王麗華劉麗秋楊鵬鵬王福榮于俊生鄭　燕李平海李淑秀

（1.青島大學附屬海慈醫(yī)院，山東　青島266003；2.青島大學附屬醫(yī)院，山東　青島266000；3.中國人民解放軍91286部隊門診部，山東　青島266000）

祛痰通絡湯對糖尿病腎病大鼠腎組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響*

王麗華1劉麗秋2△楊鵬鵬2王福榮1于俊生1鄭燕1李平海3李淑秀1

（1.青島大學附屬海慈醫(yī)院，山東青島266003；2.青島大學附屬醫(yī)院，山東青島266000；3.中國人民解放軍91286部隊門診部，山東青島266000）

目的觀察祛痰通絡湯對糖尿病腎病大鼠腎組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白GRP78，Caspase12的影響。方法高糖高脂飼料聯(lián)合腹腔注射STZ制備糖尿病腎病模型，隨機分為正常對照組、模型組、祛痰通絡湯組、四苯基丁酸組，干預8周。觀察各組24 h尿蛋白定量、肌酐、腎臟病理學變化；免疫組化和Western blot檢測腎組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白GRP78，Caspase-12的表達。結果經(jīng)過祛痰通絡湯治療后，大鼠體質(zhì)量上升，24 h尿蛋白定量、糖化血紅蛋白、肌酐下降；病理改變減輕；模型組腎組織的GRP78、Caspase12表達明顯升高；祛痰通絡湯組GRP78、Caspase-12表達明顯降低（均P＜0.05）。結論糖尿病腎病大鼠腎臟中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應明顯增強，祛痰通絡湯降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，可能是其腎臟保護作用的重要機制。

糖尿病腎病祛痰通絡湯內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

【Abstract】Objective：To investigate the effects of Qutan Tongluo Decoction on the expression of endoplasmic reticulum stress-related molecules GRP78 and Caspase12 in renal of diabetic nephropathy rats.M ethods：The diabetic nephropathy ratmodelwas induced by feeding high-glucose high-fat diet in combination with intraperitoneal injection of STZ.Wistar rats were random ly divided into 4 groups：the normal control group，the model group，Qutan Tongluo Decoction group，and 4-phenyl butyric acid treatment（PBA group）.At the end of 8 weeks，24-hour urinary protein excretion，serum creatinine（Scr）and renal pathological changeswere determined；the expression of glucose-regulated protein 78（GRP78）and Caspase-12 were examined by immunohistochemistry and western blotting respectively.Results：Qutan Tongluo Decoction treatment raised bodymass of rats，reduced 24-hour urinary protein excretion，glycosylated hemoglobin，and serum creatinine，and relieved pathological changes. The expressions of GRP78 and Caspase12 proteins in themodel group was significantly higher；The expressions of GRP78 and Caspase12 proteins in Qutan Tongluo Decoction group dropped significantly（P＜0.05）.Conclusion：Endoplasmic reticulum stress is abundantly expressed in the kidneys of diabetic nephropathy rats.Qutan Tongluo Decoction decreases ER stress，whichmay be an importantmechanism in renal protective effects.

【Key words】Diabetic nephropathy；Qutan Tongluo Decoction；Endoplasmic reticulum stress

糖尿病腎病是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，是導致終末期腎病（ESRD）的重要原因，發(fā)展為ESRD的比例高達20%～40%［1］，目前其發(fā)病機制尚未完全闡明，缺乏有效的治療手段。多數(shù)人認為腎臟血流動力學改變、血糖、蛋白質(zhì)及脂肪代謝紊亂是糖尿病腎病的病變基礎。目前越來越多的證據(jù)表明［2］，持續(xù)高糖和蛋白尿誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是糖尿病腎臟病的重要發(fā)病機制［1］?！捌⒛I氣虛，痰瘀阻絡”是糖尿病腎病的重要病機，為此擬定了以祛痰通絡法為主的中藥復方，我們前期研究已明確其降低尿蛋白，具有保護足細胞、改善糖尿病早期腎臟損傷的作用［3］，而其機制仍不十分明確。本研究觀察祛痰通絡湯對糖尿病大鼠腎組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響，為糖尿病腎病的治療提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物50只成年雄性Wistar大鼠，8周齡，體質(zhì)量200～220 g［由青島市動物研究所提供，動物許可證號SCXK（魯）201300001］。室溫23～25℃，濕度40%～60%，12 h交替照明，大鼠自由進食和飲水。

1.2試藥與儀器祛痰通絡湯組成：當歸12 g，川芎12 g，赤芍12 g，白術15 g，土茯苓30 g，制大黃10 g，瓦楞子30 g，僵蠶30 g，海藻15 g，葫蘆巴15 g。由青島市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制成滅菌濃煎密封制劑，藥物相對密度為1.0 g/L，生藥含量為1.5 g/mL。鏈脲佐菌素（STZ）、4-苯基丁酸（4-PBA）（美國Sigma公司）；兔抗鼠GRP78抗體，兔抗鼠Caspase-12抗體（abcam公司）；PV-9000二步法免疫組化試劑（北京中杉生物技術有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天公司）。全自動生化分析儀（日本olympus AU640）；RM2135型石蠟切片機（LEICA，美國）；顯微BMJ-Ⅲ型病理組織包埋冷凍臺（常州中威電子儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）。

1.3分組與造模50只成年雄性Wistar大鼠，適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法抽取10只為正常對照組，余40只建立糖尿病腎病大鼠模型。正常對照組予以普通顆粒飼料喂養(yǎng)；其余大鼠均予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)8周后，禁食12 h，將STZ溶于0.1mmol/L的枸櫞酸緩沖液（pH 4.3）中，腹腔注射STZ 30 mg/kg，72 h后尾靜脈取血，檢測血糖≥16.7 mmol/L，為糖尿病大鼠造模成功［1］。造模同時，正常對照組給予等體積0.1mmol/L的枸櫞酸緩沖液腹腔注射。40只造模大鼠中，2只大鼠血糖不符合糖尿病診斷標準被剔除，死亡4只。繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周，4只大鼠不符合糖尿病腎病標準（24 h尿蛋白定量大于20μg/min）被剔除，余30只糖尿病腎病大鼠隨機分為模型組（10只）、祛痰通絡湯組（10只）、4-PBA組（10只）。

1.4干預措施祛痰通絡湯組大鼠按2 mL/100 g劑量灌胃，4-PBA組大鼠按1 g/kg的劑量每日灌胃，治療8周。正常對照組和模型組予等量生理鹽水灌胃。干預過程中模型組、祛痰通絡湯組、4-PBA組大鼠各死亡2只。

1.5標本采集與檢測1）24 h尿量白定量：第8周末，收集各組大鼠第8周末的24 h尿液，ELISA法檢測24 h尿蛋白定量。各組大鼠禁食12 h，處死取材，具體如下：以10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔麻醉試驗大鼠，腹主動脈取血6 mL，分別置于EDTA抗凝管3 mL檢測糖化血紅蛋白和促凝管內(nèi)3mL檢測肌酐。2）免疫組化檢測：大鼠血液采集后，取出雙側腎臟，生理鹽水洗凈，左右腎各取1/2放入10%甲醛中固定，作免疫組織化學檢測。采用SP法。2μm腎組織切片，常規(guī)脫蠟至水，一抗GRP78（1∶200），CHOP（1∶100）稀釋，PBS代替一抗作陰性對照，DAB染色，顯微鏡控制下顯色，棕黃色顆粒為陽性。3）Western blot檢測：剩余1/2腎臟放入EP管置于-80℃保存，行Western blot檢測。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白GRP78，Caspase12的表達。取-80℃保存腎臟組織，提取并測定蛋白含量；取樣品加入loading buffer，配制SDS-PAGE膠，取樣品上樣蛋白20μg，100 V電泳；0.22μm PVDF膜（甲醛處理），40 min，脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗（1∶1000），4℃過夜，TBST清洗3次，每次5 min；加入二抗（1∶30000），室溫1 h，TBST清洗3次，每次5min，顯影，所得結果以內(nèi)參GAPDH校正。

1.5統(tǒng)計學處理應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（表示，成組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1各組大鼠一般狀況比較見表1。模型組大鼠出現(xiàn)典型的多飲、多尿、多食、體質(zhì)量減輕等糖尿病癥狀，毛色暗淡，血糖持續(xù)≥16.7 mmol/L。祛痰通絡湯組大鼠體質(zhì)量增加最多，明顯高于模型組（P＜0.05），祛痰通絡湯組與4-PBA組大鼠體質(zhì)量相比，無明顯差別（P＞0.05）。與正常對照組相比，模型組糖化血紅蛋白、肌酐水平明顯升高（P＜0.05）；祛痰通絡湯組的肌酐較模型組明顯下降（P＜0.05），與4-PBA組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），4-PBA組糖化血紅蛋白較模型組及祛痰通絡湯組明顯下降（P＜0.05）。

表1　各組大鼠一般情況比較（

表1　各組大鼠一般情況比較（

與正常對照組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與4-PBA組比較，△P＜0.05。下同。

組別n肌酐（μmol/L）體質(zhì)量（g）　糖化血紅蛋白（%）正常對照組10 23.8±2.56模型組8 55.9±5.7▲祛痰通絡湯組8 34.6±4.38▲*427.18±9.56*2.62±0.33 370.04±12.27 6.97±0.65▲434.54±9.38*6.60±0.31▲△4-PBA組8 31.9±2.27▲*425.60±7.27*4.67±0.58▲*

2.2各組大鼠干預前后24 h尿蛋白定量比較見表2。治療前，模型組、祛瘀通絡湯組及4-PBA組的24 h尿蛋白定量較正常對照組明顯升高（P＜0.05），模型組及治療組的24 h尿蛋白定量無明顯差別（P＞0.05）。治療8周后，祛痰通絡湯組24 h尿蛋白量較模型組明顯下降（P＜0.05），與4-PBA組相比無明顯差別（P＞0.05），正常對照組的24 h尿蛋白定量無明顯變化（P＞0.05）。

表2　各組大鼠干預前后24 h尿蛋白定量比較（μg/min，

表2　各組大鼠干預前后24 h尿蛋白定量比較（μg/min，

組別n干預前　干預后正常對照組10 3.70±0.56 3.72±0.41模型組8 20.58±2.31▲26.35±7.31▲祛痰通絡湯組8 21.48±2.48▲16.78±3.65▲*4-PBA組8 20.31±3.68▲17.19±2.29▲*

2.3各組干預后GRP78、Caspase12免疫組化結果見圖1，圖2。在正常對照組，GRP78在腎小管上皮細胞中少量表達；模型組腎小管表達顯著增多，腎小球呈陽性表達；祛痰通絡湯組及4-PBA組腎小球及腎小管表達明顯低于模型組。Caspase12主要位于腎小管上皮細胞內(nèi)，正常對照組表達弱，模型組表達明顯增強（P＜0.05），祛痰通絡湯組及4-PBA組較模型組明顯降低（P＜0.05）。祛痰通絡湯組與4-PBA組相比無明顯差別。

圖1　各組大鼠第8周GRP78免疫組化圖片（DAB染色）

圖2　各組大鼠第8周Caspase12免疫組化圖片（DAB染色）

2.4各組干預后Western blot檢測結果比較見表3，圖3。與正常對照組相比，模型組GRP78、Caspase12表達明顯升高（P＜0.05）。祛痰通絡湯治療后，GRP78蛋白及Caspase12蛋白表達較模型組明顯降低（P＜0.05）。祛痰通絡湯組與4-PBA組相比無明顯差別。

3　討　論

越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可能是腎臟發(fā)病的一個重要機制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與腎小球疾病的蛋白尿有關［4］；糖尿病腎病中，PERK/eIF2α和IRE1/JNK途徑被激活，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應上調(diào)［5］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激主要通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的3種跨膜蛋白：雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶、活化轉錄因子6和跨膜蛋白激酶1［6］，這3種膜蛋白也被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)感受器［7］。正常情況下，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）結合，處于無活性狀態(tài)，當未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔蓄積時，這3種蛋白可與GRP78解離，下游的信號通路被激活。

表3　各組大鼠第8周末GRP78，Caspase12蛋白表達比較（

表3　各組大鼠第8周末GRP78，Caspase12蛋白表達比較（

組　別n GRP78/GAPDH Caspase12/GAPDH正常對照組10 0.30±0.03 0.24±0.05模型組8 1.04±0.20▲0.84±0.20▲祛痰通絡湯組8 0.46±0.11▲*0.51±0.11▲*4-PBA組8 0.47±0.08▲*0.52±0.10▲*

圖3　各組干預后GRP78，Caspase12蛋白表達電泳圖

GRP78［8］又稱免疫球蛋白重鏈結合蛋白，是熱休克蛋白70 kDa家族成員之一，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的分子伴侶，幫助蛋白質(zhì)的折疊和成熟，其表達增高是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生和存在的標志［9］。Fukami等［10］發(fā)現(xiàn)，AGEs引起大鼠足細胞GPR78表達上調(diào)，通過一系列反應誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，最終導致足細胞凋亡。Chen等［11］對糖尿病腎病小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腎組織GRP78水平及尿蛋白水平顯著增高，并伴有顯著腎小球硬化，與我們的研究一致。Caspase-12屬于半胱天冬酶家族，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，是介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡的關鍵蛋白酶，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導細胞凋亡特有的［12］。Marie L等［13］發(fā)現(xiàn)20周齡糖尿病db/db小鼠近端小管Caspase-12的mRNA表達明顯升高，蛋白表達上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病大鼠模型組Caspase-12蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），其分布范圍和表達強度明顯高于正常對照組。祛痰通絡湯可降低Caspase-12蛋白表達水平。

中醫(yī)學認為本病多屬于“消渴”“水腫”“尿濁”“脹滿”“癃閉”“關格”的范疇。糖尿病腎病與“痰瘀”有密切關系，痰瘀是糖尿病腎病進展過程中的必然產(chǎn)物［14］，并形成惡性循環(huán)，影響腎的氣血運行和津液輸布。消渴日久，纏綿不愈，毒邪入絡，伏藏不去，毒自內(nèi)生，損害腎臟，絡脈瘀阻，故擬定祛痰通絡湯以活血通絡治療。該方由當歸芍藥散為基礎方加減而來，以當歸、川芎、赤芍活血通絡為君，以瓦楞子、僵蠶、海藻消痰軟堅，白術健補脾氣，葫蘆巴溫腎祛濕，共為臣藥，佐以赤芍除血痹，破堅積；大黃、土茯苓解毒排毒，泄?jié)嵬ńj。以通為補，祛邪為務，緩攻緩補，使泄而不傷正，補而不滯邪，共奏祛痰通絡、邪祛正安之功效。

本研究應用高糖高脂飼料聯(lián)合腹腔注射STZ制備糖尿病腎病模型，隨機分為正常對照組、模型組、祛痰通絡湯組、4-PBA組。4-PBA酸能夠穩(wěn)定蛋白構象，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，目前已廣泛用于動物模型［15-16］。我們應用免疫組化和Western blot對糖尿病腎病大鼠的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關分子研究，發(fā)現(xiàn)模型組GRP78蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），提示糖尿病腎病大鼠腎組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生，4-PBA抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，改善腎功能，降低尿蛋白，與以往的研究一致。祛痰通絡湯治療后，GRP78水平較模型組明顯降低（P＜0.05），說明祛痰通絡湯能夠改善糖尿病腎病內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，免疫組化與Western-blot的研究結果一致，與以往的研究一致［17］；模型組Caspase-12的表達明顯增強（P＜0.05），祛痰通絡湯干預后，其蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；治療前，模型組及治療組的24 h尿蛋白定量較對照組明顯升高，治療8周后，祛痰通絡湯組24 h尿蛋白量較模型組明顯下降（P＜0.05）。

本研究發(fā)現(xiàn)祛痰通絡湯能夠降低尿蛋白，改善腎功能指標，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白GRP78、Caspase12的表達，說明祛痰通絡湯可以減輕糖尿病腎病大鼠腎組織中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，延緩糖尿病腎病大鼠腎功能的進展。

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Effect of Qutan Tongluo Decoction on Protein Expression of Endoplasm ic Reticulum Stress in Renal of Diabetic Nephropathy Rats

WANG Lihua，LIU Liqiu，YANG Pengpeng，et al.Haici Hospital Affiliated of Qingdao University，Shandong，Qingdao 266003，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1667-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.007

2016-05-12）

山東省青島市中醫(yī)局計劃項目（2015-ZYY005）

（電子郵箱：liuliqiu@medmail.com.cn）