許文苑 丁召磊 許振

[摘要] 目的 探討Toll樣受體1（TLR1）基因外顯子3區(qū)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與華北地區(qū)漢族人群支氣管哮喘之間的關(guān)系。 方法 選取山東省濰坊市人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）呼吸科2014年1月～2015年1月收治的支氣管哮喘患者100例為哮喘組，選取同期在我院健康查體100例為對(duì)照組，采集外周血并提取全基因組DNA。采用聚合酶鏈反應(yīng)-高分辨率熔解曲線（PCR-HRM）技術(shù)和DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)TLR1外顯子3區(qū)的基因多態(tài)性。比較哮喘組和對(duì)照組等位基因和基因型的分布差異。 結(jié)果 哮喘組與對(duì)照組TLR1基因SNP的rs5743596分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。哮喘組與對(duì)照組等位基因C和T的分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 TLR1基因rs5743596位點(diǎn)的多態(tài)性與支氣管哮喘易感性之間關(guān)系不大。

[關(guān)鍵詞] Toll樣受體1；單核苷酸多態(tài)性；高分辨率熔解曲線技術(shù)；支氣管哮喘

[中圖分類號(hào)] R562.2+5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）02（b）-0017-04

Association analysis between polymorphism of Toll-like receptors 1 and susceptibility to asthma of Han people in North China

XU Wenyuan1 DING Zhaolei2 XU Zhen3 SHENG Jianhui1 TAN Wei2

1.Weifang Medical University， Shandong Province， Weifang 261042， China； 2.Department of Respiratory Medicine， People′s Hospital of Weifang City， Shandong Province， Weifang 261041， China； 3.Department of Surgery， Maternal and Child Health Hospital of Ningyang County， Shandong Province， Ningyang 271400， China

[Abstract] Objective To investigate the association between single nucleotide polymorphisms （SNP） of excon-3 in Toll-like receptors 1 （TLR1） and susceptibility to asthma of Han people in North China. Methods 100 patients with asthma treated in Respiratory Department， People′s Hospital of Weifang City in Shandong Province （"our hospital" for short） from January 2014 to January 2015 were selected as asthma group， in the same period， 100 cases with kindergarden in our hospital were selected as control group. DNA samples were taken from their peripheral blood. Polymerase chain reaction-high resoution melting （PCR-HRM） technique and DNA sequencing technique were employed to detect the polymorphisms of excon-3 in TLR1. And meanwhile， distribution of allele and genotype between asthma group and control group were measured. Results There was no statistical difference in the distribution of TLR1-rs5743596 between asthma group and control group （P > 0.05）. There were no statistical significantly differences in the allele frequencies of C and T between asthma group and control group （P > 0.05）. Conclusion The rs5743596 of TLR1-SNP may not be involved in the susceptibility to asthma.

[Key words] Toll-like receptors 1； Single nucleotide polymorphism； High resolution melting technique； Asthma

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是一種以氣道高反應(yīng)性和多種炎癥細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等）浸潤為特征的氣道慢性炎癥。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前患哮喘人數(shù)高達(dá)2.35億人[1]。哮喘的患病率不斷增長(zhǎng)，有人提出哮喘的發(fā)生與吸煙、肥胖、過敏性疾病、暴露于顆粒物有密切的聯(lián)系[2-4]。哮喘的發(fā)病機(jī)制已逐漸受到人們的關(guān)注。

免疫學(xué)研究認(rèn)為，機(jī)體在遺傳基礎(chǔ)上受到外界刺激物影響時(shí)，外周血中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等可通過分泌細(xì)胞因子，導(dǎo)致Th1/Th2比列失衡，從而導(dǎo)致哮喘的發(fā)生[5]。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）作為新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞跨膜受體，他們主要分布于單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）等多種免疫細(xì)胞表面[6]。

近年來，TLRs單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與哮喘的關(guān)系備受關(guān)注。研究結(jié)果顯示，Toll樣受體2（Toll-like receptors 2，TLR2）、Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）、Toll樣受體6（Toll-like receptors 6，TLR6）、Toll樣受體9（Toll-like receptors 9，TLR9）、Toll樣受體10（Toll-like receptors 10，TLR10）的基因多態(tài)性可能與哮喘或特應(yīng)性體質(zhì)有關(guān)[7-11]。但有關(guān)Toll樣受體1（Toll-like receptors 1，TLR1）基因多態(tài)性與哮喘關(guān)系的研究，目前國內(nèi)幾乎空白。本文通過對(duì)哮喘與TLR1外顯子3區(qū)基因多態(tài)性的研究，旨在探討哮喘與TLR1基因rs5743596位點(diǎn)多態(tài)性之間的關(guān)系，對(duì)哮喘的預(yù)防及早期治療做進(jìn)一步指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取山東省濰坊市人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）呼吸科2014年1月～2015年1月收治，能夠留取血標(biāo)本并自愿參與實(shí)驗(yàn)的成人哮喘患者100例作為哮喘組，其中男67例，女33例；平均年齡（50.44±19.21）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組所制訂的支氣管哮喘防治指南。剔除標(biāo)準(zhǔn)[12]：①合并其他呼吸系統(tǒng)疾病，如慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張等；②診斷為良性或惡性腫瘤；③有真菌、病毒、寄生蟲感染者；④明確伴有自身免疫性疾病等。另選取同期在我院健康查體并取得知情同意后的健康成人志愿者100例作為對(duì)照組，其中男56例，女44例；平均年齡（48.26±17.59）歲。兩組研究對(duì)象均為華北地區(qū)漢族人群，且均無血緣關(guān)系。兩組的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 樣本選取 每位受試者抽取空腹靜脈血2 mL，枸櫞酸鈉抗凝，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA基因組提取 按照DNA提取試劑盒所示步驟提取所有樣本的DNA。通過電泳鑒定DNA提取成功，通過Nanodrop2000微量紫外分光光度儀測(cè)定提取基因組DNA的濃度和純度，終濃度4.5～5.5 ng/μL，純度OD260/OD280為1.8～2.0。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 在NCBI的數(shù)據(jù)庫查找TLR1人的DNA序列和RNA序列信息，根據(jù)外顯子序列區(qū)域利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)相關(guān)引物，引物設(shè)計(jì)本著分段重復(fù)、覆蓋的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)的引物最后采用Oligo7.0驗(yàn)證引物的特異性及穩(wěn)定性，并送至公司合成引物，正向引物為5′-CCTTGCTCAGGGTCTTCATG-3′，反向引物為5′-CTTACCCTTTTGTAGGGGTGC-3′。

1.2.4 運(yùn)用高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）進(jìn)行基因分型 采用HRM技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA片段并進(jìn)行基因分型，獲得HRM分析結(jié)果，從而判定樣品的SNP類型。實(shí)驗(yàn)所用試劑Light Cycler⑧480 High Resolution Melting Master購自羅氏公司。標(biāo)準(zhǔn)品的制備及PCR-HRM反應(yīng)總體系：標(biāo)準(zhǔn)品由前期測(cè)序直接獲得?？傮w積20 μL，其中HRM Master 10 μL、正反向引物各1 μL、全基因組DNA 3 μL、MgCl2 1.6 μL、去離子水3.4 μL。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性120 s，然后94℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s，共55個(gè)循環(huán)。在進(jìn)行HRM分析之前，進(jìn)行變性和復(fù)性處理，反應(yīng)條件如下：95℃ 60 s，54℃ 10 s。HRM過程從54℃開始，以1℃/s的斜率采集熔解曲線，到95℃結(jié)束，并在Light Cycler 480基因掃描軟件模塊上進(jìn)行分析。每次反應(yīng)均需將已知基因型的標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)HRM的形狀判斷基因型，與標(biāo)準(zhǔn)品曲線形狀相同者被認(rèn)定為與標(biāo)準(zhǔn)品基因型相同，從而獲得未知待測(cè)樣品的基因型。

1.2.5 測(cè)序驗(yàn)證 用DNA測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證HMR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增TLR1基因中包含rs5743596位點(diǎn)的DNA片段，擴(kuò)增片段經(jīng)過純化后直接用于測(cè)序分析。隨機(jī)抽取30份PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成。PCR擴(kuò)增用引物，正向引物為5′-TTTCCGGGTCTTTCAGCC-3′，反向引物為5′-AAGCACCAAATTCCTCTTCACA-3′，PCR擴(kuò)增體系為：總體系50 μL，其中正反向引物各2 μL、全基因組DNA 5μL、Taq酶25 μL、去離子水16 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性45 s，64℃退火1 min，72℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HRM分析

圖1A（封三）為TLR1基因標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線，圖1B（封三）為標(biāo)準(zhǔn)化的溫度變化曲線，代表不同基因型熔解曲線的形狀和顏色，因溫度的變化發(fā)生改變，結(jié)合不同熔解曲線樣本經(jīng)測(cè)序的結(jié)果（圖2），其中綠色表示雜合子突變型CT，藍(lán)色表示純合子突變型TT，紅色表示野生型CC。測(cè)序結(jié)果通過查閱NCBI和GenBank發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)位于TLR1基因的rs5743596位點(diǎn)。

A：野生型CC基因型的測(cè)序結(jié)果，黑色箭頭指向C等位基因；B：純合子突變型TT基因型的測(cè)序結(jié)果，箭頭指向T等位基因；C：雜合子突變型CT基因型的測(cè)序結(jié)果，黑色箭頭指向CT雜合基因

圖2 不同熔解曲線樣本經(jīng)測(cè)序的結(jié)果

2.2 遺傳平衡檢驗(yàn)

哮喘組人群TLR1基因rs5743596位點(diǎn)的基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.013，P=0.310）；對(duì)照組人群TLR1基因rs5743596位點(diǎn)的基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.630，P=0.056）。哮喘組和對(duì)照組中該位點(diǎn)的基因型頻率無顯著性差異，證明符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，本研究人群具有群體代表性。見表1。

表1 遺傳平衡檢驗(yàn)

2.3 哮喘組和對(duì)照組各基因型和等位基因分布頻率比較

哮喘組TLR1基因rs5743596位點(diǎn)的各基因型與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.988，P=0.083）；哮喘組與對(duì)照組TLR1基因rs5743596位點(diǎn)的等位基因分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.604，P=0.437）。見表2。

表2 哮喘組和對(duì)照組各基因型和等位基因分布頻率比較[n（%）]

3 討論

TLRs是近年來研究的熱點(diǎn)，Koponen等[13]、袁欣等[14]認(rèn)為，TLRs在先天性免疫系統(tǒng)中起重要作用，TLRs基因的表達(dá)與哮喘等自身免疫性疾病有密切關(guān)系。哮喘是一種復(fù)雜的多因素疾病，基因-環(huán)境在哮喘的發(fā)病中起重要作用，遺傳因素可以引起TLRs基因的多態(tài)性[15]，而環(huán)境因素又可以通過TLRs調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡[16]，從而影響哮喘的發(fā)病。Hussein等[17]、Werner等[18]發(fā)現(xiàn)，TLRs基因（主要為TLR2和TLR4基因）編碼的改變，可以增加哮喘患病的危險(xiǎn)性。所以進(jìn)一步研究由遺傳因素決定的TLRs多態(tài)性與哮喘之間的關(guān)系問題，對(duì)于明確哮喘的發(fā)病機(jī)制以及治療方法具有非常重要的意義。目前TLR2、TLR4等亞家族基因多態(tài)性與哮喘的研究已成為眾多實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)，而對(duì)于TLR1的研究國內(nèi)外尚未完善。

TLR1位于人基因組4p14，長(zhǎng)度為8537 bp，有4個(gè)外顯子區(qū)（exon），分別位于-5960～-5923、-5551～-5475、-2117～-2026、-67～2576。TLR1作為TLRs的亞家族，表達(dá)于多種免疫細(xì)胞受體，在免疫應(yīng)答和感染中起重要作用，與哮喘炎癥及氣道重塑關(guān)系密切[19-20]。我國人群中，對(duì)于TLRs SNP與哮喘關(guān)系的研究尚未開展，為了進(jìn)一步了解哮喘的發(fā)病機(jī)制，有必要對(duì)我國人群哮喘相關(guān)的TLRs SNP進(jìn)行篩選。本實(shí)驗(yàn)著重研究外顯子片段3的SNP位點(diǎn)與哮喘的關(guān)系。

本研究對(duì)哮喘組患者的TLR1外顯子3進(jìn)行測(cè)序研究，發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP，位于rs5743596位點(diǎn)的C突變?yōu)門，經(jīng)過χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明此位點(diǎn)的等位基因分布頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性。TLR1基因rs5743596位點(diǎn)在我國華北地區(qū)漢族人群中存在，且存在3種基因型，分別為CC、CT、TT型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，哮喘組TLR1基因位點(diǎn)rs5743596基因型分布以及等位基因的分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），因此rs5743596位點(diǎn)的SNP與哮喘易感性之間關(guān)系不大。但是不同人群之間等位基因分布頻率差異較大，本研究?jī)H局限于中國華北地區(qū)漢族人群，有可能導(dǎo)致該結(jié)果并不適用于其他地域或種族人群；其次，對(duì)于TLR1基因的其他SNP位點(diǎn)是否與哮喘的發(fā)生相關(guān)，仍需進(jìn)一步研究。本研究首次對(duì)華北地區(qū)人群TLR1基因的多態(tài)性與哮喘關(guān)系進(jìn)行了探討，它將為今后在漢族人群中開展TLR1基因的多態(tài)性與哮喘及其他疾病相關(guān)性的研究奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2015-10-24 本文編輯：李亞聰）