常菊花　何月平

摘要：根據(jù)已報(bào)道的昆蟲(chóng)咽側(cè)體抑制激素（Allatostatin，AS）神經(jīng)肽序列，基于轉(zhuǎn)錄組和基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)同源性比較分別查找到53、33、57和35種昆蟲(chóng)的AS-A、AS-B、AS-C和AS-CC前體氨基酸序列，并對(duì)這些AS前體序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建及分析。結(jié)果表明，昆蟲(chóng)AS-A、AS-B、AS-C和AS-CC分別在各自的進(jìn)化分支上，且AS-C和AS-CC之間的親緣關(guān)系較近，AS-A是最早分化出來(lái)的。在4種AS的進(jìn)化樹(shù)中，不同種類昆蟲(chóng)間的親緣關(guān)系不盡相同。其中在AS-C進(jìn)化樹(shù)中，除了膜翅目，完全變態(tài)類昆蟲(chóng)都在一個(gè)進(jìn)化分支，而膜翅目和不完全變態(tài)類昆蟲(chóng)在一個(gè)進(jìn)化分支。在AS-CC進(jìn)化樹(shù)中，發(fā)現(xiàn)鱗翅目和雙翅目分別在一個(gè)進(jìn)化分支上，而膜翅目、鞘翅目和不完全變態(tài)類昆蟲(chóng)在一個(gè)進(jìn)化分支上。目前尚未找到鞘翅目昆蟲(chóng)的AS-A序列和膜翅目昆蟲(chóng)的AS-B序列。

關(guān)鍵詞：昆蟲(chóng)；神經(jīng)肽；生物信息學(xué)；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；Allatostatin

中圖分類號(hào)：Q966 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）06-1566-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.052

昆蟲(chóng)神經(jīng)肽通過(guò)激素或遞質(zhì)的形式調(diào)控著昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、脫皮變態(tài)、滯育、代謝、生殖等多種發(fā)育過(guò)程[1]。由腦神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的神經(jīng)肽類激素咽側(cè)體活化激素（Allatotropin，AT）或咽側(cè)體抑制激素（Allatostatin，AS）刺激或抑制咽側(cè)體的保幼激素（Juvenile hormone，JH）的生物合成[2]。咽側(cè)體合成的保幼激素在大多數(shù)昆蟲(chóng)中控制幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)、變態(tài)和成蟲(chóng)發(fā)育等重要生理過(guò)程[3]。AS神經(jīng)肽廣泛存在于各種昆蟲(chóng)中，最早是從太平洋折翅蠊（Diploptera punctata）的后腦復(fù)合體中分離出來(lái)[4]，隨后在多種昆蟲(chóng)中都分離出AS。目前，在昆蟲(chóng)中分離鑒定出4種AS神經(jīng)肽類型（AS-A、AS-B、AS-C和AS-CC）[5]：①A型AS的酰胺化C末端有非常保守的五肽序列Y/FXFGL/I-amide。從太平洋折翅蠊中分離出來(lái)的AS神經(jīng)肽序列就是A型，因此也叫蟑螂型AS，或FGLamide。②B型AS的特征是在多肽序列酰胺化C末端的2位和9位上有共同的色氨酸（Trp，W），最初從咖啡兩點(diǎn)蟋（Gryllus bimaculatus）中分離出來(lái)[6]，因此也稱蟋蟀型AS，或W（X）6W-amide。該類神經(jīng)肽因其具有抑制前胸腺活性，先前被稱為myoinhibitory peptide（MIP）。③C型AS是一個(gè)含有15個(gè)氨基酸的單一多肽，其C末端為未酰胺化的五肽序列PISCF，首先從煙草天蛾（Manduca sexta）中分離出來(lái)[7]，故也稱蛾型AS，或PISCF型AS。④Allatostatin double C（AS-CC）是AS-C的旁系同源神經(jīng)肽。先前與AS-C通稱為類AS-C肽（AS-C like peptides），近年才被命名為AS double C（AS-CC）。AS-C和AS-CC的前體氨基酸序列C末端的2位和9位上有相同的半胱氨酸（Cys，C）組成一個(gè)二硫鍵。

AS神經(jīng)肽的功能除抑制咽側(cè)體內(nèi)保幼激素的生物合成外，還影響昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、生殖和行為等生理過(guò)程。由于神經(jīng)肽在昆蟲(chóng)體內(nèi)含量很低，因此昆蟲(chóng)神經(jīng)肽分離工作進(jìn)展遲緩，隨著結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)和肽分離技術(shù)的發(fā)展，鑒定的神經(jīng)肽數(shù)目大大增加，特別是隨著基因組學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的昆蟲(chóng)神經(jīng)肽序列可以被預(yù)測(cè)出來(lái)。因此，本研究根據(jù)現(xiàn)報(bào)道的昆蟲(chóng)AS神經(jīng)肽序列，通過(guò)同源性比較來(lái)查找其他昆蟲(chóng)AS神經(jīng)肽序列，并對(duì)昆蟲(chóng)AS神經(jīng)肽家族進(jìn)行進(jìn)化分析，為昆蟲(chóng)AS神經(jīng)肽的結(jié)構(gòu)和功能分析提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 昆蟲(chóng)Allatostatin神經(jīng)肽家族氨基酸序列的查找

根據(jù)報(bào)道的黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）[8]，岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）[9]，意大利蜜蜂（Apis mellifera）[10]，家蠶（Bombyx mori）[11]，赤擬谷盜（Tribolium castaneum）[12]，長(zhǎng)紅錐蝽（Rhodnius prolixus）[13]，東亞飛蝗（Locusta migratoria）[14]，濕木白蟻（Zootermopsis nevadensis）[14]和褐飛虱（Nilaparvata lugens）[15]的Allatostatin前體氨基酸序列作為參照，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、昆蟲(chóng)基因組和轉(zhuǎn)錄組資源庫(kù)（http：//www.insect-genome.com/）和水稻害蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//rptdb.hzau.edu.cn/）中采用TBLASTN查找其他昆蟲(chóng)可能的Allatostatin前體基因序列。采用ExPASy網(wǎng)站的翻譯工具（http：//web.expasy.org/translate/）對(duì)前體基因序列進(jìn)行翻譯，并逐一核對(duì)活性肽序列的同源性。

1.2 多序列聯(lián)配和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用EMBL-EBI在線程序ClustalW2（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalw2/）對(duì)蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，利用BioEdit軟件輸出。使用MEGA5軟件中的鄰接法（Neighbor-joining）對(duì)蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。其中，程序的重復(fù)次數(shù)（Number of bootstrap replications）設(shè)為1 000，替換方法（Substitution method）選擇p-distance，空缺數(shù)據(jù)的處理方法（Gap data treatment）選擇95%partial deletion，其他參數(shù)采用默認(rèn)設(shè)置。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)已報(bào)道的幾種昆蟲(chóng)Allatostatin神經(jīng)肽序列，通過(guò)BLAST查找其他昆蟲(chóng)Allatostatin神經(jīng)肽序列，分別找到了53、33、57和35種昆蟲(chóng)Allatostatin A、Allatostatin B、Allatostatin C和Allatostatin CC氨基酸序列。通過(guò)預(yù)測(cè)神經(jīng)肽的活性肽并進(jìn)行序列比對(duì)，驗(yàn)證所查找的神經(jīng)肽氨基酸序列。

從圖1中可以看出，昆蟲(chóng)4種類型AS的神經(jīng)肽前體序列分別在各自的進(jìn)化分支上，且AS-C和AS-CC之間的親緣關(guān)系較近，AS-A是最早分化出來(lái)的。

2.1 昆蟲(chóng)AS-A神經(jīng)肽前體序列的進(jìn)化樹(shù)分析

51種昆蟲(chóng)的AS-A前體氨基酸序列分成兩個(gè)進(jìn)化分支，雙翅目、膜翅目AS-A在一個(gè)進(jìn)化分支上，鱗翅目、半翅目、等翅目、直翅目和蜚蠊目在另一個(gè)進(jìn)化分支上（圖2）。對(duì)這51種昆蟲(chóng)AS-A神經(jīng)肽預(yù)測(cè)活性肽序列，發(fā)現(xiàn)C末端有3種情況，即F/YXFGL、F/YXFGI和F/YXFGV。其中所有昆蟲(chóng)都有F/YXFGL，而F/YXFGI只在15種昆蟲(chóng)（分屬膜翅目、半翅目、直翅目和等翅目）中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)/YXFGV只在4種昆蟲(chóng)[東亞飛蝗（L. migratoria）、沙漠蝗（S. gregaria）、雙斑蟋（G. bimaculatus）和達(dá)爾文澳白蟻（M. darwiniensis）]中發(fā)現(xiàn)。AS-A前體序列的進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果基本符合昆蟲(chóng)形態(tài)學(xué)分類，除了體虱AS-A與完全變態(tài)類雙翅目和膜翅目在一個(gè)進(jìn)化分支上。目前尚未在鞘翅目中發(fā)現(xiàn)AS-A序列。

2.2 昆蟲(chóng)AS-B神經(jīng)肽前體序列的進(jìn)化樹(shù)分析

由圖3可以看出，雙翅目在單獨(dú)一個(gè)進(jìn)化分支，鞘翅目、鱗翅目、半翅目、直翅目、等翅目和虱目在一個(gè)進(jìn)化分支。對(duì)這33種昆蟲(chóng)AS-B神經(jīng)肽預(yù)測(cè)活性肽序列，發(fā)現(xiàn)有3種類型，即W（X）6W-amide、W（X）7W-amide和W（X）8W-amide。所有昆蟲(chóng)都含有W（X）6W-amide，然而只含有W（X）6W-amide的昆蟲(chóng)種類為雙翅目所有昆蟲(chóng)、黑脈金斑蝶（D. Plexippus）、柑橘卷葉蛾（A. transitella）、赤擬谷盜（T.castaneum）、中歐山松大小蠹（Dendroctonus ponderosae）、內(nèi)華達(dá)古白蟻（Z. nevadensis）和東亞飛蝗（L. migratoria），同時(shí)有W（X）6W-amide和W（X）7W-amide有12種昆蟲(chóng)，而只在鱗翅目5種昆蟲(chóng)[詩(shī)神袖蝶（Heliconius melpomene）、小菜蛾（P. xylostella）、棉鈴蟲(chóng)（H. armigera）、柑橘鳳蝶（P. xuthus）、玉帶鳳蝶（P. machaon）]中發(fā)現(xiàn)有W（X）8W-amide。目前尚未在膜翅目中發(fā)現(xiàn)AS-B序列。

2.3 昆蟲(chóng)AS-C神經(jīng)肽前體序列的進(jìn)化樹(shù)分析

對(duì)57種昆蟲(chóng)的AS-C神經(jīng)肽前體序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)存在兩個(gè)進(jìn)化分支，鱗翅目、鞘翅目和雙翅目在一個(gè)進(jìn)化分支，而膜翅目、半翅目、等翅目、直翅目和虱目在另一個(gè)進(jìn)化分支（圖4）。膜翅目昆蟲(chóng)和不完全變態(tài)昆蟲(chóng)在一分支上，這可以支持一些昆蟲(chóng)分類學(xué)家最近提出的膜翅目昆蟲(chóng)位于完全變態(tài)昆蟲(chóng)進(jìn)化的最底層的這個(gè)學(xué)說(shuō)[16]。按照Allatostatin-C的進(jìn)化樹(shù)可以推論完全變態(tài)昆蟲(chóng)進(jìn)化的順序可能為膜翅目、鞘翅目、雙翅目、鱗翅目。因此Allatostatin-C神經(jīng)肽可能與昆蟲(chóng)變態(tài)密切相關(guān)。AS-C的活性肽序列非常保守，且含有二硫鍵。15種鱗翅目昆蟲(chóng)AS-C神經(jīng)肽序列均為QVRFRQCYFNPISCF，6種蚊類昆蟲(chóng)AS-C序列均為QIRYRQCYFNPISCF，11種蠅類昆蟲(chóng)AS-C序列均為QVRYRQCYFNPISCF，7種不完全變態(tài)昆蟲(chóng)及部分膜翅目昆蟲(chóng)AS-C序列均為SYWKQCAFNAVSCF，而鞘翅目和部分膜翅目昆蟲(chóng)AS-C序列多樣化（圖5）。

2.4 昆蟲(chóng)AS-CC神經(jīng)肽前體序列的進(jìn)化樹(shù)分析

對(duì)32種昆蟲(chóng)的AS-CC神經(jīng)肽前體序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)鱗翅目和雙翅目分別在一個(gè)進(jìn)化分支上，而膜翅目、鞘翅目、半翅目、等翅目和直翅目在一個(gè)進(jìn)化分支上。AS-CC的C末端氨基酸序列非常保守，且含有二硫鍵（圖4）。C末端10位氨基酸序列為R/K-C-Y/F-F-N-A-V-T/S-C-F，N末端序列差異較大（圖6）。AS-C和AS-CC的二硫鍵之間都是含有6個(gè)氨基酸。雖然3種白蟻AS-C有類似AS-CC的CXXNAVXCF的C末端序列，AS-C和AS-CC的前體序列在兩個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支上，說(shuō)明昆蟲(chóng)AS-C和AS-CC神經(jīng)肽來(lái)自不同的起源，這也驗(yàn)證了將AS-CC作為一類新AS神經(jīng)肽的可靠性。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)對(duì)昆蟲(chóng)AS神經(jīng)肽前體序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建及分析，發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)AS-A、AS-B、AS-C和AS-CC分別在各自的進(jìn)化分支上，且AS-C和AS-CC之間的親緣關(guān)系較近，AS-A是最新分化出來(lái)的。不同種類昆蟲(chóng)在4種類型AS的進(jìn)化樹(shù)中，不同種類昆蟲(chóng)間的親緣關(guān)系不盡相同。在AS-A進(jìn)化樹(shù)中，完全變態(tài)類的雙翅目和膜翅目昆蟲(chóng)在一個(gè)進(jìn)化分支，而鱗翅目與不完全變態(tài)類昆蟲(chóng)在另一個(gè)進(jìn)化分支上，但是尚未發(fā)現(xiàn)鞘翅目昆蟲(chóng)的AS-A序列。AS-B進(jìn)化樹(shù)中，雙翅目在單獨(dú)一個(gè)進(jìn)化分支，而鞘翅目、鱗翅目和不完全變態(tài)類昆蟲(chóng)在一個(gè)進(jìn)化分支，但尚未發(fā)現(xiàn)膜翅目昆蟲(chóng)的AS-B序列。在AS-C進(jìn)化樹(shù)中，除了膜翅目，完全變態(tài)類昆蟲(chóng)都在一個(gè)進(jìn)化分支，而膜翅目和不完全變態(tài)類昆蟲(chóng)在一個(gè)進(jìn)化分支，推測(cè)AS-C與昆蟲(chóng)變態(tài)密切相關(guān)。在AS-CC進(jìn)化樹(shù)中，發(fā)現(xiàn)鱗翅目和雙翅目分別在一個(gè)進(jìn)化分支上，而膜翅目、鞘翅目和不完全變態(tài)類昆蟲(chóng)在一個(gè)進(jìn)化分支上。

在昆蟲(chóng)進(jìn)化過(guò)程中，昆蟲(chóng)分化出多種多樣的神經(jīng)肽或神經(jīng)激素，可以調(diào)控不同的昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育，這也導(dǎo)致昆蟲(chóng)世界的多樣化。在昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了多種AS神經(jīng)肽，這些神經(jīng)肽的功能也不盡相同。已分離的大多數(shù)昆蟲(chóng)AS都能抑制源昆蟲(chóng)的CA對(duì)JH的合成，且AS還具有多效性。首次分離出來(lái)的蜚蠊型AS-A能夠在CA中抑制JH合成[6，17]，另外也在其他神經(jīng)組織（如額神經(jīng)節(jié)、食道下神經(jīng)節(jié)等）或分泌細(xì)胞（如中腸內(nèi)分泌細(xì)胞）中發(fā)現(xiàn)，還證明其具有抑制內(nèi)臟（如腸道和心臟）肌肉的自主收縮[14]。AS-A還在德國(guó)小蠊脂肪體中發(fā)現(xiàn)且具有抑制卵原蛋白合成[18]。在德國(guó)小蠊中還發(fā)現(xiàn)AS-A具有通過(guò)影響消化酶的分泌和腸道蠕動(dòng)性來(lái)抑制食物攝取和消化的功能[19]。在蛾類中，注射AS-A可以提高血淋巴中的JH滴度，從而導(dǎo)致幼蟲(chóng)死亡升高和精細(xì)胞縮小[20，21]。AS-B首先在東亞飛蝗腦-心側(cè)體-咽側(cè)體-食道下神經(jīng)節(jié)的提取物中發(fā)現(xiàn)，體外測(cè)定發(fā)現(xiàn)有抑制后腸和輸卵管的收縮活性[22]。隨后在雙斑蟋（G. bimaculatus）腦提取物中也發(fā)現(xiàn)了AS-B，并證明其在咽側(cè)體中具有抑制JH活性。在東亞飛蝗的腦、食道下神經(jīng)節(jié)、背神經(jīng)索的多個(gè)神經(jīng)節(jié)、心臟、輸卵管和后腸中被發(fā)現(xiàn)[22]。在家蠶和煙草天蛾的Epiproctodeal glands中發(fā)現(xiàn)，推測(cè)可能參與羽化行為[23]。在反吐麗蠅（Calliphora vomitoria）和果蠅（D. melanogaster）的視覺(jué)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)AS-B，推測(cè)可能作用于昆蟲(chóng)生物鐘[24，25]。另外在果蠅中發(fā)現(xiàn)AS-B可以靶定和激活性肽受體，推測(cè)可能參與繁殖行為[26]。AS-C首先在煙草天蛾的腦中分離出來(lái)，證明在咽側(cè)體中對(duì)JH具有非常強(qiáng)的抑制活性[7]。AS-CC和AS-C的神經(jīng)肽序列結(jié)構(gòu)類似，功能也相似。AS-C具有多效性，例如還有調(diào)節(jié)前腸收縮活性[27]，在蚊子中發(fā)現(xiàn)羽化后AS-C水平上升，推測(cè)可能參與變態(tài)[28]，在?；页嵋苟辏⊿. littoralis）和番茄夜蛾（Lacanobia oleracea）中注射AS-C導(dǎo)致妨礙幼蟲(chóng)發(fā)育和死亡率升高[29]。在馬鈴薯甲蟲(chóng)中，通過(guò)RNAi將AS-C沉默后，體內(nèi)保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶 （JHAMT）的mRNA水平上調(diào)，導(dǎo)致JH水平上升，從而妨礙幼蟲(chóng)生長(zhǎng)和發(fā)育[30]。AS不是孤立地發(fā)揮作用，而是與其共存的其他肽能物質(zhì)協(xié)同作用，這種協(xié)同作用可能表現(xiàn)為在行使某一功能的相互促進(jìn)或抑制。

通過(guò)對(duì)神經(jīng)肽的信號(hào)系統(tǒng)的干擾，使得昆蟲(chóng)內(nèi)分泌系統(tǒng)失去平衡，影響昆蟲(chóng)正常的生理活動(dòng)，從而達(dá)到控制害蟲(chóng)的目的[1]。本研究根據(jù)現(xiàn)報(bào)道的數(shù)種昆蟲(chóng)AS神經(jīng)肽序列，基于轉(zhuǎn)錄組和基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)同源性比較分別查找到昆蟲(chóng)的AS-A、AS-B、AS-C和AS-CC前體氨基酸序列分別是53、33、57和35種，并對(duì)這些AS前體序列進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，這對(duì)之后的昆蟲(chóng)神經(jīng)肽的結(jié)構(gòu)和功能研究提供了理論基礎(chǔ)。

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