劉昕，劉麗，趙亮，王祎玲

（山西師范大學生命科學學院，山西臨汾041000）

七筋姑不同倍型的克隆構型研究

劉昕，劉麗，趙亮，王祎玲

（山西師范大學生命科學學院，山西臨汾041000）

七筋姑隸屬百合科七筋姑屬，多年生草本，具有二倍體和四倍體兩種細胞型，可通過根芽的方式進行無性繁殖.本文采用SSR分子標記對其克隆結構進行研究，結果表明:二倍體種群與四倍體種群全為多克隆種群，沒有發(fā)現單克隆種群，克隆構型均為混合型.兩種倍型152個七筋姑個體中出現了117個基因型，其中二倍體包含29.5個基因型，四倍體包含29個基因型，平均每個種群有29.25個克隆.物種水平上Simpson多樣性指數（D）為0.992，基因型比率（PD）為0.700，表現出克隆多樣性.二倍體克隆多樣性（D=0.978，PD=0.846）略高于四倍體（D=0.974，PD=0.805）.相關性表明環(huán)境因子與克隆多樣性無顯著相關.多基因型起源、兼性有性生殖和實生幼苗的更新可能是七筋姑不同倍型基因型豐富的來源.

七筋姑；克隆結構；細胞型

1　引言

繁殖是一切生物產生后代延續(xù)種族的最基本方式，它是種群形成、進化的基礎，更是群落和生態(tài)系統(tǒng)演替的根本［1-2］.在自然條件下，大多數植物都具有兩種繁殖方式：無性繁殖和有性繁殖.無性繁殖是一種非常特殊的繁殖模式［3］，直接導致子代的基因與親本一致，這個模式對具有克隆繁殖的物種遺傳多樣性和遺傳結構有很大的干擾［2］.克隆植物一個種群的遺傳多樣性和遺傳結構不能通過對所有植株統(tǒng)計獲取，而是由基株數目所定，基株是一個種群內由一個合子演化而來的有一致基因型植株的總稱，基株內每個植株稱為分株，基株也被看作是一個遺傳獨立體.克隆構型是克隆植物在進化過程中形成的對環(huán)境異質性的利用能力，具體指具有無性繁殖的植物種群內基株和眾多分株在空間位置上的分布規(guī)律，分為密集型、游離型和一些中間類型的混合型.密集型，分株間距離很短；游離型，基株擴散距離較大；混合型則是密集型和游離型鑲嵌構成一種過渡的模式［4］.研究克隆構型和多樣性能判斷物種的繁殖和進化程度，種群的規(guī)模、走勢及對環(huán)境的適應性，可為保護物種多樣性提供理論依據［2，4-5］.

七筋姑（Clintonia udensis Trautv.et Mey.）是百合科（Liliaceae）黃精族（Polygonateae）七筋姑屬（Clintonia Raf.）植物.多年生草本，根狀莖；花白色，少有淡藍色；果實球形至矩圓形.常生長在海拔1 600～4 000 m的高山陰坡樹林下［6-8］.有二倍體和四倍體兩種細胞型，二倍體分布從云南一直延伸到俄羅斯的遠東地區(qū)，四倍體在東亞除分布于喜馬拉雅地區(qū)和日本以外，在陜西化龍山和湖北神農架一帶有較為狹小的分布.兩種細胞型的個體只在種子大小上存在差異：二倍體種子較小，約3 mm×1.5 mm；四倍體種子較大，約4.5mm×2.2 mm［7］.野外調查時發(fā)現，七筋姑具有出芽生殖情況，具有克隆生長.本文將采用SSR分子標記對七筋姑不同倍型種群進行克隆多樣性、克隆結構研究，旨在了解七筋姑不同倍型克隆大小、空間格局，為揭示七筋姑不同倍型的克隆結構、生態(tài)適應提供基礎資料.

2　材料與方法

2.1材料采集

于2013年7月分別采自于陜西、湖北境內四個地方：陜西化龍山北坡（32‘06 N，109'41 E）、陜西化龍山南坡（32‘01 N，109'35 E）、湖北金猴嶺（31‘47 N，110'30 E）、湖北木林子（30‘03 N，110'20 E），其中化龍山北坡和木林子兩個種群細胞型為四倍體；化龍山南坡和金猴嶺兩個種群細胞型為二倍體.

采樣策略：合理選取生長比較好的區(qū)域作取材樣方，共取樣方4個.采集新鮮、完整的七筋姑幼嫩葉片，用變色硅膠迅速干燥，待硅膠變色后馬上更換，直到葉片變脆，帶回實驗室整理后，置于冰箱低溫保存?zhèn)溆?

表1　七筋姑SSR擴增引物

2.2實驗方法

2.2.1基因組DNA的提取

采用改良的2×CTAB法［9-10］，所用器皿和試劑除有機溶劑外都經過高壓滅菌之后用于提取七筋姑基因組DNA.用紫外分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA質量.

2.2.2SSR-PCR引物篩選

從化龍山北坡、化龍山南坡、金猴嶺和木林子4個地方中選取質量較好的DNA樣品，對30對SSR引物進行擴增，從中初步篩選出多態(tài)性較高、合適的11對引物（表1）進行分析.供篩選的引物由西安科昊生物工程有限責任公司研究開發(fā).

2.2.3PCR產物檢測

取8 μl的PCR擴增產物用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離.緩沖液為1×TBE，100 V電壓下預電泳30 min，點樣后，在200 V電壓下電泳3～4 h.

用銀染強堿法染色：將膠取下用雙蒸水洗膠2次，每次2 min；用含0.2%的AgNO3的染色液染色12 min；再用雙蒸水清洗30s；用含1.5%的NaOH和0.4%的甲醛顯影液顯影15 min，在此過程中充分搖動，直到清晰地看到所有條帶；最后用雙蒸水清洗2次；將其取出觀察條帶、拍照并記錄［11］.

2.3數據分析

擴增產物經電泳后獲得圖譜，在相近遷移位置上有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，形成原始的“0，1”矩陣.多個引物擴增結果顯示完全一致的樣本，可推測為同一個克隆系.分析種群的克隆結構和克隆多樣性常見的幾種度量標準如下［12］：

（1）基株數目G：是種群中基株的總數，所有擴增位點基因型相同的植株可視為同一個基株.

（2）平均克隆大小NC：表示平均每個基株含有的克隆分株數即N/G，N為樣本總數.

（3）不同基因型比率（PD）：基株數目/樣本總數，即G/N.

（4）Simpson多樣性指數（D）：表示物種的多樣性和均勻度，也可衡量種群內的克隆多樣性.D=1-∑｛ni（ni-1）/（N（N-1）｝，其中ni表示第i個基因型的分株數目.D值變動范圍0到1，0表示種群所有樣本是同一種基因型，1表示所有的樣本都是不同的基因型.

（5）基因型分布均勻度Fager指數：E=（D-Dmin）/（Dmax-Dmin）；Dmin=｛（G-1）（2N-G）/N（N-1）｝；Dmax=｛N（G-1）/ G（N-1）｝.Fager指數表示種群內基因型的均勻度，E=0表示種群內所有個體的基因型都不同或有一個基因型占絕對優(yōu)勢而其他基因型都只有一個個體；E=1表示種群內所有基因型有相同的個數.

（6）局限性基因型：只有一個種群中出現的基因型［13］.（7）廣布型基因型：75%以上種群中出現的基因型［13］.

運用POPGENE V1.31軟件對種群進行各項參數的運算，觀察等位基因數（na）、有效等位基因數（ne）、Nei's基因多樣性指數（h）、Shannon多樣性指數（I）和多態(tài)位百分率（PPB）、種群總的基因多樣性（HT）、種群內的基因多樣性（HS）、遺傳分化指數（GST）和基因流（Nm）［14］.

將所有樣本用字母標注：化龍山北坡41個個體用字母A～AO表示，化龍山南坡31個個體用字母DR～EV表示，金猴嶺39個個體用字母CE～DQ表示，木林子41個個體用字母AP～CD表示（表2），將數據導入MrBayes軟件分析每個個體及種群間的遺傳距離，將輸出結果用Figtree讀取遺傳距離圖［15］.

表2　七筋姑樣本個體字母標記對照

采用SPSS16.0數據處理系統(tǒng)軟件對七筋姑種群克隆結構的各項數據與環(huán)境因子進行相關性分析.

3　結果與分析

3.1七筋姑不同倍型的遺傳多樣性

從30對引物組合中選出擴增條帶清晰、穩(wěn)定性高的11對引物對所有個體進行擴增.結果顯示（表3），二倍體種群的遺傳多樣性較低，其多態(tài)位百分率（PPB）為23.69%，觀察等位基因數（na）、有效等位基因數（ne）、基因多樣性指數（h）、Shannon多樣性指數（I）分別為1.236 9，1.202 7，0.108 3，0.153 7.四倍體種群遺傳多樣性表現出與二倍體相同的趨勢，PPB=19.73%，na=1.197 4，ne=1.1405，h=0.077 6，I=0.1126.

表3　七筋姑兩種倍型遺傳多樣性指數

種群總的基因多樣性（HT）為0.193 2，種群內的基因多樣性（HS）為0.092 9.遺傳分化系數（GST）為0.518 8，表明遺傳變異主要存在于種群間.根據遺傳分化系數估算的基因流（Nm）為0.467 3，小于1，說明不同種群之間基因交流受到限制.

物種水平上，PPB為92.11%，表現出高的遺傳多樣性，其他多樣性指數分別為na=1.921 1，ne=1.258 1，h= 0.1933，I=0.329 1.物種水平的遺傳多樣性高于種群水平的遺傳多樣性.

對兩種倍型的不同種群遺傳多樣性指數比較發(fā)現，二倍體種群遺傳多樣性高于四倍體.其順序為：化龍山北坡四倍體（HLB）＜化龍山南坡二倍體（HLN）＜木林子四倍體（MLZ）＜金猴嶺二倍體（JHL）.

3.2七筋姑不同倍型%克隆多樣性

二倍體、四倍體種群中克隆基株的數目大小不一，所有種群都是多克隆群體，沒有發(fā)現單克隆構型的種群（表4），而且在研究的4個種群152個樣本中出現了117個基因型，其中二倍體包含29.5個基因型，四倍體包含29個基因型，平均每個種群有29.25個克隆.

表4　七筋姑兩種倍型種群的克隆多樣性指數

根據Ellstrand&Roose［13］對局限基因型和廣布基因型的標準判斷，七筋姑為局限基因型，地域性分布比較明顯.二倍體種群平均克隆大小（NC）平均為1.184，四倍體種群平均為1.441，物種水平上為1.299；二倍體種群不同基因型比率（PD）平均為0.846，四倍體種群平均為0.708，物種水平上為0.700；二倍體種群Simpson多樣性指數（D）為0.978，四倍體種群平均為0.961，物種水平上為0.992；二倍體種群基因型分布均勻度（E）平均為0.253，四倍體種群平均為0.621，物種水平上為0.887.克隆多樣性參數表明二倍體種群的克隆多樣性水平高于四倍體種群.

為了進一步了解七筋姑對環(huán)境的適應能力，對種群的克隆多樣性與環(huán)境因子進行相關性分析（表5）.結果表明僅海拔與多樣性參數呈現出較高的相關性，但并不顯著，其中不同基因型比率（PD）、Simpson多樣性指數（D）與海拔呈正相關，平均克隆大?。∟C）、基因型分布均勻度（E）與海拔呈負相關，說明海拔越高平均克隆大小越小，基因型分布越不均勻，而基因型比率越高，Simpson多樣性也越高.

表5　克隆多樣性與環(huán)境因子的相關性

3.3七筋姑不同倍型的克隆構型

基于貝葉斯法在MrBayes軟件中進行聚類分析（圖1），結果顯示化龍山北坡的四倍體種群所有個體聚為一支，木林子的四倍體種群所有個體聚為一支，化龍山南坡的二倍體種群所有個體聚為一支，金猴嶺的二倍體種群所有個體聚為一支.

圖1　七筋姑樣本遺傳距離聚類圖

兩種倍型4個種群之間遺傳距離存在差異，同一種群內不同個體間遺傳距離也存在不同程度的差異（圖2）.二倍體種群為多克隆種群，化龍山南坡二倍體種群克隆系僅有1個，金猴嶺二倍體克隆系有2個.四倍體種群同樣都為多克隆種群，化龍山北坡四倍體出現4個克隆系，木林子四倍體出現2個克隆系.并且不同種群之間沒有發(fā)現相同的基因型個體.

圖2　七筋姑不同倍型基因型分布示意圖

4　討論

4.1七筋姑不同倍型的克隆多樣性水平

克隆植物通過無性繁殖產生的后代，其基因型與親本完全相同，一直以來人們都認為在克隆植物種群中遺傳多樣性很低，近些年隨著分子生物學的快速發(fā)展，分子遺傳標記技術特別是SSR分子標記技術的應用，發(fā)現克隆植物種群中的克隆多樣性并沒有像預估的那么低［16］.本文研究發(fā)現兩種倍型的七筋姑種群都具有較高的遺傳多樣性，同時陜西和湖北境內的二倍體種群遺傳多樣性高于四倍體.究其原因可能有以下幾點：（1）該物種本身是多基因型起源的，即祖先基因多樣性就高，發(fā)展到現在仍然保持較高的基因多樣性；（2）七筋姑兼性有性生殖，不同個體交配繁育后代的遺傳變異為遺傳多樣性提供了可能；（3）很低的實生幼苗更新和補充都可以維持和增加種群內的多樣性水平，文中七筋姑的平均克隆大小為1.299，說明存在幼苗的更新［17］.另外，二倍體遺傳多樣性高于四倍體可能是由于四倍體物種起源時間較短，其種群中還沒有積累比較多的遺傳變異［18］.

4.2七筋姑不同倍型的克隆構型

Simpson多樣性指數D是反映植物克隆多樣性水平的主要特征值.本研究中七筋姑二倍體種群Simpson多樣性指數D平均值為0.978，四倍體平均值為0.961，顯示出兩種倍型七筋姑都具有較高的克隆多樣性，但二倍體種群略高于四倍體，可能因為兩種倍型的七筋姑生境都處于高海拔地區(qū)，相對貧瘠的環(huán)境使得該植物為了適應環(huán)境進行有性繁殖更新、補充實生苗，促使不同基因型的植株占據不同生境，增加對異質空間資源的獲取能力；同時二倍體種群Simpson多樣性指數高于四倍體種群，說明二倍體種群克隆繁殖能力較強，由于二倍體生長海拔普遍高于四倍體克隆，而克隆繁殖對于高寒環(huán)境是一種優(yōu)勢，二倍體相對較高的克隆繁殖增加了對環(huán)境的適合度.

本研究中兩種倍型七筋姑種群均為多克隆種群，沒有發(fā)現單克隆種群.根據克隆個體在空間上的分布而言，金猴嶺二倍體、化龍山北坡四倍體、木林子四倍體都出現多個克隆系，而化龍山南坡二倍體種群克隆系僅有1個，出現了優(yōu)勢基因型，形成了所有的克隆分株.種群中克隆系的數目可能是由于環(huán)境異質性決定的，即不同基因型個體對環(huán)境適應能力的不同造成了特定的基因型只能集中分布于特定的環(huán)境中［19］.化龍山南坡二倍體中僅存在1種基因型與環(huán)境高度適應，成為優(yōu)勢基因型.兩種倍型種群內同一克隆系的分株分布比較密集，不同基因型基株離散分布，說明兩種倍型七筋姑種群的克隆構型均為混合型［20-21］，同時七筋姑不同倍型間均沒有明顯的鑲嵌現象，說明相同或相近的基因型幾乎出自同一個種群，為局限性基因型［17，22］.種群間的基因多樣性遠高于種群內，一方面證明了七筋姑地理分布范圍廣，種群間克隆分化程度高，另一方面也說明不同克隆種對生態(tài)適應性不同.相關性分析發(fā)現，僅海拔與各項數據呈現較高的相關性，但并不顯著，經緯度、溫差與降水量等并沒有對七筋姑的克隆多樣性產生較大的影響，可能由于上述環(huán)境因子并不是影響七筋姑有性繁殖與無性繁殖的相對比例的主要因素［23］.

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Clonalstructure of Different Cytotypes of Clintonia udensis

LIU Xin，LIU Li，ZHAO Liang，WANG Yiling
（College of Lifesciences，Shanxi Normal University，Linfen 041000，China）

Clintonia udensis is a member of Clintonia（Liliaceae）.As a perennial herbaceous plant，thisspecies has two cytotypes which include diploid and tetraploid.Thespecies can reproduce through root buds.In thisstudy，the clonal diversity and clonalstructure of C.udensis was analyzed based onsSR molecular markers.The resultsshowed that the diploid and tetraploid populations were all polyclonal populations，and that none monoclonal populations were found.There is a high clonal differentiation in two cytotypes.All the clonalstructure of C. udensis was“Guerilla”.152 C.udensissamples of four populations had 117 genotypes.The diploid had 29.9 genotypes，while the tetraploid had 29 genotypes.The average clone was 29.25 at the population level.Moreover，Simpson index（D）was 0.992 and genotype ratio（PD）was 0.700 atspecies level，which indicated high clonal diversity within C.udensis.The colnal diversity of diploid wasslightly higher than that of tetraploid.There is nosignificant correlation between clonal diversity and environmental factors based on correlation analysis.In conclusion，multiple origins of genotypes，facultativesexual reproduction and updatedseedlingsshould be thesources for maintaining rich genotypes within the C.udensis populations.

Clintonia udensis；clonalstructure；cytotypes

TU857

A

1008-2794（2015）04-0105-07

2016-04-12

王祎玲，教授，博士，研究方向：分子生態(tài)學，E-mail：ylwangbj@hotmail.com.