高巍　郭俊俊

陜西省腫瘤醫(yī)院胸外科，陜西　西安　710061

食管癌外周血及腫瘤組織的EGFR突變的檢測及意義△

高巍郭俊俊#

陜西省腫瘤醫(yī)院胸外科，陜西西安710061

Oncol Prog，2016，14（7）

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，在全部惡性腫瘤死亡回顧調(diào)查中僅次于胃癌而居第2位，年病死率極高［1］。據(jù)估計全世界每年食管癌發(fā)病數(shù)約20萬人，而我國食管癌發(fā)病數(shù)約占全世界食管癌發(fā)病總數(shù)60%，是危害我國人民健康的主要惡性腫瘤之一［2］。近年來生物靶向治療為腫瘤的個體化治療指明了方向，針對表皮生長因子受體（EGFR）的靶向藥物已成功應用于臨床食管癌治療，很大程度上延長了患者的生存時間［3］。實時熒光定量PCR（RT-PCR）通過設計特異性引物和探針，借助熒光信號檢測基因有無突變，然后應用表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）進行針對性治療［4］。我國于2010年批準吉非替尼用于晚期食管癌患者EGFR突變治療［5］。本研究應用RT-PCR技術對食管癌患者外周血和腫瘤組織的EGFR突變狀態(tài)進行配對檢測，分析食管癌患者外周血及腫瘤組織EGFR突變及其與臨床特征的關系，探討兩者EGFR突變的一致性，在此基礎上，分析EGFR-TKI治療外周血和腫瘤組織中EGFR突變與臨床疾病控制率之間的關系，進一步探討EGFR突變與吉非替尼或者厄洛替尼臨床療效監(jiān)測中的應用價值。

1　資料與方法

1.1一般資料

收集2014年1月至2015年9月陜西省腫瘤醫(yī)院腫瘤科食管癌患者112例的外周血標本，同期收集曾行轉(zhuǎn)移灶活檢或手術切除的腫瘤組織標本87例作為研究對象，其中有47例患者同時提供了腫瘤組織和外周血，回顧性整理分析患者臨床資料。入選標準：①經(jīng)CT檢查確診為食管癌患者；②年齡大于18歲；③預計生存時間半年以上；④標本制作前未進行吉非替尼或者厄洛替尼分子靶向藥抗腫瘤治療。排除標準：①患者在確診后，本研究前進行過相關治療；②同時接受不同的抗腫瘤治療；③生育期婦女。腫瘤組織和外周血兩組患者的性別、年齡、病理類型比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。（表1）

1.2研究方法

標本采集及DNA提取：112例食管癌患者于早上空腹抽取靜脈血4 ml，室溫放置2 h后用低溫高速離心機將靜脈血離心，血清以磁珠法全血基因組DNA抽提試劑盒（美國Omega公司生產(chǎn)）抽提，操作步驟按照試劑盒說明書［6］。收集84例轉(zhuǎn)移灶活檢或手術切除的腫瘤組織，取8 μm左右厚度置于1.5 ml的離心管中，使用Qiagen公司FFEPDNA提取試劑盒抽提DNA，操作步驟按照試劑盒說明書［7］。EGFR基因檢測：采用熒光定量PCR技術，通過特異性探針水解釋放熒光，檢測PCR反應的進行，確定EGFR基因突變情況［8］。臨床治療：將獲取外周血和腫瘤組織標本后的患者于每日早上口服吉非替尼片（250 mg）1片或厄洛替尼（150 mg）1片，接受TKI治療的外周血樣本的患者45例，其中40例吉非替尼治療，5例厄洛替尼治療；接受TKI治療的腫瘤組織標本的患者40例，全部接受了吉非替尼治療。直至病情進展或出現(xiàn)不能耐受的不良反應［9］。

1.3結果判定

患者臨床療效按照實體瘤RESCIST療效評價標準進行評價。完全緩解（CR）：所有靶病灶消失；部分緩解（PR）：靶病灶最長徑之和與基線狀態(tài)比較，至少減少30%；疾病進展（PD）：靶病灶最長徑之和與治療開始后所記錄到的最小靶病灶最長徑之和比較增加超過20%，或者出現(xiàn)新的病灶；疾病穩(wěn)定（SD）：于PR和PD之間，不出現(xiàn)新病灶，靶病灶最長徑之和與基線狀態(tài)比較，減少大于30%，增加小于20%。腫瘤客觀緩解率=（CR+PR）患者例數(shù)/總患者例數(shù)×100%，疾病控制率=（CR+PR+SD）患者例數(shù)/總患者例數(shù)×100%。若患者病情進展或因其他原因終止TKI治療時，對患者進行總體最佳療效評價。

以腫瘤組織突變性EGFR患者例數(shù)為基礎，同時發(fā)現(xiàn)外周血突變性EGFR患者例數(shù)的概率，即為兩者的一致性比率。即：一致性（%）=外周血和腫瘤組織同時突變性EGFR患者例數(shù)/腫瘤組織突變性EGFR患者例數(shù)。

1.4統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理所有臨床資料和實驗數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以百分比（%）表示，比較采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1食管癌患者外周血EGFR突變及其與臨床特征的關系

外周血樣本112例中檢測到34例EGFR突變，總體突變率達30.36%。其中18外顯子1例第2155位堿基G→A突變，占總突變2.94%；19外顯子4例2235～2249核苷酸缺失突變，10例2236～2250、2例2254～2277核苷酸缺失突變，占總突變47.06%；21外顯子17例L858位亮氨酸轉(zhuǎn)變成精氨酸突變，占總突變50%。19和21外顯子突變占總突變的97.06%。EGFR突變在鱗癌組明顯高于非鱗癌組（P＜0.05），在年齡、性別上差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表2）

2.2食管癌患者腫瘤組織EGFR突變及其與臨床特征的關系

腫瘤組織樣本87例中檢測到29例EGFR突變，總體突變率達33.33%。其中無18外顯子突變；19外顯子8例2235～2249核苷酸缺失突變，6例2236～2250、1例2254～2277核苷酸缺失突變，占總突變51.72%；21外顯子14例L858位亮氨酸轉(zhuǎn)變成精氨酸突變，占總突變48.28%。EGFR突變在鱗癌組明顯高于非鱗癌組（P＜0.05），在年齡、性別上差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表3）

表2　患者外周血EGFR突變與臨床特征的關系

表3　患者腫瘤組織EGFR突變與臨床特征的關系

2.3食管癌患者外周血和腫瘤組織中EGFR突變的一致性

47例患者同時提供了腫瘤組織和外周血。檢測到腫瘤組織EGFR突變15例，外周血EGFR突變12例，兩者同時EGFR突變的有11例，且這11例外周血和腫瘤組織中的突變位點一致。外周血檢測EGFR突變但腫瘤組織中未檢測到突變1例，腫瘤組織中檢測到EGFR突變但外周血中未檢測到突變4例，兩者同時野生型EGFR有31例。檢測到的EGFR狀態(tài)以腫瘤組織為標準，兩者突變一致性達到73.33%（11/15）。（表4）

表4　47例患者外周血和組織EGFR突變一致性

2.4食管癌患者外周血和腫瘤組織EGFR突變與TKI臨床療效關系

接受TKI治療的外周血樣本的患者45例，其中40例吉非替尼治療，5例厄洛替尼治療。32例EGFR突變患者全部接受治療，17例PR，8例SD，EGFR突變患者TKI治療客觀有效率53.13%（17/32），疾病控制率78.13%（25/32）。接受治療的EGFR未突變的13例患者中僅有3例SD，且這3例在腫瘤組織中EGFR為突變型。

接受TKI治療的腫瘤組織標本的患者40例，且全部接受了吉非替尼治療。27例EGFR突變患者中15例PR，7例SD，EGFR突變患者TKI治療客觀有效率55.56%（15/27），疾病控制率81.48%（22/27），未突變患者2例SD。外周血和腫瘤組織中EGFR突變的患者接受TKI的疾病控制率明顯高于EGFR野生型患者（P＜0.01）。外周血與組織同時突變的11例患者，治療均有效。腫瘤組織中未檢測到但外周血中檢測到的1例患者病情加重。（表5）

表5　外周血和腫瘤組織EGFR突變與TKI臨床療效的關系

3　討論

近年來，食管癌在我國的病死率逐年升高，隨著醫(yī)學技術的發(fā)展，治療手段的進步，靶向藥物逐漸成為治療食管癌最有希望的方法之一，其在臨床應用中取得了明顯療效［10］。國內(nèi)外相關報道證實，EGFR突變的食管癌患者使用靶向藥物治療療效顯著，能夠有效延長患者的生存時間［11］。EGFR基因突變是腫瘤特異性的體細胞遺傳改變，僅在癌細胞出現(xiàn)，體內(nèi)所有正常細胞均屬于野生型［12］。通過檢測外周血和腫瘤組織EGFR基因突變狀態(tài)，為臨床應用靶向藥物治療提供依據(jù)［13］。外周血采樣方便，且能實時監(jiān)測EGFR突變腫瘤細胞的動態(tài)變化，以評價患者對EGFR-TKI的反應［14］。

本研究外周血樣本112例中檢測到34例EGFR突變，總體突變率達30.36%，EGFR突變在鱗癌組明顯高于非鱗癌組（P＜0.05），在年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；腫瘤組織樣本87例中檢測到29例EGFR突變，總體突變率達33.33%，EGFR突變在鱗癌組明顯高于非鱗癌組（P＜0.05），在年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。但檢測的突變率仍是偏低，可能原因：①樣本量偏少；②EGFR突變位點較多，本研究只檢測了常見的幾種突變位點；③可能與檢測方法等有關［15］。EGFR突變檢測方法很多，主要有測序法、擴增受阻突變系統(tǒng)法（ARMS）、變性高效液相色譜法（DHPLC）以及酶切法等［16］。目前臨床上使用最多的，仍是直接測序法［17］。本研究采用RT-PCR法，47例患者同時提供了腫瘤組織和外周血，兩者同時EGFR突變的有11例，且這11例外周血和腫瘤組織中的突變位點一致，檢測到的EGFR狀態(tài)以腫瘤組織為標準，兩者突變一致性達到73.33%，敏感性高。根據(jù)RTPCR特異性引物和探針，通過樣本是否具有擴增信號檢測基因有無突變。EGFR基因突變位點較多，本研究由于實驗條件限制，僅檢測了5種突變，是不足之處，應優(yōu)化實驗條件，提高檢測的特異性。

本研究接受TKI治療的腫瘤組織標本的患者40例，EGFR突變患者TKI治療客觀有效率55.56%，疾病控制率81.48%，外周血和腫瘤組織中EGFR突變的患者接受TKI的疾病控制率明顯高于EGFR野生型患者，更好地證實了EGFR突變對食管癌的EGFR-TKI分子靶向治療的療效預測作用。采用外周血樣本進行EGFR突變檢測，具有無創(chuàng)性、實時性特點，患者易于接受［18］。RT-PCR檢測食管癌外周血中EGFR突變敏感性強，EGFR突變檢測可作為臨床EGFR-TKI分子靶向治療的療效預測［19］。提高靶向治療的精確性，為患者帶來積極的治療效果，為醫(yī)生臨床合理用藥提供依據(jù)，從而節(jié)約醫(yī)療和社會資源［20］。

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Detection of EGFR mutations in peripheral blood and tumor tissues of esophageal cancer and the significance△

GAO Wei GUO Jun-jun#
Department of Thoracic Surgery，Shaanxi Cancer Hospital，Xi'an 710061，Shaanxi，China

目的分析食管癌患者外周血及腫瘤組織EGFR突變與臨床特征關系，探討外周血及腫瘤組織中EGFR突變的一致性，進一步分析EGFR-TKI治療外周血和腫瘤組織中EGFR突變與臨床疾病控制率之間的關系，進一步探討EGFR突變與吉非替尼或者厄洛替尼臨床療效監(jiān)測中的應用價值。方法采用RT-PCR檢測112例食管癌患者外周血和87例食管癌患者腫瘤組織中EGFR突變，其中47例外周血和腫瘤組織配對檢測。分析外周血和腫瘤患者組織中EGFR突變與臨床特征的關系及兩者EGFR突變的一致性。采用EGFR-TKI治療外周血和腫瘤組織中EGFR突變，評價EGFR突變與吉非替尼或者厄洛替尼臨床療效的關系。結果EGFR突變在鱗癌組明顯高于非鱗癌組（P＜0.05）；腫瘤組織和外周血同時EGFR突變的有11例，且突變位點一致，檢測到的EGFR狀態(tài)以腫瘤組織為標準，兩者突變一致性達到73.33%；外周血和腫瘤組織中EGFR突變的患者接受TKI的疾病控制率明顯高于EGFR野生型患者（P＜0.01）。結論食管癌外周血和腫瘤組織EGFR突變與臨床特征的關系與鱗癌密切相關；食管癌外周血和腫瘤組織EGFR突變的一致性較高；EGFR-TKI分子靶向治療外周血和腫瘤組織中EGFR突變的療效顯著。

食管癌；外周血；腫瘤組織；EGFR突變

ObjectiveTo study the correlation between EGFR mutation in peripheral blood or tumor tissues in esophageal cancer and the clinical features，and then discuss the consistency of both EGFR mutations，to investigate the relationship between EGFR-TKI treatment for EGFR mutations and the clinical disease control rate（DCR），as well as the use of gefitinib or erlotinib in clinical efficacy monitoring.MethodThe EGFR mutations in peripheral blood of 112 cases and in tumor tissues of 87 cases of esophageal cancer were detect using RT-PCR，in which 47 cases had matched tests of peripheral blood and tumor tissue.The relationship between EGFR mutations in peripheral blood or tumor tissues and clinical features and the consistency of the EGFR mutations were investigated；EGFR-TKI treatment was administered，and the correlation between EGFR mutations and clinical efficacy of gefitinib or erlotinib were analyzed.ResultEGFR mutations in squamous cell carcinoma group were significantly higher than that of non-squamous cell carcinoma group（P＜0.05）；11 cases had EGFR mutations in both peripheral blood and tumor tissue，with same mutation sites；Taking EGFR status detected in tumor tissue as the standard，a high consistency was observed at 73.33%；The DCR in patients with EGFR mutations in peripheral blood and tumor tissues of patients receiving TKIs were significantly higher than those with wild-type EGFR（P＜0.01）.ConclusionThe correlation between EGFR mutations in peripheral blood or tumor tissues and clinical features of esophageal cancer patients is closely related with squamous carcinoma；The EGFR mutations in peripheral blood and tumor tissues of esophageal cancer are highly consistent；EGFR-TKIs molecule targeted therapy is significantly effective in treating the EGFR mutations in peripheral blood and tumor tissue.

esophageal cancer；peripheral blood；tumor tissue；EGFR mutation

R735.1

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.07.09

2016-01-18）

陜西省衛(wèi)生廳扶植項目（D類項目）（2012D45）

（corresponding author），郵箱：1446701185@qq.com