不明顯等困難，能更真實(shí)有效地反映其分類地位和進(jìn)化關(guān)系.謝楠等［21］基于cytb基因序列分析了蝦虎魚亞目9個(gè)屬的進(jìn)化關(guān)系，塘鱧屬與黃黝魚屬2個(gè)屬構(gòu)成1支；沙塘鱧屬與鱸塘鱧屬2個(gè)屬構(gòu)成1支；烏塘鱧屬、嵴塘鱧屬、尖塘鱧屬、頭孔塘鱧屬4個(gè)屬構(gòu)成1支；鰭塘鱧屬單獨(dú)構(gòu)成1支，未能在亞科水平上聚類.同樣我們基于沙塘鱧的cytb基因序列構(gòu)建了類似的系統(tǒng)進(jìn)化樹，沙塘鱧屬4種魚類聚類，接著與葛氏鱸塘鱧（鱸塘鱧屬）聚類，再與小黃黝魚（小黃黝魚屬）聚類；塘鱧科同樣也發(fā)生聚類，這一結(jié)果能夠在科及屬水平上達(dá)到聚類.侯新遠(yuǎn)等［22］基于線粒體D-loop序列研究我國(guó)5種蝦虎魚類的進(jìn)化關(guān)系發(fā)現(xiàn)，河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧、中華沙塘鱧、平頭沙塘鱧聚為一大支，刺蓋塘鱧、黑體塘鱧、褐塘鱧、尖頭塘鱧、溪鱧、葛氏鱸塘鱧聚為另一支，這與我們得出葛氏鱸塘鱧與沙塘鱧科魚類聚類卻未與塘鱧科魚類聚類的結(jié)果不同，這說明選擇不同的基因在系統(tǒng)發(fā)育研究中存在差異.該研究結(jié)果可為深入探討沙塘鱧屬及塘鱧科魚類的系統(tǒng)分類提供依據(jù).

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Sequencing and Analysis of the Complete Mitochondrial Genome of Odontobutis

ZHANG Yanping1，ZHENG Hongmei1，SHAO Fang2，HAN Xiaolei1，XU Jianrong1，GU Zhiliang1
（1.School of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500；2.Cancer Institute，Changzhousecond People's Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Changzhou 213003，China）

The entire mitochondrial genome of Odontobutis was obtained by PCR based on conservative primers. It wasshowed that the mitochondrial genomesequence was 16，930 bp long，including 13 protein genes，22 tRNA genes，2 rRNA genes and a noncoding region.The base composition of the genome was A 30.0%，C 28.9%，G 15.6%and T 25.5%.Protein-coding genes in Odontobutis mitochondrial genome used ATG as the initiation codons with the exception of CO1 which used GTG and ND6 used TAA.It was found thatstop codons in Odontobutis included TAA，uncomplement codons TA and T.Most tRNA genes could form typicalsecondarystructures except tRNASer（AGN）and tRNACys.In addition，the D-loop region of Odontobutis mtDNA was 844 bp in length.Compared with the mitochondrial DNA control region from otherspecies，the extended terminal associatedsequences，central conservedsequence blocks，conservedsequence blocks and putative promoters of the mitochondrial DNA control region in Odontobutis were observed.Sequence alignment of Cyt b genes of Odontobutis and other 10species from GenBankshowed that Odontobutis obscara and Odontobutis had the closest genetic relationship in the 11species.A phylogenetic tree constructed using the Neighbor-Joining method indicated that the relationship amongsleeper Branch was close，the next weresculpin Branch andsciaenidae，and Cyprinid was distantly related.

Odontobutis；mitochondrial DNAsequence；D-Loop region；phylogeny

Q493；Q75

A

1008-2794（2015）04-0097-05

2016-04-12

教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金（第42批）“鳡魚和赤眼鱒線粒體基因組及進(jìn)化關(guān)系研究”；蘇州市科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)項(xiàng)目“農(nóng)業(yè)動(dòng)物（畜禽、水產(chǎn)）種質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”（SZZD201001）

顧志良，教授，博士，研究方向：動(dòng)物分子遺傳學(xué)，E-mail:zhilianggu88@hotmail.com.