王琴飛，蔡　坤，林立銘，羊賢月，張振文*

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，國(guó)家薯類加工技術(shù)專業(yè)分中心，海南 儋州 571737）

木薯莖桿基質(zhì)比例對(duì)3 種食用菌海藻糖含量的影響

王琴飛，蔡坤，林立銘，羊賢月，張振文*

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，國(guó)家薯類加工技術(shù)專業(yè)分中心，海南 儋州 571737）

以木薯莖桿栽培的食用菌為試材，對(duì)海藻糖的提取方法和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射（high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD）檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，分析不同比例木薯莖稈栽培3 種食用菌（黑木耳、平菇、榆黃蘑）海藻糖含量。結(jié)果表明，食用菌中的海藻糖在80 ℃水浴60 min條件下可有效提取，最高含量達(dá)到190.5 mg/g；利用優(yōu)化后色譜條件分析標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中海藻糖，其分離效果均良好。并分析黑木耳、平菇和榆黃蘑中海藻糖含量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)栽培基質(zhì)的木薯莖稈比例為31.2%時(shí)，3 種食用菌海藻糖含量較高，分別為61.5、250.3 mg/g和15.0 mg/g。結(jié)果表明，HPLC-ELSD可分析3 種食用菌中海藻糖含量，方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、樣品穩(wěn)定性較好；3 種食用菌海藻糖含量與培養(yǎng)基質(zhì)中木薯莖稈比例有關(guān)，合適的木薯莖稈比例可提高食用菌中海藻糖含量。

木薯莖稈；食用菌；海藻糖；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射

木薯是三大薯類作物（馬鈴薯、番薯、木薯）之一，具有生物產(chǎn)量高，抗逆性強(qiáng)、耐貧瘠等優(yōu)點(diǎn)，是目前淀粉和生物能源生產(chǎn)的重要原料［1］。目前，人們主要是利用木薯地下塊根，而地上部分的木薯莖桿一直被人們認(rèn)為是采收后產(chǎn)生的廢棄物。研究者通過(guò)木薯莖桿直接粉碎還田可提高土壤肥力和提高鮮薯的產(chǎn)量，但利用率存在一定的局限性；也有研究人員將木薯?xiàng)U中纖維素水解后進(jìn)一步用于酒精、有機(jī)酸和抗生素的生產(chǎn)，但生產(chǎn)成本較高，很難得到廣泛的應(yīng)用［2］。木薯莖桿質(zhì)地疏松，經(jīng)檢測(cè)含粗蛋白5.1%、粗纖維23.3%、碳水化合物45.5%，適合用于栽培食用菌［3］。因此，研究者應(yīng)用木薯莖桿代替?zhèn)鹘y(tǒng)原料棉籽殼，成功的栽培出杏鮑菇［3］、秀珍菇［4］和金福菇［5］等，延長(zhǎng)了木薯行業(yè)的產(chǎn)業(yè)鏈，但研究?jī)H對(duì)栽培配方的進(jìn)行了比較，并未對(duì)食用菌中的功能性成分進(jìn)行分析。

食用菌富含蛋白質(zhì)，多種維生素，礦物質(zhì)和膳食纖維，被認(rèn)為是一種低熱量食物，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，大部分食用菌中都含有海藻糖，并且雙糖海藻糖是菇類風(fēng)味成分的組成之一［6］，在工業(yè)上常用于食物、生物材料和疫苗的低溫保鮮等，與生物抗逆耐受力具有直接關(guān)系［7-10］，在植物中可作為一種抗逆代謝產(chǎn)物存在并發(fā)揮作用［11-12］。檢測(cè)海藻糖的方法很多，有紙層析［13］、薄層層析［14］、氣相色譜法［15-16］、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［17］、蒽酮-硫酸比色法［18］和酶分析法［19］等，各種方法都存在一定的缺陷。其中紙層析、薄層層析、蒽酮-硫酸法分析靈敏度較低，操作繁瑣，雜質(zhì)干擾較大，準(zhǔn)確度和重復(fù)性較差以至于不能準(zhǔn)確定量。氣相色譜法需要衍生化后進(jìn)行分析，操作繁瑣。酶分析法成本較高，操作復(fù)雜。HPLC法是海藻糖和單糖等定性定量分析的常用手段［20］，但由于示差折光檢測(cè)器的靈敏度較低［21］，在食用菌中應(yīng)用較少，研究者常利用高效陰離子色譜-脈沖安培檢測(cè)法檢測(cè)食用菌中海藻糖和單糖的含量，能得到較好的結(jié)果［6，22］。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light scattering detector，ELSD）作為一種新型的通用型檢測(cè)器在HPLC上的應(yīng)用，使HPLCELSD快速測(cè)定食用菌中海藻糖及單糖含量成為可能。本研究以木薯莖稈栽培的食用菌為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)不同提取方法的比較，期望獲得食用菌中海藻糖的最佳提取條件，并在前人的研究基礎(chǔ)上，建立3 種食用菌中海藻糖含量的HPLC-ELSD方法，對(duì)不同比例木薯莖稈栽培的3 種食用菌中海藻糖進(jìn)行檢測(cè)評(píng)價(jià)，為木薯莖桿的綜合利用提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

木薯莖稈 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國(guó)家薯類加工技術(shù)研發(fā)分中心；平菇、榆黃蘑和黑木耳菌株，菌種來(lái)自于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)。

海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品（純度≥98%）、乙腈（色譜純）美國(guó)Sigma公司；超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）由Elix3+Synergy超純水系統(tǒng)制備。

1.2儀器與設(shè)備

1260型LC系統(tǒng)（配備四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、蒸發(fā)光檢測(cè)器和柱溫箱） 美國(guó)Agilent公司；Elix3+Synergy超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；KQ-400KDE超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司；HVE-50滅菌鍋日本Hirayama公司；HWS-26水浴鍋 上海一恒儀器設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1食用菌的培養(yǎng)

木薯莖稈收獲后，經(jīng)曬干、粉碎備用，使用前1 d重新翻曬一次。木薯莖桿與木屑按表1配方混勻，水的用量根據(jù)基料的濕度而定，基質(zhì)與水的比例為1∶1.2或1∶1.5（g/g），攪勻后再根據(jù)表1配方比例加入麥皮、石灰、石膏后，再按基質(zhì)與水1∶0.5比例加水?dāng)噭?，使基料含水量為?8±2）%（手輕捏培養(yǎng)料有水滲出，但不外滴為準(zhǔn)），裝袋，滅菌。將滅菌后的培養(yǎng)袋和接種工具放入超凈工作臺(tái)分別接種。接種后根據(jù)牛長(zhǎng)滿［23］的方法進(jìn)行發(fā)菌、培養(yǎng)和采收。采收后先自然晾干，再用烘箱70 ℃烘干至恒質(zhì)量，利用植物樣品粉碎機(jī)粉碎，并過(guò)100 目鋼篩，于4～8 ℃保存?zhèn)溆?。食用菌栽培基質(zhì)配方見(jiàn)表1。

表1　食用菌栽培基質(zhì)配方Table1　Substrate formulations for cultivating edible fungi%

1.3.2海藻糖的提取與檢測(cè)

提取條件：分別稱取3 種食用菌樣品粉末0.100 g于50 mL離心管，加25 mL去離子水，混勻，在恒溫水浴鍋中加熱提取60 min（溫度80 ℃）。提取后放入4 ℃冰箱，待冷卻后12 000×g離心20 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液用于HPLC分析。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

色譜條件：COSMOSIL Sugar-D色譜柱（4.6mm× 250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為乙腈-水（70∶30，V/V）溶液，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；漂移管溫度85 ℃；霧化溫度70 ℃；氣流速率1.6 L/min；分析時(shí)間10 min；以外標(biāo)法計(jì)算試樣中海藻糖的含量。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確稱取0.100 g海藻糖，用體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶液溶解并定容到100.0 mL，配制成10.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和制圖，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1海藻糖檢測(cè)方法的優(yōu)化

參照文獻(xiàn)［24］方法，根據(jù)流動(dòng)相的種類和比例，首先設(shè)定漂移管溫度為80 ℃，氮?dú)饬魉贋?.0 L/min。保持氣速不變，用100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液進(jìn)樣，在70～95 ℃范圍內(nèi)改變漂移管溫度，觀察信號(hào)基線水平和噪音，信噪比呈先降低后升高的趨勢(shì)，基線都較平穩(wěn)，當(dāng)漂移管溫度為85 ℃時(shí)，流動(dòng)相基本揮發(fā)，信噪比最低。固定漂移管溫度為85 ℃，觀察1.4～2.0 L/min不同氮?dú)饬魉贂r(shí)海藻糖的信號(hào)強(qiáng)度，1.6 L/min為在較小噪音水平上，產(chǎn)生最大檢測(cè)響應(yīng)值的最低氣速。故選定漂移管溫度85 ℃，氮?dú)饬魉?.6 L/min。以優(yōu)化的檢測(cè)條件，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的海藻糖進(jìn)行分析，如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)品種中海藻糖的保留時(shí)間為6.976 min，樣品中保留時(shí)間為7.976 min，保留時(shí)間一致。標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品中峰形較好，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)樣品（A）和樣品（B）海藻糖HPLC圖Fig.1　HPLC-ELSD chromatograms of trehalose standard （A） and real sample （B）

2.2海藻糖提取條件的優(yōu)化

通過(guò)不同時(shí)間80 ℃水浴和超聲處理（超聲溫度40～60 ℃，超聲頻率3 200 kHz）提取比較發(fā)現(xiàn)，在相同的時(shí)間內(nèi)（1 h），80 ℃水浴提取效率更高，海藻糖含量達(dá)到了190.5 mg/g，比超聲提取提高了53.2 mg/g。從圖2a可以看出，在水浴提取的過(guò)程中，海藻糖含量在不斷增加，以水浴60 min和120 min時(shí)提取效果最佳，含量分別達(dá)到了190.5 mg/g和193.8 mg/g，在此期間海藻糖含量變化不顯著；雖然30 min時(shí)海藻糖含量與60 min最高含量差異不顯著，但與120 min相比卻達(dá)到了顯著水平，兩者相差5.5 mg/g，結(jié)果表明，水浴60～120 min時(shí)是海藻糖提取的最佳時(shí)間段；由圖2b可知，隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)海藻糖含量增加，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，超聲提取溫度會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，溫度從30 ℃升高到50 ℃，溫度很難控制，由此可知，海藻糖的提取可能與溫度有關(guān)。因此，選擇水浴60 min提取，可以較好地控制提取溫度和有效提取海藻糖。

圖2　80 ℃水?。╝）和超聲處理（b）對(duì)樣品中海藻糖含量的影響Fig.2　Effects of hot water bath extraction at 80 ℃ （a） and ultrasonic extraction （b） on trehalose contents in samples

2.3HPLC-ELSD檢測(cè)方法的驗(yàn)證

2.3.1線性關(guān)系、檢出限和定量限考察

用體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶液稀釋海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成5～200 mg/L的5 個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.3.2節(jié)色譜條件下，依次進(jìn)樣10 μL，根據(jù)ELSD測(cè)得的峰面積（Y）與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（X，mg/L）進(jìn)行線性回歸，發(fā)現(xiàn)線性很差。參照文獻(xiàn)［25］方法，以海藻糖質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)（lgX）與ELSD測(cè)得的峰面積的對(duì)數(shù)（lgY）進(jìn)行線性回歸分析，得到回歸方程為lgY=1.330 4lgX-0.010，兩者間存在著良好的線性關(guān)系，海藻糖的線性相關(guān)性系數(shù)（R2）達(dá)到了0.999 7。將最小濃質(zhì)量度的標(biāo)準(zhǔn)溶液再逐級(jí)稀釋，依次進(jìn)樣10 μL，計(jì)算3 倍信噪比和10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，以確定檢出限和定量限，海藻糖檢出限為0.06 mg/L，定量限為0.15 mg/L。

2.3.2儀器精密度、樣品穩(wěn)定性結(jié)果

以100 mg/L海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次進(jìn)樣體積為10 μL，按照上述色譜條件進(jìn)行分離檢測(cè)，計(jì)算峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），考察儀器的精密度，海藻糖的峰面積分別為422.7、394.3、392.6、387.5、422.7、404.0，RSD為3.8%，證明儀器精密度較好；取任意一樣品溶液，每隔1 h進(jìn)樣1 次，按照色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算6 h內(nèi)樣品中海藻糖的含量，其海藻糖含量分別為218.2、216.1、215.6、208.6、208.7、208.9 mg/g，RSD為2.1%，表明樣品在6 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.3回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取1.3.1節(jié)獲得的食用菌樣品12 份，每個(gè)樣品0.100 g，取9 個(gè)樣品加入25 mL水后，分別加入3 個(gè)質(zhì)量濃度梯度的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；另外3 個(gè)樣品不加入海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品作為對(duì)照。所有樣品按照1.3.2節(jié)過(guò)程提取樣品中的海藻糖，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每梯度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。樣品中海藻糖的平均回收率為97.4%，RSD為0.7%。結(jié)果見(jiàn)表2，樣品中海藻糖加標(biāo)回收率較好，方法準(zhǔn)確度較高，可用于實(shí)際樣品的測(cè)定。

表2　方法的回收率結(jié)果Table2　Recovery of the method

2.4木薯莖稈培養(yǎng)的食用菌中海藻糖含量測(cè)定

利用實(shí)驗(yàn)中建立的海藻糖的提取和檢測(cè)方法，對(duì)1.3.1節(jié)中不同木薯莖稈作為基質(zhì)培養(yǎng)的3 種食用菌中海藻糖的含量進(jìn)行分析。由表3可知，3 種食用菌中都含有海藻糖，其中以平菇中海藻糖含量最高，含量達(dá)到了250.3 mg/g，榆黃蘑中含量最低，含量為16.6 mg/g；通過(guò)顯著性分析可知，木薯莖稈比例為31.2%時(shí)，栽培的黑木耳、平菇和榆黃蘑的海藻糖含量最佳，分別為61.5、250.3 mg/g和15.0 mg/g，黑木耳和榆黃蘑與其他比例木薯莖稈栽培的含量達(dá)到顯著差異；榆黃蘑在木薯莖稈比例分別為15.6%、31.2%、62.4%和78.0%時(shí)，海藻糖含量差異不顯著，但與未使用木薯莖稈栽培基質(zhì)相比，有顯著差異。由此可知，栽培基質(zhì)可影響食用菌中海藻糖含量，選擇合適的木薯莖稈比例，可以提高食用菌中海藻糖的含量。

表3　不同比例木薯莖稈栽培對(duì)3 種食用菌中海藻糖含量的影響Table3　Effect of cultivation with different ratios of cassava stalk on trehalose contents in three edible fungi

3　討論與結(jié)論

HPLC法檢測(cè)樣品中單糖或多糖，通常用糖分析柱、氨基鍵合柱或C18柱作固定相，以乙腈和水的混合溶劑或純水為流動(dòng)相來(lái)分析，氨基柱在分析的過(guò)程中需要在水中加入0.1% NH4OH，而C18柱在水相中穩(wěn)定性較差，因此，實(shí)驗(yàn)采用糖分析柱，并且，糖分析色譜柱在海藻糖的測(cè)定已得到廣泛的應(yīng)用［26-27］。在利用HPLC-ELSD進(jìn)行糖分析時(shí)，全部柱流出物都進(jìn)入ELSD的漂移管，讓流動(dòng)相在其中蒸發(fā)，如果采用純水做流動(dòng)相，ELSD就必須采用較高的漂移管溫度和較大的霧化器載氣流速才能有利于蒸發(fā)，這使得ELSD檢測(cè)的峰面積減小，降低了靈敏度。故本實(shí)驗(yàn)采用沸點(diǎn)較低的乙腈為流動(dòng)相。

文獻(xiàn)［22］報(bào)道，常溫很難讓海藻糖從細(xì)胞壁上解離，海藻糖的提取溫度一般都在60～80 ℃，在提取方法優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，水浴和超聲都可以提高海藻糖的含量，但是超聲提取溫度會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，溫度很難控制，提取60 min可使溫度從30 ℃提高到50 ℃，海藻糖提取含量也未達(dá)到最高。在劉海燕等［22］的研究結(jié)果表明，溫度可影響海藻糖的提取率，為了提取效果達(dá)到一致性，實(shí)驗(yàn)選擇80 ℃水浴提取3 種食用菌中海藻糖。在進(jìn)行海藻糖定量分析中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)ELSD測(cè)得的峰面積與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，發(fā)現(xiàn)線性很差，而海藻糖質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù)與ELSD測(cè)得的峰面積的自然對(duì)數(shù)進(jìn)行線性回歸分析，兩者間才能得到良好的線性關(guān)系，結(jié)果與文獻(xiàn)［25］報(bào)道一致。

通過(guò)分析不同比例木薯莖稈栽培的3 種食用菌中海藻糖，黑木耳、平菇和榆黃蘑中的海藻糖含量豐富，以海藻糖的最高值相比，黑木耳占干樣的百分比達(dá)到了6.2%，比文獻(xiàn)［6］報(bào)道的有明顯提高。海藻糖含量呈現(xiàn)平菇＞黑木耳＞榆黃蘑的趨勢(shì)；并且海藻糖含量的高低與食用菌的種類及培養(yǎng)基質(zhì)比例有直接關(guān)系。結(jié)果表明，木薯莖稈比例為31.2%時(shí)，平菇、榆黃蘑和黑木耳中海藻糖含量較高，但從文獻(xiàn)［28］報(bào)道發(fā)現(xiàn)，木薯莖稈在栽培杏鮑菇金福菇［5］和秀珍菇［4］時(shí)，栽培的最佳配方中木薯莖稈基質(zhì)的比例分別為80%、83%和45%，證明不同的食用菌使用的比例不同。因此，在提高食用菌中海藻糖含量的同時(shí)，還應(yīng)保證食用菌的出菇率，分析食用菌中氨基酸、維生素和其他的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)，才能綜合評(píng)價(jià)木薯莖稈栽培3 種食用菌的最佳比例。

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Effect of Cassava Stalk Substrate Ratio on Trehalose Content in Three Cultivated Edible Fungi

WANG Qinfei， CAI Kun， LIN Liming， YANG Xianyue， ZHANG Zhenwen*
（National R&D Centre for Patato Processing， Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou 571737， China）

In this study， an optimized method using high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector （HPLC-ELSD） was developed for detecting trehalose extracted from three edible fungi including Auricularia auricula-judae， Pleurotus ostreatus， and Pleurotus citrinopileatus Sing.， which were cultivated on mixed substrates containing assava （Manihot esculenta） stalk. The relationship between trehalose content and cassava stalk proportion was explored. The results indicated that the trehalose in edible fungi could be completely extracted in 80 ℃ water bath in 60 minutes， and the maximum yield of trehalose could reach 190.5 mg/g. Under the optimized chromatographic conditions，good separation of trehalose and maximum contents of trehalose were obtained from edible fungi cultivated on a substrate with 31.2% cassava stalk， which were 61.5， 250.3 and 15.0 mg/g for Auricularia auricula-judae， Pleurotus ostreatus，and Pleurotus citrinopileatus Sing.， respectively. This study has demonstrated that the trehalose content of edible fungi can be accurately and conveniently determined by HPLC-ELSD. In addition， the trehalose contents of A. auricula-judae，P. ostreatus and P. citrinopileatus can be significantly improved by cultivating them on a substrate with a proper ratio of cassava stalk.

cassava stalk； edible fungi； trehalose； high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector （HPLC-ELSD）

10.7506/spkx1002-6630-201618017

S533

A

1002-6630（2016）18-0102-05

王琴飛， 蔡坤， 林立銘， 等. 木薯莖桿基質(zhì)比例對(duì)3 種食用菌海藻糖含量的影響［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（18）: 102-106. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618017. http://www.spkx.net.cn

WANG Qinfei， CAI Kun， LIN Liming， et al. Effect of cassava stalk substrate ratio on trehalose content in three cultivated edible fungi［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 102-106. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618017. http://www.spkx.net.cn

2015-12-20

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-12）

王琴飛（1982—），女，助理研究員，碩士，主要從事木薯功能物質(zhì)分離與鑒定研究。E-mail：wangqf508@163.com

張振文（1975—），男，副研究員，博士，主要從事木薯采后處理與加工研究。E-mail：scuta96@163.com