張亞晨， 溫海深， 李蘭敏， 馮啟超

(中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

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急性溫度脅迫對(duì)妊娠期許氏平鲉生殖內(nèi)分泌機(jī)能的影響*

張亞晨， 溫海深??， 李蘭敏， 馮啟超

(中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

為探究溫度對(duì)妊娠期許氏平鲉(Sebastesschlegelii)生殖內(nèi)分泌機(jī)能的影響，采用內(nèi)分泌學(xué)和分子生物學(xué)方法，對(duì)急性溫度脅迫后許氏平鲉的血清性類(lèi)固醇激素的變化及腦和卵巢生殖相關(guān)基因表達(dá)的變化進(jìn)行了系統(tǒng)的探究和分析。研究表明：妊娠期許氏平鲉的性腺型芳香化酶(P450aromA)具有溫度敏感性。血清中17β-雌二醇(E2)和卵巢雌激素受體α(ERα)表達(dá)水平在急性高溫脅迫后發(fā)生了顯著下降，在急性低溫脅迫后明顯升高。在溫度脅迫下，卵巢中雌激素受體β1(ERβ1)和雌激素受體β2(ERβ2)呈現(xiàn)出顯著不同的表達(dá)方式；急性高溫脅迫后，與性腺型芳香化酶基因(CYP19a1a)相比，腦型芳香化酶基因(CYP19a1b)的轉(zhuǎn)錄水平上升顯著，表明二者在不同組織中承擔(dān)著不同的生理功能；在妊娠期許氏平鲉腦中，CYP19a1b、E2、ERα間形成了自動(dòng)反饋調(diào)節(jié)，促進(jìn)CYP19a1b的轉(zhuǎn)錄；此外，F(xiàn)oxl2能夠促進(jìn)腦中芳香化酶的表達(dá)。研究結(jié)果表明，妊娠期許氏平鲉對(duì)高溫脅迫更敏感，所需恢復(fù)期更長(zhǎng)。在實(shí)際生產(chǎn)中，對(duì)于進(jìn)入生殖期的雌魚(yú)，應(yīng)密切關(guān)注養(yǎng)殖水溫的變化，減少溫度應(yīng)激。維持水溫的相對(duì)恒定，以保證親魚(yú)胚胎發(fā)育和產(chǎn)仔進(jìn)程的順利進(jìn)行。

許氏平鲉；溫度；生殖內(nèi)分泌機(jī)能；芳香化酶；雌激素受體

引用格式： 張亞晨，溫海深，李蘭敏，等. 急性溫度脅迫對(duì)妊娠期許氏平鲉生殖內(nèi)分泌機(jī)能的影響[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,46(9)： 29-37.

ZHANG Ya-Chen, WEN Hai-Shen, LI Lan-Min, et al. Effects of acute temperature stress on the reproductive endocrine function of gestational ovoviviparous black rockfish (Sebastesschlegelii) [J].Periodical of Ocean University of China, 2016,46(9)： 29-37.

硬骨魚(yú)類(lèi)作為一種低等的脊椎動(dòng)物，其生長(zhǎng)、發(fā)育與生殖進(jìn)程很容易受到外界環(huán)境的影響。其中，溫度對(duì)于魚(yú)類(lèi)的生殖過(guò)程起著至關(guān)重要的作用，包括配子發(fā)育、成熟、排卵或排精、產(chǎn)卵、胚胎發(fā)育與孵化等[1-3]。許多研究表明，水溫會(huì)改變下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸中各因素水平從而對(duì)魚(yú)類(lèi)的生殖進(jìn)程產(chǎn)生影響。在室溫范圍內(nèi)，溫度升高導(dǎo)致金錢(qián)魚(yú)(Scatophagusargus)性腺成熟指數(shù)(GSI)和血清E2水平的顯著升高[2]；高溫抑制性腺內(nèi)基因表達(dá)，阻礙性類(lèi)固醇激素合成酶的合成，使性腺功能受到干擾[3]；高溫還導(dǎo)致大西洋鮭(Salmosalar)在配子形成期性類(lèi)固醇合成和肝糖原生成受阻，使肝臟中ERs表達(dá)水平發(fā)生變化，進(jìn)而影響親魚(yú)的能量分配和配子的產(chǎn)生與成熟[4]；此外，低溫對(duì)魚(yú)類(lèi)生殖進(jìn)程的影響亦有報(bào)道，對(duì)文昌魚(yú)(Branchiostomalanceolatum)的研究發(fā)現(xiàn)，低溫條件下，文昌魚(yú)性腺趨于向雌性分化，這可能與溫度變化導(dǎo)致的芳香化酶合成和活性改變有關(guān)[5]。

魚(yú)類(lèi)的生殖過(guò)程主要受到HPG軸的調(diào)控，下丘腦、垂體和性腺形成一個(gè)閉合的自動(dòng)反饋體系，共同維持魚(yú)類(lèi)生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的相對(duì)穩(wěn)定，在性腺分化、發(fā)育、成熟及排卵過(guò)程中都發(fā)揮著十分重要的作用[6]。芳香化酶是細(xì)胞色素P450酶系的一種，主要分布在腦和性腺中，是一種催化C19雄激素(睪酮(T)和雄烯二酮不可逆地轉(zhuǎn)化為C18雌激素(E2和雌酮)過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶[7]，并通過(guò)其產(chǎn)物調(diào)控魚(yú)類(lèi)的生理和生殖過(guò)程。Foxl2能夠激活芳香化酶基因的轉(zhuǎn)錄[8]，參與性類(lèi)固醇的生物合成途徑。ERs是類(lèi)固醇激素核受體家族的一員，能夠間接調(diào)控雌激素生理功能的發(fā)揮[9]。此外，孕激素在魚(yú)類(lèi)生殖過(guò)程中也發(fā)揮著極重要的作用，例如17α，20β-雙羥孕酮(DHP)在鲉科魚(yú)的妊娠期中發(fā)揮了積極作用[10]。近年來(lái)針對(duì)孕酮(P4)的研究發(fā)現(xiàn)，它能夠調(diào)控雌魚(yú)卵巢的最終成熟和產(chǎn)卵[11]。

許氏平鲉(Sebastesschlegelii)又名黑鲪、黑石鱸、黑頭等，屬于鲉形目(Scorpaeniformes)鲉科(Scorpaenidae)平鲉屬(Sebastes)，主要分布在太平洋西部水域。該魚(yú)具有營(yíng)養(yǎng)豐富、生長(zhǎng)快速、抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已逐步成為人工魚(yú)礁區(qū)增殖、網(wǎng)箱和工廠化養(yǎng)殖的魚(yú)類(lèi)之一，具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。此外，由于許氏平鲉卵胎生生殖方式的特殊性，也使其成為魚(yú)類(lèi)進(jìn)化研究的模式動(dòng)物之一。在自然條件下，許氏平鲉妊娠期處于4～5月，水溫為10.0～16.8 ℃，產(chǎn)仔盛期適宜水溫為13～16 ℃。對(duì)于卵胎生和胎生魚(yú)類(lèi)，水體溫度與妊娠期親魚(yú)的生理狀況和胚胎發(fā)育情況均密切相關(guān)。因此親魚(yú)在此時(shí)期對(duì)溫度變化較敏感，水溫如發(fā)生急劇變化，會(huì)導(dǎo)致親魚(yú)的健康狀況、胚胎的發(fā)育情況發(fā)生改變，進(jìn)而影響產(chǎn)出仔魚(yú)的優(yōu)劣程度和種群補(bǔ)充。但目前關(guān)于溫度對(duì)妊娠期許氏平鲉的生理和生殖情況影響的研究鮮有報(bào)道。

為進(jìn)一步探索溫度對(duì)妊娠期許氏平鲉生殖內(nèi)分泌機(jī)能的影響，本文研究了妊娠期許氏平鲉的血清性類(lèi)固醇水平、腦和卵巢中生殖相關(guān)基因表達(dá)水平在急性溫度脅迫后的變化情況，為評(píng)估親魚(yú)在溫度突變水體中適應(yīng)性和恢復(fù)性提供理論依據(jù)，為優(yōu)化許氏平鲉全人工繁殖提供技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)類(lèi)

實(shí)驗(yàn)魚(yú)于2013年5月采自山東省蓬萊市沿海網(wǎng)箱養(yǎng)殖群體。挑選72尾健康無(wú)病的妊娠期許氏平鲉(體重(879.03±22.61)g)，實(shí)驗(yàn)前于20個(gè)玻璃水槽(長(zhǎng)×寬×高：80 cm×60 cm×40cm)中馴化3d，每缸4尾。馴化期間控制水溫在16℃左右，模擬自然光周期14L∶10D，連續(xù)充氣保持溶氧濃度在7mg/L左右，pH 7.5～7.8。每日上午10：00換水，換水量為1/2水槽水量。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置7、16(室溫對(duì)照)和25℃，共3個(gè)溫度水平。急性溫度脅迫實(shí)驗(yàn)在2個(gè)體積為0.785m3的圓柱形塑料桶(直徑1m，深度0.8m)中進(jìn)行。分別使用控溫加熱棒和海水冰塊將桶中海水溫度調(diào)至25和7℃。從馴化水槽中分別隨機(jī)選取24尾規(guī)格相近、活力較好的許氏平鲉放入7和25℃海水中，另保留剩余24尾于16℃水中作為常溫對(duì)照組。在高溫和低溫脅迫2h后，將其轉(zhuǎn)移至16℃海水中恢復(fù)。由于許氏平鲉親魚(yú)在產(chǎn)仔期停止攝食，因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不進(jìn)行投飼。實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)充氣，每隔4h校準(zhǔn)一次溫度；采用HQd便攜式多參數(shù)數(shù)字化分析儀(Hach，美國(guó))監(jiān)控海水溫度和溶解氧含量。

1.3 樣品采集與處理

在恢復(fù)期第0、6、12、24、48及72h對(duì)3組實(shí)驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行采樣，每組每次隨機(jī)取魚(yú)4尾。將魚(yú)投入含濃度為200mg/L的MS222的海水中麻醉，尾靜脈取血，血樣制備血清后移入-20℃保存待測(cè)；取血后采集卵巢組織和全部腦組織，于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血清中17β-雌二醇(E2)和P4水平的測(cè)定

使用碘[125]I雌二醇放射免疫分析試劑盒(九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司，天津)和碘[125]I孕酮放射免疫分析試劑盒，采用RIA液相平衡競(jìng)爭(zhēng)放射性免疫分析法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)魚(yú)血清中E2和P4水平的測(cè)定。具體測(cè)定方案參考Shi等[12]的方法。

1.5 卵巢和腦中CYP19a1a、Foxl2、ERα、ERβ1和ERβ2表達(dá)水平的分析方法

卵巢和腦組織中的總RNA按照trizol法提取。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TAKARA，日本)進(jìn)行總RNA的純化和cDNA的反轉(zhuǎn)錄。實(shí)驗(yàn)所需的CYP19a1b的特異性引物由Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)(見(jiàn)表1)。由前人研究結(jié)果得到CYP19a1a[13]、ERα[12]、ERβ1[14]、ERβ2[14]、Foxl2[13]和內(nèi)參基因βactin[15]的特異性引物。

表1　基因表達(dá)分析的特異性引物

采用SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TAKARA，日本)檢測(cè)CYP19a1a、CYP19a1b、Foxl2、ERα、ERβ1和ERβ2的表達(dá)水平；檢測(cè)過(guò)程在StepOnePlusTMReal-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國(guó))上進(jìn)行。

每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，特異性引物的退火溫度和循環(huán)數(shù)經(jīng)優(yōu)化后如下：95℃變性30s；95℃變性5s，60℃ 退火30s，此步驟循環(huán)40次。在PCR運(yùn)行結(jié)束后制作引物溶解曲線，分析其擴(kuò)增效率以確保引物特異性和產(chǎn)物的單一性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以βactin為內(nèi)參基因，根據(jù)2-△△CT方法計(jì)算得到各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，探究溫度和時(shí)間對(duì)血清性類(lèi)固醇水平和卵巢中生殖相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。若滿(mǎn)足方差齊性，作Student-Neuman-Keuls多重比較，分析不同溫度組間或不同恢復(fù)時(shí)間之間各指標(biāo)數(shù)據(jù)的差異顯著性；若不滿(mǎn)足方差齊性，則采用Games-Howell法進(jìn)行分析。以p<0.05表示差異顯著，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。

2　結(jié)果

2.1 血清E2和P4水平

如圖1所示，急性溫度脅迫后，血清E2水平在恢復(fù)期發(fā)生顯著變化。6h時(shí)25℃脅迫組顯著低于其他2組(p<0.05)，并在12h時(shí)降至最低值((4.66±0.88)pg/mL)，隨后逐漸上升，72h時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平；7℃脅迫組實(shí)驗(yàn)魚(yú)的血清E2水平呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)，12h時(shí)顯著升高(p<0.05)，增至(16.11±1.22)pg/mL，顯著高于25 ℃脅迫組和對(duì)照組(p<0.05)，24h時(shí)顯著降低，恢復(fù)至對(duì)照組水平(p<0.05)。血清P4水平在25 ℃急性脅迫后第6 h時(shí)顯著升高(p<0.05)，并在12 h升至最高值(6.32±0.74 ng/mL)，為對(duì)照組的3.05倍，48 h時(shí)顯著下降(p<0.05)，恢復(fù)至正常水平；7 ℃急性脅迫后血清P4水平無(wú)顯著變化(p>0.05)，始終維持在正常水平。

2.2 卵巢和腦中CYP19a和Foxl2基因表達(dá)水平

如圖2所示，25℃急性脅迫后，卵巢中CYP19a1a表達(dá)水平在恢復(fù)期第6h顯著下降(p<0.05)，并顯著低于其他2組(p<0.05)。12～24h其表達(dá)維持在較低水平，隨后逐漸上升，至72h時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平(p<0.05)。7 ℃急性脅迫后，CYP19a1a轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生顯著變化(p>0.05)。實(shí)驗(yàn)觀察到，2種溫度處理后，卵巢中Foxl2的表達(dá)水平有一定波動(dòng)，但無(wú)顯著差異(p>0.05)。

(圖中標(biāo)注的不同大寫(xiě)字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05)，不同小寫(xiě)字母表示同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)間存在顯著性差異(p<0.05)。Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

圖1急性溫度脅迫對(duì)妊娠期許氏平鲉血清E2和P4水平的影響

Fig.1Effect of acute temperature stress on serum 17β-estradiol and progesterone of gestationalSebastesschlegelii

(圖中標(biāo)注的不同大寫(xiě)字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05)，不同小寫(xiě)字母表示同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)間存在顯著性差異(p<0.05)。Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

圖2急性溫度脅迫對(duì)妊娠期許氏平鲉卵巢中CYP19a1a和Foxl2表達(dá)水平的影響

Fig.2Effect of acute temperature stress on expression levels of CYP19a1a and Foxl2 mRNAs in ovary of gestationalSebastesschlegelii

如圖3所示，25℃急性脅迫后，腦中CYP19a1b和Foxl2表達(dá)水平均在6h時(shí)顯著升高(p<0.05)，與對(duì)照組差異顯著(p<0.05)，分別為正常水平的1.66倍和2.11倍。隨后二者轉(zhuǎn)錄水平逐漸恢復(fù)至對(duì)照組水平。7℃急性脅迫后的72h恢復(fù)期內(nèi)，CYP19a1b的表達(dá)水平呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)，但此變化與對(duì)照組水平差異并不顯著(p>0.05)。

(圖中標(biāo)注的不同大寫(xiě)字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05)，不同小寫(xiě)字母表示同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)間存在顯著性差異(p<0.05).Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

圖3急性溫度脅迫對(duì)妊娠期許氏平鲉腦中CYP19a1b和Foxl2表達(dá)水平的影響

Fig. 3Effect of acute temperature stress on expression levels of CYP19a1b and Foxl2 mRNAs in brain of gestationalSebastesschlegelii

2.3 卵巢和腦中ERα表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，7 ℃脅迫組的實(shí)驗(yàn)魚(yú)卵巢中ERα轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(p<0.05)，12h時(shí)增至對(duì)照組的1.67倍，恢復(fù)期第24h時(shí)恢復(fù)至正常水平；25℃脅迫組中，ERα表達(dá)水平在脅迫后恢復(fù)期第6h顯著下降(p<0.05)，并在12h降至最低，與其他溫度組水平差異顯著(p<0.05)。隨后緩慢升高恢復(fù)。腦中ERα的表達(dá)水平在25℃急性脅迫后恢復(fù)第6h時(shí)顯著升高(p<0.05)，顯著高于其他2組，為對(duì)照組水平的1.97倍，并在12h時(shí)恢復(fù)正常；與此不同的是，在7℃急性脅迫后，腦中ERα轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著變化(p>0.05)，與對(duì)照組持平(見(jiàn)圖4)。

(圖中標(biāo)注的不同大寫(xiě)字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05)，不同小寫(xiě)字母表示同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)間存在顯著性差異(p<0.05).Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

圖4急性溫度脅迫對(duì)妊娠期許氏平鲉卵巢和腦中ERα表達(dá)水平的影響

Fig.4Effect of acute temperature stress on expression levels of ERα mRNAs in ovary and brain of gestationalSebastesschlegelii

2.4 卵巢和腦中ERβ1、ERβ2表達(dá)水平

如圖5所示，急性溫度脅迫后，許氏平鲉卵巢中ERβ2表達(dá)水平無(wú)顯著變化(p>0.05)。而ERβ1的表達(dá)水平在25℃急性脅迫后恢復(fù)期第6h顯著升高(p<0.05)，并與對(duì)照組差異顯著，增至對(duì)照組的1.72倍，隨后逐漸下降，在第72h時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平。

(圖中標(biāo)注的不同大寫(xiě)字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05)，不同小寫(xiě)字母表示同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)間存在顯著性差異(p<0.05).Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

圖5急性溫度脅迫對(duì)妊娠期許氏平鲉卵巢中ERβ1、ERβ2表達(dá)水平的影響

Fig.5Effect of acute temperature stress on expression levels of ERβ1 and ERβ2 mRNAs in ovary of gestationalSebastesschlegelii

此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，許氏平鲉腦中ERβ1、ERβ2的表達(dá)水平在7℃和25℃急性脅迫后均無(wú)顯著變化(p<0.05)(見(jiàn)圖6)。

(圖中標(biāo)注的不同大寫(xiě)字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05)，不同小寫(xiě)字母表示同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)間存在顯著性差異(p<0.05).Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

圖6急性溫度脅迫對(duì)妊娠期許氏平鲉腦中ERβ1、ERβ2表達(dá)水平的影響

Fig.6Effect of acute temperature stress on expression levels of ERβ1 and ERβ2 mRNAs in brain of gestational Sebastes schlegelii

3　討論

魚(yú)類(lèi)代謝水平和酶活力會(huì)受到水環(huán)境溫度的影響，因此，溫度對(duì)于魚(yú)類(lèi)的生殖過(guò)程起著至關(guān)重要的作用，包括配子發(fā)育和成熟、排卵和排精、胚胎發(fā)育和孵化、仔稚魚(yú)存活和生長(zhǎng)發(fā)育等[1-2，10]。研究發(fā)現(xiàn)，高溫能夠抑制性腺內(nèi)基因表達(dá)，阻礙性類(lèi)固醇激素合成酶的合成，使性腺功能受到干擾，這也導(dǎo)致性類(lèi)固醇激素(如E2、睪酮(T))含量顯著升高[3]；當(dāng)水環(huán)境溫度超過(guò)魚(yú)類(lèi)的生殖適宜溫度時(shí)，HPG軸上的一些因子會(huì)發(fā)生變化來(lái)影響性腺發(fā)育，進(jìn)而阻礙產(chǎn)卵進(jìn)程[15]。

針對(duì)真鯛(Pagrosomusmajor)[16]、大西洋鮭[17]等開(kāi)展的溫度調(diào)控實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高溫會(huì)抑制芳香化酶基因的表達(dá)，阻礙卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟。本研究發(fā)現(xiàn)，25℃急性脅迫后，許氏平鲉卵巢中CYP19a1a的表達(dá)水平發(fā)生了顯著降低，芳香化酶具有溫度敏感性。真鯛在20℃以上的水環(huán)境中養(yǎng)殖4～8周后其CYP19a1a的表達(dá)水平受到抑制[17]。此外，這種溫度敏感性在許多物種的性分化和性別決定方面都有較詳盡的闡述[18]。芳香化酶作為一種不可逆催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的關(guān)鍵限速酶，其產(chǎn)物—E2的水平與其溫度敏感性也有密切關(guān)系。Watts等[18]認(rèn)為，溫度對(duì)性類(lèi)固醇合成和卵母細(xì)胞發(fā)育的顯著影響，一定程度上是由于P450芳香化酶的溫度調(diào)控作用。高溫會(huì)抑制芳香化酶基因表達(dá)，從而可能導(dǎo)致E2合成受阻，阻礙了雌魚(yú)的生殖進(jìn)程[3]。本實(shí)驗(yàn)中，25℃急性脅迫后，實(shí)驗(yàn)魚(yú)血清E2顯著降低，是性腺中芳香化酶表達(dá)水平變化的結(jié)果[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，一些卵胎生魚(yú)的血清E2水平在妊娠后期發(fā)生波動(dòng)，推測(cè)除了卵黃積累時(shí)期，其在妊娠期也承擔(dān)一定的生理功能[19]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)魚(yú)的血清E2水平會(huì)隨溫度產(chǎn)生顯著變化，證實(shí)了前人的研究結(jié)果，E2在妊娠期與其他因子共同發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)親魚(yú)的生理代謝和生殖內(nèi)分泌機(jī)能。

25 ℃急性脅迫后，妊娠期許氏平鲉血清中的P4水平也發(fā)生了顯著變化，分析認(rèn)為P4在妊娠期也參與調(diào)控生殖內(nèi)分泌水平。Nagahama等[20]對(duì)鲉科魚(yú)類(lèi)的研究發(fā)現(xiàn)，血清P4水平在妊娠后期出現(xiàn)了短暫的高峰，而此時(shí)DHP也處于峰值水平，由于P4是DHP的前體類(lèi)固醇[6]，它可能會(huì)隨后者的水平變化產(chǎn)生一定波動(dòng)，但也不能排除這種波動(dòng)可能與P4在妊娠期活動(dòng)中直接發(fā)揮其生理功能有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，急性高溫脅迫后，卵巢中ERα表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與血清E2相一致，都發(fā)生了顯著降低。Shi等[12]研究認(rèn)為ERα和E2的變化趨勢(shì)具有相關(guān)性，ERs的表達(dá)水平可能受到E2的誘導(dǎo)。7℃急性脅迫后，許氏平鲉卵巢中ERα表達(dá)水平和血清E2水平均在脅迫后12h顯著高于其他2組。有學(xué)者研究了大西洋鮭肝臟中ERs與E2的結(jié)合特性，結(jié)果表明，高溫會(huì)導(dǎo)致二者的結(jié)合率下降[21]，使ERα表達(dá)水平降低。盡管如此，目前仍不能確定ERα的變化是受到溫度脅迫的直接影響，還是由于血清E2水平變化所導(dǎo)致的間接影響。溫度對(duì)性腺ERα的表達(dá)和血清E2的作用機(jī)制還需要深入探討。

在魚(yú)類(lèi)性腺中，與ERα典型依賴(lài)E2的調(diào)控方式相比，ERβ的調(diào)控方式受到很多因素的影響，包括生殖周期的不同階段、配體、物種差異性等[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，在急性高溫脅迫后，與ERα的變化趨勢(shì)相反，許氏平鲉卵巢中ERβ1表達(dá)水平顯著升高。一些針對(duì)哺乳動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)，ERβ常以一種抗ERα的方式發(fā)揮其生物學(xué)作用[23]，推測(cè)本研究結(jié)果可能與上述的假設(shè)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，某些魚(yú)類(lèi)肝臟中ERβ2的表達(dá)量很高，卻未檢測(cè)到ERβ1的表達(dá)，有學(xué)者認(rèn)為ERβ2的高轉(zhuǎn)錄水平可能與雌激素在肝臟中的誘導(dǎo)卵黃生成作用有關(guān)，在卵黃積累過(guò)程中發(fā)揮了主要作用[24]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)性腺中ERβ2表達(dá)水平無(wú)顯著變化，推測(cè)對(duì)于許氏平鲉該亞型可能也在卵黃生成期發(fā)揮其生理功能，而在妊娠期的作用相對(duì)較弱。

P450aromB在卵生魚(yú)類(lèi)產(chǎn)卵期和卵胎生魚(yú)類(lèi)妊娠期的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控中發(fā)揮重要作用，可能涉及神經(jīng)和突觸發(fā)生、細(xì)胞增殖、凋亡和遷徙以及細(xì)胞分化等關(guān)鍵過(guò)程，組織和調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌循環(huán)，從而對(duì)脊椎動(dòng)物的生殖機(jī)能起到調(diào)控作用[25]。急性高溫脅迫后，卵巢處于Ⅴ期的黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)CYP19a1b轉(zhuǎn)錄水平顯著增高[26]；尼羅羅非魚(yú)(Tilapianilotica)在32℃脅迫后，CYP19a1b表達(dá)水平也發(fā)生了明顯的升高[27]。對(duì)于許氏平鲉的研究發(fā)現(xiàn)，CYP19a1b表達(dá)水平在妊娠期達(dá)到頂峰[28]。在本實(shí)驗(yàn)中，妊娠期許氏平鲉腦中CYP19a1b的轉(zhuǎn)錄水平在25℃急性脅迫后顯著升高。分析認(rèn)為，許氏平鲉腦中P450aromB受溫度調(diào)控的方式與性腺中P450aromA相比有很大差別，這可能是由于承擔(dān)的生理功能存在差異。妊娠期親魚(yú)在受到急性溫度脅迫后，需要較高的雌激素水平來(lái)維持腦中相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境，從而保證對(duì)下游內(nèi)分泌過(guò)程調(diào)控作用的正常進(jìn)行。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類(lèi)腦中E2水平和芳香化酶表達(dá)量最豐富的區(qū)域，也是ERs表達(dá)水平最高的區(qū)域[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，在25℃急性脅迫后，妊娠期許氏平鲉腦中ERα表達(dá)水平在6h顯著升高，與CYP19a1b表達(dá)的變化情況相一致。分析認(rèn)為，ERα、E2及CYP19a1b在腦中形成的自動(dòng)反饋調(diào)節(jié)通路[30]，對(duì)于維持腦中的神經(jīng)內(nèi)分泌代謝穩(wěn)定具有重要意義，從而對(duì)處于生殖期魚(yú)類(lèi)的生殖內(nèi)分泌水平起到調(diào)節(jié)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，妊娠期許氏平鲉腦中ERβ的轉(zhuǎn)錄水平在25℃脅迫后無(wú)顯著變化。對(duì)牙漢魚(yú)(Odontesthesbonariensis)[31]的研究發(fā)現(xiàn)，相較于ERβ1和ERβ1，ERα與CYP19a1b具有更緊密的神經(jīng)和功能聯(lián)系。

Mu等[13]針對(duì)許氏平鲉研究發(fā)現(xiàn)，在性腺發(fā)育階段，性腺中Foxl2表達(dá)量最高的階段早于CYP19a1a，且二者表達(dá)水平顯著相關(guān)。此外，雌激素還能夠促進(jìn)Foxl2的表達(dá)。然而，在本研究中，急性溫度脅迫并未引起妊娠期許氏平鲉卵巢中Foxl2表達(dá)水平的變化。對(duì)于尼羅羅非魚(yú)的研究發(fā)現(xiàn)，一種調(diào)節(jié)因子Sf1能夠與Foxl2共同作用來(lái)調(diào)節(jié)CYP19a1a的表達(dá)[8]。本研究中Foxl2的表達(dá)情況是否是由于受到sf1的影響而未發(fā)生變化，有待進(jìn)一步研究。在許氏平鲉腦中，F(xiàn)oxl2的表達(dá)與CYP19a1b顯著相關(guān)[13]，關(guān)于虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[32]的研究也有類(lèi)似的報(bào)道。本研究中，急性高溫脅迫后，妊娠期許氏平鲉腦中Foxl2和CYP19a1b的表達(dá)水平均顯著升高，表明腦中foxl2對(duì)CYP19a1b轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在7℃急性脅迫后，許氏平鲉腦和卵巢中多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平均未檢測(cè)到顯著變化。分析可能是親魚(yú)對(duì)低溫脅迫較不敏感，也有可能是脅迫時(shí)間較短或脅迫溫度仍在閾值范圍內(nèi)。低溫對(duì)妊娠期許氏平鲉腦中繁殖相關(guān)基因的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

綜合分析發(fā)現(xiàn)，腦和卵巢中的生殖內(nèi)分泌活動(dòng)可能存在緊密聯(lián)系。Cheshenko等[33]發(fā)現(xiàn)，腦中CYP19a1b可能參與卵巢生殖周期的調(diào)控；對(duì)鮈杜父魚(yú)(Cottusgobio)的研究發(fā)現(xiàn)，溫度升高4℃導(dǎo)致其產(chǎn)卵期提前，這對(duì)配子發(fā)育產(chǎn)生了一定影響[34]；還有一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，高溫條件下產(chǎn)出的胚胎，其孵化出的仔魚(yú)成活率會(huì)顯著降低[35]?？傊?，水環(huán)境溫度的劇烈變化可能會(huì)引起HPG軸自上而下發(fā)生一系列生殖內(nèi)分泌變化，最終對(duì)親魚(yú)及仔魚(yú)產(chǎn)生極大影響。

4　結(jié)論

本研究首次報(bào)道了溫度對(duì)妊娠期許氏平鲉生殖內(nèi)分泌機(jī)能的影響，對(duì)卵胎生魚(yú)類(lèi)的養(yǎng)殖具有重要的理論意義。研究結(jié)果表明，急性溫度脅迫對(duì)妊娠期許氏平鲉的血清性類(lèi)固醇水平、性腺和腦中生殖相關(guān)基因表達(dá)水平均有顯著影響，且親魚(yú)對(duì)高溫脅迫的敏感性遠(yuǎn)大于低溫脅迫，所需恢復(fù)期也更長(zhǎng)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類(lèi)在受到外界環(huán)境脅迫時(shí)，機(jī)體各層次的代謝水平和生理狀況都發(fā)生了相應(yīng)變化，不同因子間是相互貫通、相互依存、不可分割的，共同維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。綜上所述，在許氏平鲉的養(yǎng)殖和親魚(yú)培育過(guò)程中，注意防范水溫的驟變顯得尤為重要。維持水溫的相對(duì)恒定，以保證親魚(yú)胚胎發(fā)育和產(chǎn)仔進(jìn)程的順利進(jìn)行。

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責(zé)任編輯朱寶象

Effects of Acute Temperature Stress on the Reproductive Endocrine Function of Gestational Ovoviviparous Black Rockfish (Sebastesschlegelii)

ZHANG Ya-Chen, WEN Hai-Shen, LI Lan-Min, FENG Qi-Chao

(The Key Laboratory of Mariculture， Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003，China)

This study mainly examinedthe effects of temperature on the reproductive endocrine function of gestational ovoviviparous black rockfish,Sebastesschlegelii. Serum sexual steroids hormones and gene expression related to the reproduction in ovary and brain were detected using endocrinological and molecular biological methods after acute temperature stress (thermal stress, 25℃; chilling stress, 7℃; control, 16℃). Results showed that P450 aromatase A (P450aromA) is sensitive to temperature in gestational black rockfish. The results indicated that the concentration of serum 17β-estradiol (E2) and the expression level of estrogen receptors α (ERα) gene decreased significantlyafteracute heat shock, which were found to be up-regulated after acute chilling stress. On the other hand, expression levels of estrogen receptors β 1(ERβ1) and estrogen receptors β 2(ERβ2) genes varied with different factors. As a precursor of 17α-hydroxy-20β- dihydroprogesterone (DHP), serum progesterone (P4) was thought to have some unknown functions during gestation of black rockfish. No significant change was found in expression level of transcription factor Foxl2 gene in acute heat or cold shock, which might indicate the participation of some other regulators. The expression level of cytochrome P450 19a1b (CYP19a1b) gene in brain elevated significantly in acute thermal stress, which was different from cytochrome P450 19a1a (CYP19a1a) gene in ovary, indicating distinct physiological functions of CYP19s among tissues. It was tentatively suggested that there was an auto-feedback loop involved in regulating expression levels of CYP19a1b, E2and ERα gene in order to promote transcription of CYP19a1b gene. In addition, the results indicated that the expression of aromatase can be up-regulated by Foxl2 in brain. The results indicated the heat-sensitivity of gestational black rockfish require longer recovery time after thermal challenge. When female fish enter the reproductive phase, itwas of great importance to monitor water temperature closely, toavoid damage induced by temperature stress during pregnancy. It was suggested that maintaining the water temperature constant or less changed could benefit the embryonic development and delivery process of gestataional black rockfish.

Sebastesschlegelii; temperature; reproductive endocrine function; aromatase; estrogen receptor

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41176122)；教育部博士點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目(20120132110008)資助

2015-07-13；

2016-03-30

張亞晨(1990-)， 女, 碩士生，研究方向: 魚(yú)類(lèi)生理學(xué)。.E-mail: 494870744@qq.com

??通訊作者：E-mail: wenhaishen@ouc.edu.cn

S945.4; S955.486

A

1672-5174(2016)09-029-09

10.16441/j.cnki.hdxb. 20150254

Supported by the National Science Foundation of China (41176122)；Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China(20120132110008)