張倩，陳曉潔，王璐，勞繼紅

東華大學(xué)紡織面料技術(shù)教育部重點實驗室 紡織學(xué)院 (上海，201620)

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抗菌實驗操作細(xì)節(jié)對測試效果的影響

張倩，陳曉潔，王璐，勞繼紅

東華大學(xué)紡織面料技術(shù)教育部重點實驗室 紡織學(xué)院 (上海，201620)

分別比較了幾種常用細(xì)菌接種方法對測試效果的影響； 不同含菌瓊脂平板的制作方法以及不同培養(yǎng)基體積對抑菌圈大小的影響。結(jié)果表明： 接種方法對菌落計數(shù)結(jié)果有一定的影響； 含菌瓊脂平板的制作方法以及培養(yǎng)基體積與抑菌圈大小具有一定的相關(guān)性。

抗菌實驗； 操作細(xì)節(jié)； 抑菌圈

0　引言

日常生活中， 不可避免地會接觸到各種各樣的細(xì)菌、 真菌等微生物。這些微生物在一定條件下會大量繁殖， 并傳播疾病， 影響人們的健康。隨著生活水平和工業(yè)水平的提高， 市場上出現(xiàn)了各種各樣的抗菌材料及其產(chǎn)品， 但產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊[1]。如何準(zhǔn)確地檢測這些產(chǎn)品的抗菌性， 對于抗菌產(chǎn)品的良性發(fā)展格外重要。

目前國內(nèi)外涉及抗菌材料及其產(chǎn)品的相關(guān)測試標(biāo)準(zhǔn)很多， 涉及紡織、 化學(xué)、 材料、 衛(wèi)生等領(lǐng)域。紡織品最容易受微生物侵蝕， 國內(nèi)外很早就開始了對紡織品抗菌的研究， 各國先后推出了一系列抗菌標(biāo)準(zhǔn)， 后來又推出了國際標(biāo)準(zhǔn)， 可見抗菌紡織品的研究走在抗菌材料評價的前沿[2]。但是各國的標(biāo)準(zhǔn)各不相同， 即使依據(jù)同一測試標(biāo)準(zhǔn)， 在同一實驗條件下， 各實驗室間的測試結(jié)果還是會存在一定的差異[3]。這些差異可能是很多因素引起的， 如接種菌液的濃度與活性、 操作細(xì)節(jié)、 培養(yǎng)基水平等[4-5]。

本文參照紡織品抗菌測試標(biāo)準(zhǔn)就抗菌實驗過程中的操作細(xì)節(jié)對其測試效果的影響進(jìn)行了討論。

1　實驗部分

1.1實驗材料及儀器

1.1.1實驗材料

氯化鈉(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)， 胰蛋白胨、 酵母提取物、 瓊脂(英國Oxide公司)， 氫氧化鈉(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)， 大腸桿菌EscherichiaColi(E.coli， ATCC 25922)， 金黃色葡萄球菌StaphylococcusAureus(S.aureus， ATCC 25923)(江蘇省博達(dá)生物衛(wèi)生技術(shù)有限公司)， 抗菌濾紙片。

1.1.2實驗儀器

MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋(Tega SANYO Industry Co., Ltd)， TS-100C恒溫?fù)u床(上海柏欣儀器設(shè)備廠)， GHP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實驗儀器有限公司)， SW-CJ-1FD潔凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)， DL91150數(shù)顯游標(biāo)卡尺(得力工具(余姚)有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1實驗前滅菌準(zhǔn)備

抗菌實驗過程中所用到的試管、 錐形瓶、 量筒、 培養(yǎng)皿等在使用前需要經(jīng)過滅菌處理。具體操作方法如下： 將需要的器皿洗凈， 干燥后包好放入高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行滅菌處理， 滅菌完成后取出， 冷卻干燥。

1.2.2培養(yǎng)基的準(zhǔn)備

(1)按照表1配方配置培養(yǎng)基

表1　培養(yǎng)基的配方　　(g)Tab.1　Culture medium formulations

(2)按上述配方稱好試劑后， 加蒸餾水定容至250 mL， 攪拌至完全溶解。然后向其中加入50 μL 5 mol/L的氫氧化鈉溶液， 調(diào)節(jié)pH為7.2±0.2。

(3)將配好的TSA、 TSB放入高壓滅菌器中進(jìn)行滅菌。

1.2.3 菌液的準(zhǔn)備

(1)獲取菌落： 用無菌接種環(huán)沾取細(xì)菌， 在無菌瓊脂平板表面進(jìn)行平板劃線， 細(xì)菌數(shù)量隨著劃線次數(shù)的增加而減少， 并逐漸分散開來， 然后置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)， 可在平板表面得到單個菌落。

(2)菌種的轉(zhuǎn)接： 挑取平板上的單個菌落， 置于4 mL的TSB中， 在37 ℃、 轉(zhuǎn)速為180 r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)12～14 h。

(3) 擴(kuò)大培養(yǎng)： 取3 mL培養(yǎng)后菌液于50 mL TSB中， 在37 ℃、 轉(zhuǎn)速為173 r/min的恒溫?fù)u床中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2.5 h。

1.2.4 細(xì)菌的接種[6-7]

細(xì)菌的接種方法有很多。本文對實驗室常用的接種方法進(jìn)行了比較， 具體接種方法見表2。

表2　細(xì)菌的接種方法Tab.2　Bacterial inoculation methods

1.2.5含菌瓊脂平板的制備[8-11]

平板培養(yǎng)基法是典型的定性抗菌測試方法， 是通過抗菌劑在平板上擴(kuò)散形成抑菌圈來評價產(chǎn)品抗菌性的。各國的紡織品抗菌測試標(biāo)準(zhǔn)中均有此法， 但是各標(biāo)準(zhǔn)和實驗室對含菌瓊脂平板的制作方法存在一定的差異， 本文就幾種常用的制作方法進(jìn)行了比較， 具體操作方法見表3。

表3　含菌瓊脂平板的制作方法Tab.3　Production methods of ager plate containing bacterial

由于方法4將培養(yǎng)基分為兩層， 容易導(dǎo)致接種菌液在瓊脂平皿上分布不均勻， 所以本文主要針對前三種方法進(jìn)行討論。

2　結(jié)果與分析2.1　細(xì)菌接種方法的比較

分別用1.2.4所述的三種接種方法測試了同一菌液的活菌濃度， 測試菌種為金黃色葡萄球菌， TSA用量為15 mL， 菌落形態(tài)如圖1所示， 測試結(jié)果如圖2所示。

圖1　接種方法對菌落形態(tài)的影響Fig.1　Influence of inoculation methods on the colonial morphology

圖2　不同接種方法的測試結(jié)果比較Fig.2　Comparison of the test results of different inoculation methods

由圖1可以看出， 傾注法的菌落不完全分布在培養(yǎng)基表面， 對菌落形態(tài)的觀察帶來不便； 而涂布法與滴注法的菌落長在培養(yǎng)基表面， 便于觀察菌落形態(tài)。采用SPSS對測試結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計分析， 結(jié)果如圖2所示， 傾注法與涂布法的結(jié)果存在顯著性差異、 與滴注法的結(jié)果存在非常顯著的差異， 涂布法與滴注法的結(jié)果不存在顯著性差異。這可能是由于采用傾注法會影響細(xì)節(jié)與氧氣的接觸， 瓊脂培養(yǎng)基溫度也會對測試結(jié)果造成影響。抗菌實驗時， 操作人員應(yīng)選擇合適的接種方法進(jìn)行實驗。

2.2含菌瓊脂平板的制作方法對抑菌圈的影響

按照1.2.5所述的三種方法制作含菌瓊脂平板， 所用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌液濃度為1×108～5×108cfu/mL， TSA用量為15 mL， 其中方法1和方法2所用菌液量為1 mL， 比較了含菌瓊脂平板的制作方法對抑菌圈大小的影響， 兩種菌的測試結(jié)果如圖3所示。

圖3　含菌瓊脂平板制作方式對抑菌圈大小的影響Fig.3　Influence of production methods of ager plate containing bacterial on the size of the inhibition zone

由圖3可知， 對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌， 方法1和方法2的結(jié)果不存在明顯差異， 而均與方法3存在顯著性差異。原因可能是方法1和方法2只是操作方法上的略微差異， 菌液量相同， 而方法3由于采用的是棉簽蘸取菌液， 菌液量無法定量控制， 得出的結(jié)果差異也就較大。實驗時還發(fā)現(xiàn)方法1和方法2菌液在平板上分布比較均勻， 方法3由于使用棉簽涂抹， 均勻性不如前兩種方法好。

2.3培養(yǎng)基體積對抑菌圈的影響

雖然標(biāo)準(zhǔn)中對培養(yǎng)基體積有規(guī)定， 但很多實驗人員在實驗時并未嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)所述規(guī)定， 而是根據(jù)經(jīng)驗進(jìn)行操作[11]。按照1.2.5中所述的方法1制作含菌瓊脂平板。向平板中加入1 mL濃度為1×108～5×108cfu/mL的菌液， 然后加入不同體積的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基體積對抑菌圈大小的影響的結(jié)果如圖4所示。

圖4　培養(yǎng)基體積對抑菌圈大小的影響Fig.4　Influence of the volume of ager medium on the size of the inhibition zone

由圖4可知， 隨著培養(yǎng)基體積的增加， 抑菌圈寬度逐漸減小。10 mL與15 mL結(jié)果間不存在顯著差異， 20 mL與25 mL結(jié)果間也不存在顯著性差異， 但是10 mL、 15 mL與20 mL、 25 mL之間卻存在非常顯著的差異。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是由于隨著培養(yǎng)基體積的改變， 厚度和含氧量都隨之變化。培養(yǎng)基體積越大， 厚度越大， 滲透到培養(yǎng)基底部的抗菌劑可能就越多， 從而表面的抗菌劑就較少， 抑菌圈也就較小。實驗人員進(jìn)行抗菌實驗操作時應(yīng)保證所用的培養(yǎng)基體積一致。

3　結(jié)論

本研究結(jié)果顯示細(xì)菌接種方式對實驗測試效果有一定的影響； 含菌瓊脂平板的制作方法會影響抗菌定性測試抑菌圈的大小， 操作時應(yīng)保證平板上的菌液量一致， 避免人為因素對實驗結(jié)果的影響； 培養(yǎng)基體積的多少與抑菌圈大小有一定的相關(guān)性， 隨著培養(yǎng)基體積的增加， 抑菌圈寬度反而減小， 實驗時應(yīng)保證所用培養(yǎng)基體積的一致。

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Influence of Operation Details on the Results of Antibacterial Experiment

ZHANG Qian, CHEN Xiaojie, WANG Lu, LAO Jihong

Key Laboratory of Textile Science and Technology, Ministry of Education,College of Textiles, Donghua University (Shanghai, 201620)

The influence of different bacterial inoculation methods on the results of antibacterial experiment was compared. The effects of different fabrication methods of ager plate containing bacterial and different volume of ager medium on the size of the inhibition zone was studied. Results showed that different bacterial inoculation methods had impacts on the results of antibacterial experiment. The fabrication methods of ager plate containing bacterial and the volume of ager medium had a certain correlation with the size of the inhibition zone.

antibacterial experiment, operation details, the inhibition zone

10.3969/j.issn.1674-1242.2016.01.002

高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新111計劃(B07024)

張倩，碩士，研究方向：抗菌紡織材料,

E-mail: zh901026@163.com

王璐，教授，博導(dǎo)，E-mail:wanglu@dhu.edu.cn

TS 101.4

A

1674-1242(2016)01-0006-04

-2015-10-14)