邢海麗，辛嘉英*，王　艷，高圣博

（哈爾濱商業(yè)大學 食品科學與工程省級重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

響應(yīng)面優(yōu)化甲烷氧化菌素、苯甲酸鈉和山梨酸鉀復(fù)配劑抑菌效果

邢海麗，辛嘉英*，王艷，高圣博

（哈爾濱商業(yè)大學 食品科學與工程省級重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗研究甲烷氧化菌素、苯甲酸鈉和山梨酸鉀復(fù)配劑對白色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響，模擬得出了抑菌圈直徑的回歸方程，利用Design-Expert軟件分析表明：當甲烷氧化菌素-苯甲酸鈉-山梨酸鉀質(zhì)量濃度最佳配比為0.330∶0.309∶0.144時，最大抑菌圈直徑的理論值為34.99 mm，實際值為34.7 mm，此時最佳復(fù)配劑對白色葡萄球菌最小抑菌濃度為0.05 mg/mL。

甲烷氧化菌素；化學防腐劑；復(fù)配劑；抑菌效果；響應(yīng)面

近些年來，食品添加劑已用于調(diào)味、著色、延長食品的保質(zhì)期以及食品安全宣傳［1］，是食品加工生產(chǎn)中不可缺少的一部分［2-3］。隨著人民生活水平的提高，綠色食品、健康食品的概念深入人心，天然食品防腐劑更加受到人們的重視，并成為食品添加劑研究和應(yīng)用的一個熱點［4-5］。甲烷氧化菌素（methanobactin，Mb）是由甲烷氧化細菌分泌的，它既能夠以分泌物的形式存在于細胞外，又能以顆粒型甲烷的加氧酶組成結(jié)構(gòu)成分存在于細胞內(nèi)膜上，是一種小分子的熒光肽，對銅具有較強的親和性［6-8］。而甲烷氧化菌是參與全球碳循環(huán)的一個重要微生物［9-10］，也由于其生長快、易培養(yǎng)，易大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)、不受季節(jié)與自然條件限制等優(yōu)越性，已經(jīng)被用于生產(chǎn)單細胞蛋白及蝦青素等［11］，因此利用微生物生產(chǎn)天然抗菌劑的技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景［12-14］。

國內(nèi)外研究表明，由于很多食品添加劑在功能和應(yīng)用方面具有局限性，將幾種來源不同的天然食品防腐劑復(fù)配，或者將一種天然防腐劑與其他化學防腐劑復(fù)配使用，不僅可以減少防腐劑在食品中的用量，同時還可以使食品的殺菌或抑菌條件更加溫和化，達到互補或協(xié)同增效作用［15-16］，對人們的飲食健康非常有利。苯甲酸鈉和山梨酸鉀因其價格低廉，又具有廣譜的抑菌效果，廣泛應(yīng)用于食品中［17-18］，這兩種化學防腐劑小劑量的攝入對人體并無大礙，但是大劑量的攝入對身體有一定的危害［19-21］。因此，本實驗使用天然微生物源的食品防腐劑Mb和苯甲酸鈉、山梨酸鉀進行復(fù)配，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗法對復(fù)配劑進行優(yōu)化，以指示菌的抑菌圈直徑為響應(yīng)值，獲得最佳的復(fù)配比例，以及在最佳復(fù)配比例條件下的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），減少了化學防腐劑的用量，復(fù)配防腐劑應(yīng)用于食品中更安全。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

甲烷氧化菌IMV3011（Methylosinus trichosporium IMV 3011），由俄羅斯科學院催化研究所提供；白色葡萄球菌，由哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院微生物實驗室提供。

細菌培養(yǎng)基：由蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉和瓊脂組成。

Diaion HP-20大孔吸附樹脂、1.1 cm×20 cm層析柱 日本三菱化工公司；苯甲酸鈉、山梨酸鉀（均為食品級） 豐達食品添加劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械公司；5BG-生化發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；RV8V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司；FDU-1200冷凍干燥機 東京理化器械公司；HDL潔凈工作臺北京東聯(lián)哈爾儀器公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1Mb的提取純化

將30 ℃培養(yǎng)3 d的甲基彎菌IMV 3011發(fā)酵液置于4 ℃、8 000 r/min冷凍離心機中離心20 min除去菌體，取上清液，在上清液中加入適量的CuSO4溶液，常溫條件下靜止2 h，上清液通過已活化的Diaion HP-20大孔樹脂進行吸附，吸附過程結(jié)束后，對吸附有Mb的大孔樹脂進行除鹽操作，除鹽后使用60%乙醇溶液作為洗脫液進行脫附操作，收集洗脫液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（40 ℃、250 r/min）初步出去乙醇，然后預(yù)冷凍后通過冷凍干燥機除去水分，凍干后的Mb-Cu粗品置于-30 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆茫?2］。

1.3.2單因素MIC的測定

將Mb-Cu、苯甲酸鈉、山梨酸鉀用2倍稀釋法［23］稀釋得到各種質(zhì)量濃度，然后再將帶有指示菌的斜面中加入已滅菌的液體培養(yǎng)基，調(diào)整菌濃，使每毫升液體培養(yǎng)基中含活菌數(shù)達 1×106CFU/mL。以不加Mb-Cu、苯甲酸鈉、山梨酸鉀但接菌的試管作為陽性對照，以不加Mb-Cu、苯甲酸鈉、山梨酸鉀且不接種菌的試管作為陰性對照，同時，以不加Mb-Cu加入與Mb-Cu等質(zhì)量濃度的Cu2+接菌的試管作對照。采用平板傾注法，依次將未見菌生長的各管培養(yǎng)物各吸取0.1 mL注入無菌平板培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，實驗組無菌生長組所對應(yīng)的Mb-Cu、苯甲酸鈉、山梨酸鉀的最低質(zhì)量濃度，為MIC。

1.3.3單因素試驗設(shè)計

采用濾紙片擴散法［24］，先制備直徑20 mm濾紙圓片，121 ℃高壓滅菌20 min，自然晾干備用。制備營養(yǎng)瓊脂平板，吸取濃度為1×106CFU/mL的菌懸液100 μL置平板表面，用玻璃三角涂棒涂勻，將濾紙片浸泡于防腐液中1 min，取出晾微干，輕貼于平板上，每一個平皿均勻放2 張濾紙片，設(shè)1 個空白對照。每種防腐液做3 個平板重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)24 h后用游標卡尺測量各抑菌圈直徑，抑菌圈直徑取平均值。抑菌圈直徑大于20 mm為有抑菌作用，不大于20 mm為無抑菌作用，對照組應(yīng)無抑菌圈產(chǎn)生，實驗有效。

固定苯甲酸鈉質(zhì)量濃度0.600 mg/mL、山梨酸鉀質(zhì)量濃度0.335 mg/mL，探討Mb-Cu質(zhì)量濃度對白色葡萄球菌抑菌圈直徑大小的影響；固定Mb-Cu質(zhì)量濃度2.540 mg/mL、山梨酸鉀質(zhì)量濃度0.335 mg/mL，探討苯甲酸鈉質(zhì)量濃度對白色葡萄球菌抑菌圈直徑大小的影響；固定Mb-Cu質(zhì)量濃度2.540 mg/mL、苯甲酸鈉質(zhì)量濃度0.600 mg/mL，探討山梨酸鉀質(zhì)量濃度對白色葡萄球菌抑菌圈直徑大小的影響。

1.3.4響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，綜合考慮各因素對指示菌抑菌圈直徑的影響，采用Box-Behnken設(shè)計方案，三因素Mb質(zhì)量濃度、苯甲酸鈉質(zhì)量濃度、山梨酸鉀質(zhì)量濃度分別用X1、X2、X3表示，每一自變量的低、中、高實驗水平分別以-1、0、1進行編碼，該模型通過最小二乘法擬合二次多項方程可以表達為：

式中：Y為響應(yīng)值（抑菌圈直徑）；A0、Ai、Aii、Aij為方程系數(shù)；Xi、Xj（i≠j）為自變量編碼值，確定最優(yōu)防腐劑方案配比，并使用1.3.2節(jié)的方法確定最優(yōu)防腐劑配比下的MIC。因子編碼及各自變量水平見表1。

表1　響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table1　Factors and their coded levels used for Box-Behnken design mg/mL

2　結(jié)果與分析

2.1單因素的MIC

表2　單因素的MICTable2　Minimum inhibitory concentrations of single preservatives mg/mL

由表2可知，Mb-Cu、苯甲酸鈉和山梨酸鉀對白色葡萄球菌的MIC值分別為2.540、0.150、1.340 mg/mL。結(jié)果表明，Mb-Cu可以有效地抑制白色葡萄球菌的生長。

2.2單因素試驗結(jié)果

圖1　Mb（A）、苯甲酸鈉（B）、山梨酸鉀（C）質(zhì)量濃度對白色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響Fig.1　Effects of concentrations of methanobactin-Cu2+， sodium benzoate and potassium sorbate on inhibition zone diameters against Staphylococcus albus

由圖1可以看出，白色葡萄球菌的抑菌圈直徑隨著Mb、苯甲酸鈉和山梨酸鉀質(zhì)量濃度的增加而增加，根據(jù)GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》和GB 2760—2014A.2食品添加劑的使用規(guī)定中，同一功能的食品添加劑（相同色澤著色劑、防腐劑、抗氧化劑）在混合使用時，各自用量占其最大使用量的比例之和不應(yīng)超過1，綜合考慮選定Mb質(zhì)量濃度的3 個水平為：2.54、3.81、5.08 mg/mL；苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為0.30、0.45、0.60 mg/mL；山梨酸鉀質(zhì)量濃度為0.167、0.251、0.335 mg/mL。

2.3響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果

2.3.1響應(yīng)面試驗結(jié)果

表3為采用Box-Behnken設(shè)計方案所得試驗結(jié)果。

表3　Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table3　Box-Behnken design with experimental results of inhibition zone diameter

2.3.2建立模型方程與顯著性檢驗

利用Design-Expert軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合及顯著性檢驗，結(jié)果如表4所示。

表4　回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗Table4　Regression coefficients and significance test of regression model

Mb質(zhì)量濃度（X1）、苯甲酸鈉質(zhì)量濃度（X2）和山梨酸鉀質(zhì)量濃度（X3）與抑菌圈直徑之間的二次多項回歸方程為：

回歸方差分析顯著性檢驗表明，Mb質(zhì)量濃度、苯甲酸鈉質(zhì)量濃度和山梨酸鉀質(zhì)量濃度3個因素對白色葡萄球菌抑菌圈直徑的線性效應(yīng)都很顯著（P＜0.000 1＜0.01）；各因子間交互作用很顯著（P＜0.01）。在本試驗設(shè)計范圍內(nèi)，F(xiàn)=1 635.85，P＜0.000 1＜0.01，說明該模型極其顯著。該模型的校正決定系數(shù)R2Adj為0.998 9，表明99.89%的抑菌圈直徑變異在所研究的3 個因素中，其中總變異中僅有0.11%不能由該模型解釋，因此該模型擬合程度較好，試驗誤差小。變異系數(shù)表明不同水平處理組之間的變異程度，變異系數(shù)為0.45%，說明該模型重復(fù)性較好，證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化Mb質(zhì)量濃度、苯甲酸鈉質(zhì)量濃度和山梨酸鉀質(zhì)量濃度對白色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響是可行的。

2.3.3響應(yīng)面分析及復(fù)配劑優(yōu)化

通過模型方程所作的響應(yīng)面圖及其等高線，如圖2所示。

由圖2可知，Mb和苯甲酸鈉、Mb和山梨酸鉀交互作用顯著，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反［25］。通過軟件最后結(jié)果分析，得到的抑制白色葡萄球菌的最佳復(fù)配比例為：Mb-苯甲酸鈉-山梨酸鉀質(zhì)量濃度比為0.330∶0.309∶0.144。此時對白色葡萄球菌的抑菌圈直徑做出的理論分析值為34.99 mm。同時驗證回歸方程和實際結(jié)果擬合程度，在此條件下進行5 次驗證實驗，最后得到的實際平均抑菌圈直徑為34.7 mm，與理論值基本上吻合，具有良好的重復(fù)性，因此，采用此響應(yīng)面法所得到的抑菌參數(shù)比較準確可靠，具有實際應(yīng)用價值。并使用1.3.2節(jié)的方法確定最優(yōu)防腐劑配比條件下的MIC為0.05 mg/mL。

3　結(jié) 論

Mb是一種新型的潛在的微生物源的食品防腐劑，本實驗主要研究了其與食品中常用的化學防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀復(fù)配對白色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響。測定單獨用Mb、苯甲酸鈉和山梨酸鉀對白色葡萄球菌的MIC分別為2.540、0.150、1.340 mg/mL。將Mb、苯甲酸鈉、山梨酸鉀三因素進行復(fù)配，在單因素分析的基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面法優(yōu)化其復(fù)配比例，通過抑菌實驗測定抑菌圈直徑大小作為響應(yīng)值，最后由軟件分析法得出各個菌的最佳復(fù)配比例為Mb-苯甲酸鈉-山梨酸鉀質(zhì)量濃度比為0.330∶0.309∶0.144，最大抑菌圈直徑的理論值為34.99 mm，實測值為34.7 mm。MIC值為0.05 mg/mL，三因素復(fù)配的MIC值遠低于單因素的MIC值，這說明復(fù)配劑之間的協(xié)同作用能提高其抑菌作用。

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Optimization of Combinations of Methanobactin， Sodium Benzoate and Potassium Sorbate for Enhanced Antibacterial Effect by Response Surface Methodology

XING Haili， XIN Jiaying*， WANG Yan， GAO Shengbo
（Key Laboratory for Food Science and Engineering， Harbin University of Commerce， Harbin 150076， China）

One-factor-at-a-time method and response surface methodology were applied jointly to study the individual and combined effects of methanobactin， sodium benzoate and potassium sorbate on inhibition zone diameters against Staphylococcus albus. As a result， a regression model was developed using inhibition zone diameter as response variable. The analysis carried out using Design-Expert software showed that the maximum inhibition zone diameter of 34.99 mm was obtained by the combined use of methanobactin， sodium benzoate and potassium sorbate at a mass ratio of 0.330:0.309:0.144，representing a minimum inhibitory concentration against S. albus of 0.05 mg/mL.

methanobactin； chemical preservative； blends； antimicrobial effect； response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201618001

TS202.3

A

1002-6630（2016）18-0001-05

邢海麗， 辛嘉英， 王艷， 等. 響應(yīng)面優(yōu)化甲烷氧化菌素、苯甲酸鈉和山梨酸鉀復(fù)配劑抑菌效果［J］. 食品科學， 2016，37（18）: 1-5. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618001. http://www.spkx.net.cn

XING Haili， XIN Jiaying， WANG Yan， et al. Optimization of combinations of methanobactin， sodium benzoate and potassium sorbate for enhanced antibacterial effect by response surface methodology［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 1-5. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618001. http://www.spkx.net.cn

2015-12-11

國家自然科學基金面上項目（21573055）

邢海麗（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學。E-mail：841084208@qq.com

辛嘉英（1966—），男，教授，博士，研究方向為生物催化。E-mail：xinjiayingvip@163.com