馬艷弘，劉照亭，李亞輝，張宏志，黃開(kāi)紅

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 句容 212400）

藍(lán)莓酒泥粗提物的制備及其生物活性

馬艷弘1，2，劉照亭3，李亞輝1，張宏志1，黃開(kāi)紅1

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 句容 212400）

采用超聲波輔助酶法提取制備藍(lán)莓酒泥粗提物，研究粗提物的制備工藝并分析粗提物的抗氧化性及其對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝，檢測(cè)粗提物對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、·OH的清除能力，并通過(guò)四甲基偶氮唑藍(lán)增殖實(shí)驗(yàn)、Hoechst33258熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)研究其對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖與凋亡的影響。結(jié)果表明：制備藍(lán)莓酒泥粗提物的最佳超聲條件為超聲功率500 W、料液比1∶20（g/mL）、超聲時(shí)間50 min、提取溫度60 ℃，在此條件下多糖和花色苷的提取量分別為14.24 mg/g和6.13 mg/g。所制備的藍(lán)莓酒泥粗提物對(duì)DPPH自由基和·OH具有一定的清除效果，并可顯著抑制HSC-T6細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡，且在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出劑量-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，表明藍(lán)莓酒泥粗提物具有良好的抗氧化活性，并對(duì)HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，具有潛在的抗肝纖維化能力。通過(guò)誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡是藍(lán)莓酒泥粗提物抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用途徑之一。

藍(lán)莓酒泥；制備；抗氧化；肝星狀細(xì)胞HSC-T6

藍(lán)莓屬杜鵑花科（Ericaceae）、越橘屬（Vaccinium spp.）植物，是21世紀(jì)功能性保健漿果，富含花青素、黃烷醇、酚酸等多種活性物質(zhì)［1-2］，有抗輻射、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗氧化、抗炎、抗衰老、保護(hù)視力、軟化血管等多種藥理保健功能［3-7］，堪稱世界水果之王［8］，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景。隨著人們對(duì)藍(lán)莓藥理保健功能的認(rèn)識(shí)，以藍(lán)莓為原料的各種保健食品受到越來(lái)越多消費(fèi)者的青睞。其中藍(lán)莓酒因其營(yíng)養(yǎng)豐富、酒體醇厚、色澤艷麗、口味綿長(zhǎng)、香氣宜人等特點(diǎn)而備受推崇［9］。

藍(lán)莓酒泥為藍(lán)莓酒釀造過(guò)程中沉積于罐底的廢棄物，約占藍(lán)莓酒產(chǎn)量的20%左右。據(jù)報(bào)道［10-12］，酒泥中富含花青素、酵母多糖、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、多酚等多種功能因子，具有很強(qiáng)的生物保健功能。但是目前80%的藍(lán)莓酒泥直接排放，既容易造成環(huán)境污染又是對(duì)資源的極度浪費(fèi)。隨著藍(lán)莓酒銷量的不斷提高，酒泥的產(chǎn)量也逐年增高，其開(kāi)發(fā)利用已成為人們普遍關(guān)注的社會(huì)熱點(diǎn)問(wèn)題。明確其活性成分及生物功能對(duì)開(kāi)發(fā)藍(lán)莓酒泥功能食品具有重要意義。但目前有關(guān)藍(lán)莓酒泥活性物質(zhì)的高效制備與功能分析及其保健食品研發(fā)等方面的研究仍鮮見(jiàn)報(bào)道。

我國(guó)是肝病高發(fā)國(guó)家，有2 000多萬(wàn)的人群需要得到抗纖維化治療，而通過(guò)食療預(yù)防和治療肝纖維化已經(jīng)成為廣大學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，氧化應(yīng)激與肝纖維化密切相關(guān)［13］，具有抗氧化活性的植物多糖和花青素均存在潛在的抗肝纖維化能力［14-15］，且多糖與多糖、多糖與酚類、黃酮等物質(zhì)在抗氧化、抗腫瘤、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等方面具有協(xié)同增效作用［16-18］。因藍(lán)莓酒泥中含有具有抗氧化活性的花色苷、多糖等物質(zhì)，而肝星狀細(xì)胞又為肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，抑制其增殖并誘導(dǎo)其凋亡有利于肝纖維化的預(yù)防和治療［15，19］，因此本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助技術(shù)聯(lián)合酶解工藝制備同時(shí)含有藍(lán)莓花色苷和多糖的藍(lán)莓酒泥粗提物，探討其抗氧化活性，并以大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6為模型，研究其對(duì)HSC-T6增殖、凋亡的影響，為降低釀酒副產(chǎn)物造成的環(huán)境污染，開(kāi)發(fā)抗肝纖維化功能食品、提高藍(lán)莓酒泥綜合利用率提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

藍(lán)莓酒酒泥（兔眼藍(lán)莓為原料的干紅藍(lán)莓酒釀造副產(chǎn)物） 江蘇省句容萬(wàn)山紅遍生物科技有限公司。

細(xì)胞株HSC-T6 上海拜力生物工程有限公司。

果膠酶HC（LALLZYME HC） 上海杰兔商貿(mào)有限公司；纖維素酶 寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海源葉生物科技有限公司；·OH測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；胎牛血清、PRMI 1640完全培養(yǎng)基 美國(guó)Gbico公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、0.25%胰蛋白酶 美國(guó)Hyclone公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（methylthiazoletetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO） 美國(guó)Sigma公司；Hoechst33258染色液 碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒 美國(guó)BD公司；無(wú)水乙醇、檸檬酸、鹽酸、氯化鉀、醋酸鈉等均為分析純?cè)噭?/p>

1.2儀器與設(shè)備

KH-500E超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；FDU-1200型冷凍干燥機(jī) 日本東京理化器械株式會(huì)社；RE-5220型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器；Epoch微孔板分光光度計(jì) 美國(guó)Bio Tek公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo Scientific公司；IX53倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；BHC-1300IIA/B2型生物潔凈安全柜 蘇州凈化設(shè)備有限公司；TDL-80-2C低速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；MH-2微量振蕩器其林貝爾公司；流失細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司。

1.3方法

1.3.1藍(lán)莓酒泥粗提物的制備

取藍(lán)莓酒泥，3 000 r/min離心20 min，將沉淀真空冷凍干燥，粉碎，過(guò)80 目篩，稱取5 g藍(lán)莓酒泥凍干粉末，按照一定的固液比（g/mL）加水混合，再添加占干粉質(zhì)量0.05%的果膠酶HC和0.4%的纖維素酶，混合均勻后用1%的檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3，置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，在超聲功率500 W條件下、超聲輔助提取不同時(shí)間，再于不同溫度條件下靜置提取1 h，然后離心過(guò)濾，濾渣再提取1 次，合并濾液，減壓旋蒸濃縮后，再冷凍干燥即可得藍(lán)莓酒泥粗提物。

1.3.2藍(lán)莓酒泥花色苷和多糖含量的測(cè)定

多糖含量采用苯酚-硫酸法測(cè)定。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所得線性回歸方程為：C=0.997A-0.000 7，R2=0.999 1，式中，C為葡萄糖質(zhì)量濃度，A為吸光度。據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品多糖提取量。

花色苷含量采用pH示差法測(cè)定［20］。花青素提取量計(jì)算見(jiàn)公式（1）、（2）：

式中：C為花色苷提取量/（mg/g）；V為提取液總體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；Mr為矢車(chē)菊蘇-3-葡萄糖苷相對(duì)分子質(zhì)量，449.2；ε為矢車(chē)菊蘇-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900 L/moL；m為樣品質(zhì)量/g；l為光程，1 cm。

1.3.3藍(lán)莓酒泥粗提物制備工藝單因素試驗(yàn)

以藍(lán)莓花色苷和多糖提取量為考察目標(biāo)，分別考察500 W超聲功率條件下不同料液比和超聲時(shí)間以及提取溫度對(duì)藍(lán)莓酒泥粗提物制備的影響。

表1　單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table1　One-factor-at-a-time design

1.3.4藍(lán)莓酒泥粗提物制備工藝正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以料液比、超聲時(shí)間、提取溫度為因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以多糖提取量和花色苷提取量為考察指標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化藍(lán)莓酒泥粗提物制備工藝，其因素水平見(jiàn)表2。

表2　L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平Table2　Factors and their coded levels used for orthogonal array design

1.3.5體外抗氧化能力檢測(cè)

1.3.5.1DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照Atoui等［21］的測(cè)定方法。配制不同質(zhì)量濃度的藍(lán)莓酒泥粗提物溶液，各取2 mL于刻度試管，每管加2×10-4mol/L DPPH溶液2 mL，搖勻后避光放置30 min，取上清液，測(cè)定517 nm波長(zhǎng)處的吸光度。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。DPPH自由基清除率計(jì)算見(jiàn)公式（3）：

式中：A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；A2為對(duì)照組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.5.2·OH清除能力測(cè)定

分別取500 μL不同質(zhì)量濃度的藍(lán)莓酒泥粗提物水溶液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。其呈色與·OH的多少呈正比關(guān)系，即吸光度越小，樣品對(duì)·OH的清除能力越強(qiáng)?！H抑制能力計(jì)算見(jiàn)公式（4）：

1.3.6HSC-T6細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定

采用MTT比色法進(jìn)行測(cè)定［22］。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整其密度為5×104個(gè)/mL，接種于96 孔板恒溫培養(yǎng)24 h，再換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育12 h，再加入藍(lán)莓酒泥粗提物，使其終質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200、 250 μg/mL，待干預(yù)24、48、72 h后，每孔加入20 μL的MTT（5 mg/mL）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去上清液，再加入150 μL DMSO，待結(jié)晶物充分溶解后用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度。重復(fù)3 次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和抑制率為50%時(shí)的粗提物濃度，即IC50值。細(xì)胞增殖抑制率見(jiàn)式（5）：

1.3.7Hoechst33258染色觀察HSC-T6細(xì)胞形態(tài)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，PRMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，每孔200 μL接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h后換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育12 h，再加入藍(lán)莓酒泥粗提物刺激，使終質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200、250 μg/mL，24 h后棄上清液，加入150 μL固定液固定，清洗，Hoechst33258染色液染色后，于熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.8流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，用PRMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/mL，每孔2 mL接種于6 孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待細(xì)胞貼壁后換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育12 h，再分別加入含不同質(zhì)量濃度（50、100、150、200、250 μg/mL）的藍(lán)莓酒泥提取物的培養(yǎng)液各2 mL，以PRMI 1640培養(yǎng)液為空白對(duì)照，培養(yǎng)24 h；24 h后棄上清液，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，使用預(yù)冷PBS清洗2 次，1000 r/min離心5 min，去上清液，按照Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒操作指南處理后立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 18.0和Design-Expert V 8.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理即統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1粗提物制備工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1　料液比對(duì)藍(lán)莓酒泥花色苷和多糖提取量的影響Fig.1　Effect of solid/liquid ratio on the extraction rates of anthocyanins and polysaccharides from blueberry wine lees

2.1.1料液比對(duì)藍(lán)莓酒泥粗提物花色苷與多糖提取量的影響由圖1可知，多糖和花色苷提取量隨料液比的升高而大幅升高，但當(dāng)料液比達(dá)到1∶30（g/mL）后，繼續(xù)增大提取液體積，花色苷和多糖的溶出量增加緩慢而逐漸趨于平緩?？梢?jiàn)提取液越多，物質(zhì)的傳質(zhì)推動(dòng)力越大，越有利于物質(zhì)的浸出。但料液比達(dá)到一定值后，絕大部分花色苷與多糖物質(zhì)已經(jīng)溶出，繼續(xù)增大溶劑量，提取量不僅不會(huì)顯著提高，而且還會(huì)增大后續(xù)濃縮的難度，因此1∶30左右為制備藍(lán)莓酒泥粗提物的最佳料液比。

2.1.2超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)莓酒泥粗提物花色苷與多糖提取量的影響

圖2　超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)莓酒泥花色苷和多糖提取量的影響Fig.2　Effect of ultrasonication time on the extraction rates of anthocyanins and polysaccharides from blueberry wine lees

由圖2可見(jiàn)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，粗提物中多糖和花色苷的提取量均增大，花色苷提取量在超聲時(shí)間大于40 min后基本平緩，而多糖提取量在超聲時(shí)間大于50 min后增加速度已相對(duì)變緩。綜合考慮將50 min左右作為制備藍(lán)莓酒泥粗提物的適宜超聲時(shí)間。

2.1.3提取溫度對(duì)藍(lán)莓酒泥粗提物花色苷與多糖提取量的影響

圖3　提取溫度對(duì)藍(lán)莓酒泥花色苷和多糖提取量的影響Fig.3　Effect of extract temperature on the extraction rates of anthocyanins and polysaccharides from blueberry wine lees

由圖3可見(jiàn)，小于60 ℃溫度范圍內(nèi)多糖和花色苷提取量均隨著提取溫度的升高而提高，提取溫度大于60 ℃后，多糖提取量逐漸趨于平緩而花色苷的提取量開(kāi)始下降。原因是溫度過(guò)高導(dǎo)致了少部分花色苷結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得提取量下降，因此綜合比較可選60 ℃為藍(lán)莓酒泥粗提取的制備溫度，此溫度條件下藍(lán)莓酒泥粗提物中的多糖和花色苷含量均較高。

2.2粗提物制備工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

表3　L49（3）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3　L49（3） orthogonal array arrangement and experimental results

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)一步優(yōu)化藍(lán)莓酒泥粗提物制備工藝。由表3極差分析結(jié)果可見(jiàn)：影響多糖提取量的主要因素是B（超聲時(shí)間）和C（提取溫度），其次是A（料液比），各因素對(duì)多糖提取率影響的主次順次是B=C＞A，最優(yōu)組合為A3B2C3；影響花色苷提取量的主要因素是B（超聲時(shí)間），其次是C（提取溫度），A（料液比）的影響最小，各因素對(duì)花色苷提取量影響的主次順次是B＞C＞A，最優(yōu)組合為A2B2C2。

因2 個(gè)組合均不在正交表安排的試驗(yàn)中，故需按照上述工藝條件對(duì)2 個(gè)組合平行做3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并以未進(jìn)行超聲提取但其他條件相同的處理為對(duì)照，測(cè)定藍(lán)莓酒泥中多糖和花色苷的提取量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未經(jīng)超聲處理的對(duì)照組多糖提取量為12.66 mg/g，花色苷提取量為4.87 mg/g，按照A2B2C2組合進(jìn)行提取時(shí)，多糖和花色苷的提取量均最高，分別達(dá)14.28 mg/g和6.16 mg/g，該結(jié)果與表3中的2號(hào)組合A1B2C2的多糖提取量為14.24 mg/g、花色苷提取量為6.13 mg/g并無(wú)顯著差異，考慮到料液比過(guò)大會(huì)增加后續(xù)濃縮成本，從經(jīng)濟(jì)節(jié)能的角度綜合考慮，確定將A1B2C2確定為最佳組合。在此條件下制備的藍(lán)莓酒泥粗提物，比未進(jìn)行超聲處理的多糖和花色苷提取量分別提高了12.48%和25.87%。

2.3藍(lán)莓酒泥粗提物抗氧化活性分析

2.3.1藍(lán)莓酒泥粗提物的DPPH自由基清除能力

由圖4可知，藍(lán)莓酒泥粗提物對(duì)DPPH自由基具有一定的清除作用，且隨著質(zhì)量濃度的提高，DPPH自由基清除率不斷提高，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)160 μg/mL時(shí)，其自由基清除率達(dá)80.54%，但其效果弱于陽(yáng)性對(duì)照VC。

圖4　粗提物的DPPH自由基清除能力Fig.4　DPPH radical scavenging capacity of crude extract from blueberry wine lees

2.3.2藍(lán)莓酒泥粗提物的·OH清除能力

圖5　粗提物的·OH清除能力Fig.5　Hydroxyl radical scavenging capacity of crude extract from blueberry wine lees

由圖5可知，藍(lán)莓酒泥粗提物對(duì)·OH清除作用較強(qiáng)，且隨著質(zhì)量濃度的提高，·OH清除率不斷提高，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)160 μg/mL時(shí)，·OH清除率達(dá)82.07%，與相同質(zhì)量濃度的陽(yáng)性對(duì)照VC的·OH清除率85.37%相比并無(wú)明顯差異。

2.4藍(lán)莓酒泥粗提物對(duì)HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

圖6　粗提物對(duì)HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用Fig.6　Inhibitory effect of crude extract from blueberry wine lees on HSC-T6 cells

如圖6所示，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：50、100、150、200、250 μg/mL的藍(lán)莓酒泥提取物均能抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，且在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)一定的劑量-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。在24、48、72 h時(shí)，粗提物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別達(dá)19.34%～67.66%、32.59%～84.37%、47.91%～91.49%，細(xì)胞的IC50分別為165.23、142.34、67.57 μg/mL。

2.5藍(lán)莓酒泥粗提物對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

圖7　細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果（×100）Fig.7　Morphological observation of cells challenged for 24 h with the crude extract （× 100）

2.5.1熒光染色結(jié)果細(xì)胞經(jīng)Hoechst33258染色后，熒光顯微鏡下觀察

HSC-T6經(jīng)不同質(zhì)量濃度藍(lán)莓酒泥粗提物刺激24 h后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，由圖7可知，對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)均一，發(fā)出均勻淡藍(lán)色熒光（圖7未顯示顏色），為正?；罴?xì)胞。而各加藥組部分細(xì)胞著色不均勻呈致密濃染、或出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、斷裂等典型凋亡特征。且隨著粗提物質(zhì)量濃度增大，貼壁細(xì)胞逐漸減少、顏色發(fā)白的凋亡細(xì)胞數(shù)量增加?？梢?jiàn)，藍(lán)莓酒泥粗提物會(huì)誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。

2.5.2細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果

圖8　藍(lán)莓酒泥提取物對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡率的影響Fig.8　Effect of crude extract from blueberry wine lees on apoptosis rates of HSC-T6 cells

由圖8可知，藍(lán)莓酒泥粗提物可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，隨著提取物質(zhì)量濃度的增大，細(xì)胞凋亡率逐漸上升，細(xì)胞在藍(lán)莓酒泥提取物質(zhì)量濃度為50、100、150、200、250 μg/mL的（PRMI 1640培養(yǎng)液）環(huán)境中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞的凋亡率分別達(dá)14.23%、19.44%、30.98%、49.31%、65.32%，與沒(méi)有添加藍(lán)莓酒泥粗提物的對(duì)照相凋亡率7.96%相比，均有顯著提高。

圖9　藍(lán)莓酒泥提取物對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的熒光染色觀察Fig.9　Apotosis induction in HSC-T6 cells by crude extract from blueberry wine lees observed by fluorescence staining

圖9熒光染色觀察結(jié)果與細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果顯示，藍(lán)莓酒泥粗提物可通過(guò)誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡來(lái)抑制其細(xì)胞增殖。

3　結(jié) 論

近年來(lái)超聲波輔助提取技術(shù)因其可有效破碎植物細(xì)胞壁，具有活性物質(zhì)溶出快、操作簡(jiǎn)便、提取時(shí)間短、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)在活性物質(zhì)提取中得到了廣泛應(yīng)用［23-25］。本實(shí)驗(yàn)受中藥多維組合藥物可協(xié)同發(fā)揮療效的啟發(fā)，改變了以往單獨(dú)提取花色苷或多糖等單一組分的思路，采用酶法超聲輔助法制備同時(shí)具有花色苷和多糖的藍(lán)莓酒泥粗提物，并通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝，結(jié)果表明各因素對(duì)粗提物制備工藝的影響主次順序依次為超聲時(shí)間＞提物溫度＞料液比；最佳制備工藝為：按料液比1∶20混合，再添加占干粉質(zhì)量0.05%的果膠酶HC和0.4%的纖維素酶，用1%的檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3，于超聲功率500 W條件下超聲提取時(shí)間50 min、超聲提取后于60 ℃條件下避光提取1 h，連續(xù)提取2 次。在此條件下藍(lán)莓花色苷含量提取量達(dá)6.13 mg/g，多糖提取量達(dá)14.24 mg/g。

肝纖維化是危害人類健康的重要肝臟疾病，近年來(lái)其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)升高，但迄今為止，仍然沒(méi)有滿意的治療方法。大量研究［26-27］表明，自由基損傷是肝纖維化的重要發(fā)病機(jī)制之一?？寡趸瘎┠芡ㄟ^(guò)提高SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等抗氧化酶活性從而有效降低自由基對(duì)機(jī)體造成的氧化損傷，抑制肝臟中膠原的合成與分泌，減緩或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程。因此探尋安全高效的抗氧化劑是治療、預(yù)防肝纖維化的重要途徑。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外抗氧化活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所制備的藍(lán)莓酒泥粗提物具有明顯自由基清除能力。質(zhì)量濃度為160 μg/mL藍(lán)莓酒泥粗提物對(duì)DPPH自由基和·OH的清除能力分別達(dá)80.54%和82.07%，尤其是其對(duì)·OH的清除能力幾乎與VC的·OH清除能力相差無(wú)幾。預(yù)示著藍(lán)莓酒泥提取物具有較高的抗氧化活性，可能在肝纖維化的防治中發(fā)揮重要作用。

肝星狀細(xì)胞的激活、增殖、分泌大量膠原被認(rèn)為是肝纖維化病理機(jī)制的中心環(huán)節(jié)［28-29］。抑制肝星狀細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡通常會(huì)作為預(yù)防治療肝纖維化的首選策略［30-31］。為了評(píng)價(jià)藍(lán)莓酒泥粗提物對(duì)肝纖維化化的防治效果，本實(shí)驗(yàn)以活化的大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6為模型，分析了其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該藍(lán)莓酒泥粗提物還能顯著抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖，在24、48、72 h時(shí)，在50～250 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，抑制率呈現(xiàn)明顯的劑量-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系；藍(lán)莓酒泥粗提物作用于細(xì)胞的IC50分別為165.23、142.34、67.57 μg/mL。Hoechst33258染色結(jié)果與細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果顯示，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是藍(lán)莓酒泥粗提物抑制HSC-T6細(xì)胞增殖的作用途徑之一。但其具體的作用機(jī)制仍需要繼續(xù)深入研究。

綜上所述，藍(lán)莓酒泥粗提物具有一定的抗氧化能力，其在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，能有效抑制肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖，本實(shí)驗(yàn)以藍(lán)莓酒泥為原料制備同時(shí)含有藍(lán)莓花色苷和活性多糖的藍(lán)莓酒泥粗提物，為藍(lán)莓酒泥的開(kāi)發(fā)利用提供了一條新的技術(shù)途徑。制備藍(lán)莓酒泥粗提物，既可為藍(lán)莓酒加工副產(chǎn)物的高值化利用提供一條新的途徑，又能為抗肝纖維化保健食品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供新的原料來(lái)源。

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Preparation and Biological Activities of Crude Extract from Blueberry Wine Lees

MA Yanhong1，2， LIU Zhaoting3， LI Yahui1， ZHANG Hongzhi1， HUANG Kaihong1
（1. Institute of Agricultural Products Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China；2. State Key Laboratory of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China；3. Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences in Jiangsu Hilly Areas， Jurong 212400， China）

The study focused on the preparation of crude extract from blueberry wine lees by ultrasound-assisted enzymatic extraction. The antioxidant activity and growth inhibitory effect on HSC-T6 cells of the crude extract on were also evaluated. The optimization of the extraction conditions was performed using one-factor-at-a-time and orthogonal array design. Subsequently， 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radical and hydroxyl radical scavenging capacities were measured to evaluate antioxidant activity， and the growth inhibitory effect of crude extracts on HSC-T6 cells was assessed by methylthiazoletetrazolium （MTT） colorimetric assay， Hoechst 33258 fluorescence staining， and flow cytometry. The optimal extraction conditions were determined as follows: ultrasonic power， 500 W； solid/liquid ratio，1:20 （g/mL）； ultrasonication time， 50 min； and extraction temperature， 60 ℃. Under these conditions， the extraction rates of polysaccharides and anthocyanins reached 14.24 and 6.13 mg/g， respectively. The crude extract from blueberry wine lees showed good antioxidant activity and its inhibitory effect on the proliferation of HSC-T6 cells was found to be dose- and time-dependent. Therefore， the crude extract has high antioxidant activity and significant anti-hepatic fibrosis activity and it also can inhibit the growth of HSC-T6 cells in vitro， which is partly attributed to its ability to induce cell apoptosis.

blueberry wine lees； preparation； antioxidant activity； HSC-T6 cells

10.7506/spkx1002-6630-201618006

TS201.4

A

1002-6630（2016）18-0034-07

馬艷弘， 劉照亭， 李亞輝， 等. 藍(lán)莓酒泥粗提物的制備及其生物活性［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（18）: 34-40. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201618006. http://www.spkx.net.cn

MA Yanhong， LIU Zhaoting， LI Yahui， et al. Preparation and biological activities of crude extract from blueberry wine lees［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 34-40. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618006. http://www.spkx.net.cn

2015-11-21

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2012786）；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（現(xiàn)代農(nóng)業(yè)）項(xiàng)目（BE2015350）；江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（SKLF-KF-201504）

馬艷弘（1972—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與食品功能因子、農(nóng)副產(chǎn)品綜合利用。E-mail：ma_yhhyy@126.com