李莉莉，王鶴蓉，周芷亦，羅 婧，周玉柏，曾 毅

（1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，環(huán)境病毒學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100124；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100052）

TC-1-HPV16L1細(xì)胞模型與動(dòng)物模型的建立與評(píng)價(jià)

李莉莉1，王鶴蓉1，周芷亦1，羅 婧1，周玉柏1，曾 毅2

（1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，環(huán)境病毒學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100124；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100052）

為了解決人乳頭瘤病毒16型L1蛋白（HPV16L1）為主要靶點(diǎn)的疫苗缺乏腫瘤模型細(xì)胞來驗(yàn)證疫苗的免疫效果的問題，構(gòu)建了一個(gè)細(xì)胞模型并可以利用此細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)形成腫瘤，用于以HPV16L1為主要靶點(diǎn)疫苗的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).利用這個(gè)模型細(xì)胞或腫瘤模型可以在體內(nèi)外檢測(cè)疫苗的免疫學(xué)性質(zhì)和保護(hù)功效.首先，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的方法獲得目標(biāo)基因HPV16L1的基因序列并連接到載體質(zhì)粒中，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞TC-1后在殺稻瘟菌素抗性壓力篩選下獲得穩(wěn)定表達(dá)HPV16L1的細(xì)胞株.對(duì)TC-1和TC-1-HPV16L1兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和成瘤特性進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，外源基因的加入對(duì)細(xì)胞特性沒有影響.通過體外殺傷實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞TC-1-HPV16L1能夠被HPV16L1靶點(diǎn)疫苗免疫過的小鼠脾淋巴細(xì)胞殺傷.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被疫苗免疫后，進(jìn)行攻瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)疫苗只對(duì)TC-1-HPV16L1組具有保護(hù)作用.綜上，在本研究中成功地構(gòu)建了可以檢測(cè)HPV16L1疫苗的抑瘤效果的模型細(xì)胞TC-1-HPV16L1，為HPV疫苗的研究提供了一個(gè)模型細(xì)胞.

細(xì)胞模型；動(dòng)物模型；人乳頭瘤病毒16型L1蛋白

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一類常見的主要感染上皮黏膜細(xì)胞的小DNA雙鏈病毒［1-2］.世界范圍內(nèi)乳頭瘤病毒多達(dá)200多個(gè)亞型.HPV基因組編碼9個(gè)開放閱讀框，其中編碼早期基因有7個(gè)，分別為E1～E7；編碼晚期基因有2個(gè)，分別為L(zhǎng)1和L2，非編碼區(qū)調(diào)控病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制［3］.目前已經(jīng)公認(rèn)HPV是人子宮頸癌發(fā)生最重要的致病因子，99.7%的宮頸癌病人的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了HPV的存在［4］.流行病學(xué)研究表明，超過50%的口咽鱗狀細(xì)胞癌與HPV病毒感染相關(guān)［5］.在HPV感染引起的腫瘤中，70%以上人群感染了HPV16、HPV18兩個(gè)亞型［6］.

HPV病毒的晚期蛋白L1可以單獨(dú)或與L2一同自發(fā)組裝成為病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs），而VLPs是預(yù)防型疫苗的重要組成部分，在未感染的人體內(nèi)可以激發(fā)起強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答，使機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的中和抗體達(dá)到保護(hù)作用［7］.但是，以VLPs作為治療型疫苗的大型臨床實(shí)驗(yàn)由于沒有產(chǎn)生有效的治療作用以失敗告終［8］.將HPVL1蛋白抗原利用病毒等載體遞送到動(dòng)物體內(nèi)，則可以有效利用載體的特性激發(fā)動(dòng)物的細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而達(dá)到殺傷病毒感染細(xì)胞的目的.與E6、E7這兩個(gè)癌基因不同，L1蛋白與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化無(wú)關(guān).在HPV病毒感染細(xì)胞并發(fā)生轉(zhuǎn)化過程中，L1基因表達(dá)逐漸減少，有研究報(bào)道，L1蛋白在輕度/中度/重度不典型病變期（CINI/II/III）的表達(dá)分別為:83.53%、41.81%、3.13%［9］.正是因?yàn)長(zhǎng)1在HPV感染早期有著較高的表達(dá)人群，使之成為HPV感染早期免疫干預(yù)的重要靶點(diǎn).

目前，HPV感染的預(yù)防性疫苗Cervarix［10］和Gardasil［11］已經(jīng)在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家上市，對(duì)預(yù)防HPV的感染起到了積極作用.對(duì)HPV感染后引起的病變與原位癌的治療也在積極的研究中.但是，由于HPV病毒的特性至今無(wú)法在體外進(jìn)行培養(yǎng)，又沒有合適的易感動(dòng)物模型，這給HPV病毒疫苗和藥物的研發(fā)帶來了不便.TC-1細(xì)胞是約翰霍普金斯大學(xué)的研究組在1996年構(gòu)建的用于HPV16型腫瘤治療型疫苗研究的模型細(xì)胞株［12］.具體的構(gòu)建過程是，將攜帶有HPV16型病毒E6和E7基因的質(zhì)粒（LXSN16E6E7）轉(zhuǎn)染到C57BL/6小鼠的肺上皮細(xì)胞中，由于E6、E7基因與病毒的細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，當(dāng)E6和E7基因整合到小鼠肺上皮細(xì)胞時(shí)細(xì)胞發(fā)生了永生化.當(dāng)把這株細(xì)胞移植到C57BL/6小鼠體內(nèi)時(shí)，小鼠會(huì)有攜帶有E6、E7基因的腫瘤發(fā)生，從而使TC-1成為以E6、E7為靶點(diǎn)的抗HPV腫瘤藥物的常用模型細(xì)胞.在本研究中，構(gòu)建轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后將HPV16L1基因整合到TC-1細(xì)胞基因組中，使TC-1細(xì)胞不但能夠表達(dá)HPV16的E6和E7蛋白，還能夠穩(wěn)定表達(dá)L1蛋白，從而使之還可以用于以HPV16L1為靶點(diǎn)的疫苗的研究中.

1　材料

質(zhì)粒pCDNA3.1-blasticidin、pAAV-HPV 16 L1和TC-1細(xì)胞由北京工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院病毒藥理研究所保存.限制性內(nèi)切酶EcoRI-HF和NotI-HF購(gòu)自NewEnglandBiology公司.T4連接酶、Golden Easy PCR System、Pfu DNA Polymerase、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自于天根生化科技（北京）有限公司.DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS、PBS、HBSS、GlutaMAX、HEPES、Penicillin-Streptomysin及Trypsin-EDTA（0.25%）購(gòu)自Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑FuGENE 6 Transfection Reagent購(gòu)于Roche公司；HPV 16L1的單克隆抗體購(gòu)于Millipore公司.Quant一步法RT-PCR試劑盒、RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司.DNA疫苗（pVR16-HPV16L1）、痘苗病毒載體疫苗（MVA-HPV16L1）和DNA-IL-15均由北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)和生物工程學(xué)院病毒藥理研究所構(gòu)建并保存.

2　方法

2.1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的獲得與篩選

2.1.1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCDNA3.1-HPV16L1的構(gòu)建

根據(jù)HPV16L1基因序列設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物.上游引物為P16L1-f:GGAATTCATGAGCCTGTGGCTGCCCAG CGAGGC，下游引物P16L1-r:ATTTGCGGCCGCTC ACAGCTTCCTCTTCTTCCTCTTGG.以質(zhì)粒pAAVHPV 16 L1基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR.通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件獲得滿足實(shí)驗(yàn)需要的目標(biāo)基因片段，利用限制性內(nèi)切酶EcoRI-HF和NotI-HF對(duì)PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pCDNA3.1同時(shí)進(jìn)行雙酶切，利用T4DNA連接酶將HPV16 L1基因片段連接到pCDNA3.1的多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞top10中凍存，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè)定.

2.1.2最佳殺稻瘟菌素（blasticidin）篩選質(zhì)量濃度的確認(rèn)

取未轉(zhuǎn)染TC-1細(xì)胞按5×104個(gè)/孔接種至24孔板中，培養(yǎng)18～24 h.按質(zhì)量濃度50、100、200、400、500、800 μg/mL加入blasticidin，每3 d換液1次，保持blasticidin質(zhì)量濃度不變，10～14 d內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小質(zhì)量濃度即為最佳篩選質(zhì)量濃度.

2.1.3轉(zhuǎn)染

將質(zhì)粒pCDNA3.1-blasticidin-HPV16L1轉(zhuǎn)染到TC-1細(xì)胞中.將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)到單層細(xì)胞鋪滿50%六孔板孔底，100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基將6 μL轉(zhuǎn)染試劑Fugene稀釋后將1 μg質(zhì)粒加入其中，室溫孵育15 min后滴加到六孔板的單層細(xì)胞中，在溫度為37℃，CO2的體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

2.1.4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系篩選

轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h的細(xì)胞進(jìn)行傳代，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿T25培養(yǎng)底部面積50%時(shí)換液加入含400 μg/mL blasticidin的培養(yǎng)基.在溫度為37℃、CO2占?xì)怏w體積5%為培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，16～20 d后獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系TC-1-HPV16L1.

2.2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系TC-1-HPV16L1的鑒定

2.2.1TC-1-HPV16L1細(xì)胞中HPV16L1的表達(dá)與穩(wěn)定性鑒定

將TC-1-HPV16L1細(xì)胞在沒有殺稻瘟菌素的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)傳代培養(yǎng).將第5代和第10代細(xì)胞置于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，經(jīng)胰酶消化收集到離心管中，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌后，經(jīng)3 000 r/min離心5 min得到細(xì)胞.利用western blot法鑒定HPV16L1蛋白的表達(dá).具體過程:細(xì)胞樣品分別加入還原型上樣緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE電泳.經(jīng)過轉(zhuǎn)膜和封閉后，孵育一抗（即抗HPV16L1的單克隆抗體），洗滌后再孵育熒光標(biāo)記的二抗.洗滌后，在Odyssey遠(yuǎn)紅外影像分析儀中進(jìn)行掃膜，觀測(cè)結(jié)果.

2.2.2免疫組化鑒定

將1×105個(gè)細(xì)胞接種到C57BL/6小鼠體內(nèi)，在腫瘤細(xì)胞接種后第20 d和第30 d分別處死一只長(zhǎng)有細(xì)胞TC-1-HPV16L1腫瘤的小鼠，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫組化鑒定，檢測(cè)是否有HPV 16 L1的表達(dá).本實(shí)驗(yàn)由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成并出具結(jié)果.

2.2.3轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生長(zhǎng)情況變化鑒定

TC-1-HPV16L1以104個(gè)/孔接種至E-Plate L8檢測(cè)板中，將檢測(cè)板置入iCELLigence主機(jī)，程序設(shè)置后，對(duì)細(xì)胞在培養(yǎng)板中的貼壁率進(jìn)行監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)72 h后，將結(jié)果導(dǎo)出，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

2.3體外殺傷實(shí)驗(yàn)

為了檢測(cè)TC-HPV16L1細(xì)胞中所含的HPV16抗原，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了小鼠淋巴細(xì)胞體外殺傷實(shí)驗(yàn).經(jīng)DNA疫苗（pVR16-HPV16L1）初免（prime）并經(jīng)過痘苗病毒載體疫苗（MVA-HPV16L1）與免疫增強(qiáng)作用的DNA-IL-15加強(qiáng)（boost）后，將C57BL/6小鼠脫頸處死后取脾.研磨后過300目篩網(wǎng)，加入5 mLPBS，經(jīng)500 r/min離心5 min，去掉上清后加入5 mL紅細(xì)胞裂解液重懸，裂解5 min后，經(jīng)500 r/min離心5 min，去掉上清后以5 mLDMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并計(jì)數(shù).分別將TC-1-HPV16L（5×103個(gè)/100 μL）和小鼠脾淋巴細(xì)胞（1×105個(gè)/100 μL）加入到E-PlateL8的2個(gè)孔中作為對(duì)照.在另外2個(gè)孔中加入TC-1-HPV16L1和疫苗免疫過的小鼠脾淋巴細(xì)胞的混合物，并加入可以刺激小鼠淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞免疫的肽段.將檢測(cè)板置入iCELLigence主機(jī)，對(duì)細(xì)胞在培養(yǎng)板中的貼壁率進(jìn)行監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)80 h后，將結(jié)果導(dǎo)出，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

2.4動(dòng)物模型的建立與鑒定

本實(shí)驗(yàn)需要50只6～8周齡的C57BL/6小鼠，在右側(cè)腹股溝皮下分別接種不同數(shù)量的TC-1細(xì)胞和TC-1-HPV16L1細(xì)胞，分組與細(xì)胞接種量如表1所示，接種后每2 d觀察1次腫瘤出現(xiàn)及生長(zhǎng)情況.記錄接種后最早捫及腫瘤的時(shí)間、各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度及存活情況.最大接種量組小鼠的存活時(shí)間繪制生存曲線.

2.5疫苗誘導(dǎo)小鼠抵抗TC-1-HPV16L1腫瘤細(xì)胞攻擊免疫保護(hù)檢測(cè)

將20只6～8周齡的C57BL/6小鼠分為4組，見表1.其中，疫苗組在第0周免疫pVR16-HPV16L1（DNA疫苗）50 μg/只，在第2周免疫M(jìn)VAHPV16L1（痘苗病毒載體疫苗）1×107pfu/只，同時(shí)注射pVR-IL-15（增強(qiáng)免疫作用）50 μg/只，pfu指空斑形成單位，PBS組則注射與疫苗等體積的PBS作為對(duì)照.在免疫完成后1周，在每只小鼠腹股溝皮下分別注射2×106/100 μL的TC-1-HPV16L1細(xì)胞.每3 d測(cè)量腫瘤大小，并記錄最早捫及腫瘤的時(shí)間和小鼠的生存情況.

表1　腫瘤細(xì)胞攻擊實(shí)驗(yàn)免疫動(dòng)物分組與細(xì)胞數(shù)量表Table 1 Grouping and cell number of animals in tumor challenge experiments

3　結(jié)果

3.1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCDNA3.1-blasticidin-HPV16L1的構(gòu)建

轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCDNA3.1-blasticidin-HPV16L1的構(gòu)建見圖1.

利用PCR的方法擴(kuò)增獲得大小為1 518堿基對(duì)（base pair，bp）的片段，測(cè)序后與HPV16L1的基因序列完全一致.經(jīng)過酶切和連接反應(yīng)后，將獲得新質(zhì)粒pCDNA3.1-luc轉(zhuǎn)染到Top10感受態(tài)細(xì)胞中.擴(kuò)增培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定與基因序列測(cè)定，結(jié)果與預(yù)期完全一致.

3.2篩選到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HPV16L1的TC-1細(xì)胞鑒定

3.2.1TC-1-HPV16L1細(xì)胞中HPV16L1的表達(dá)與穩(wěn)定性鑒定

HPV16L1基因如果整合到TC-1細(xì)胞的基因組中，HPV16L1蛋白便可以表達(dá)，并且在傳代的過程中不會(huì)丟失.利用Western blot法，鑒定壓力篩選后以及經(jīng)過5代和10代傳代后的TC-1-HPV16L1細(xì)胞中HPV16L1蛋白的表達(dá)情況，即可知道外源基因在TC-1細(xì)胞中的表達(dá)以及穩(wěn)定情況.由圖2（a）可見，在壓力篩選后獲得的細(xì)胞有目標(biāo)蛋白HPV16L1的表達(dá)，由圖2（b）可見，在傳代5代和10代后，HPV16L1表達(dá)良好，說明外源基因已經(jīng)整合到細(xì)胞基因組，并穩(wěn)定表達(dá).

3.2.2免疫組化鑒定

將TC-1細(xì)胞和TC-1-HPV16L1細(xì)胞分別接種到小鼠體內(nèi)可以在很短時(shí)間內(nèi)形成腫瘤，將腫瘤取出后，進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，以鑒定HPV16L1蛋白在細(xì)胞成瘤以后的表達(dá)情況.圖3（a）為TC-1的免疫組化結(jié)果，圖3（b）為TC-1-HPV16L1的免疫組化結(jié)果.2張圖均為400倍放大，對(duì)比可見被染色為深色區(qū)域的為HPV16L1的抗原-抗體特異性免疫反應(yīng)后染色結(jié)果.在TC-1-HPV16L1細(xì)胞形成的腫瘤細(xì)胞中有明顯的HPV16L1蛋白的表達(dá).

3.2.3外源基因HPV16L1的加入對(duì)TC-1細(xì)胞培養(yǎng)增殖情況的影響

外源基因的加入有可能對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖產(chǎn)生一定的影響，利用檢測(cè)2種細(xì)胞在相同培養(yǎng)條件下，即:相同的起始細(xì)胞數(shù)量、相同的培養(yǎng)基、相同的培養(yǎng)環(huán)境下，對(duì)細(xì)胞的貼壁情況進(jìn)行檢測(cè).由圖4可知，代表細(xì)胞貼壁情況的參數(shù)細(xì)胞系數(shù)（cell index，CI），在大約前3 h由0.01達(dá)到0.18.反應(yīng)了細(xì)胞由懸浮到貼壁的一個(gè)過程.在第3～14 h內(nèi)，CI由0.18上升到0.53，也就是貼壁的細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)了大約3倍.細(xì)胞由10 000個(gè)增殖到了大約30 000個(gè).由于E-plateL8板孔的體積和孔底表面有限，細(xì)胞在增殖到頂峰后，數(shù)量開始下降.圖4中2條曲線分別代表TC-1細(xì)胞和TC-1-HPV16L1細(xì)胞，2條曲線在細(xì)胞生長(zhǎng)到頂峰之前基本完全重合，說明外源基因HPV16L1的加入與表達(dá)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖基本沒有影響.

3.3體外殺傷

將經(jīng)過DNA疫苗（DNA-HPV16L1）和痘苗病毒載體疫苗（MVA-HPV16L1）以及免疫加強(qiáng)作用的DNA-IL15共同免疫過的小鼠脾淋巴細(xì)胞與TC-1-HPV16L1細(xì)胞共同孵育，如果L1能夠被免疫細(xì)胞有效提呈，細(xì)胞將在體外殺傷實(shí)驗(yàn)中被溶解.利用icelligence系統(tǒng)能夠在正常培養(yǎng)條件檢測(cè)細(xì)胞貼壁情況的特點(diǎn)，將2種細(xì)胞在E-plateL8板（與icelligence配套）中混合.由圖5可見，單獨(dú)培養(yǎng)TC-1-HPV16L1細(xì)胞貼壁細(xì)胞最多，位于圖的最上部分.單獨(dú)培養(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞，由于其在體外不貼壁也不會(huì)擴(kuò)增，因此，代表脾淋巴細(xì)胞的為一條平直的曲線.TC-1-HPV16L1細(xì)胞與免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖明顯減慢.加入的脾淋巴細(xì)胞的量與最終貼壁的TC-1-HPV16L的數(shù)量成反比.即加入的脾淋巴細(xì)胞越多，存活的貼壁細(xì)胞越少.體外殺傷實(shí)驗(yàn)說明:被HPV16L1為靶點(diǎn)的疫苗免疫后，小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生了針對(duì)HPV16L1的特異性免疫應(yīng)答.當(dāng)這樣的脾淋巴細(xì)胞在體外與表達(dá)HPV16L1抗原的腫瘤細(xì)胞相遇后，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制和殺傷作用.加入的殺傷細(xì)胞越多，殺傷的效果越加明顯.圖中明顯的折線是由于先加入TC-1-HPV16L1細(xì)胞等其貼壁后，將E-plateL8板從培養(yǎng)箱中取出后再加入脾淋巴細(xì)胞導(dǎo)致.

3.4動(dòng)物模型的構(gòu)建

3.4.1細(xì)胞接種數(shù)量與腫瘤最早捫及時(shí)間比較

將篩選并鑒定好的TC-1-HPV16L1細(xì)胞皮下注射到C57BL/6小鼠的腹股溝處.為了檢測(cè)外源基因HPV16L1對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，設(shè)計(jì)了對(duì)比實(shí)驗(yàn).表2是不同細(xì)胞接種數(shù)量，產(chǎn)生腫瘤最早捫及時(shí)間的統(tǒng)計(jì)表.細(xì)胞的接種數(shù)量越多，形成腫瘤越快.但是就TC-1和TC-1-HPV16L1兩種細(xì)胞而言，在相同的接種細(xì)胞數(shù)情況下，形成腫瘤的最早捫及時(shí)間并無(wú)明顯差別.

表2　模型細(xì)胞不同接種數(shù)量產(chǎn)生腫瘤最早捫及時(shí)間對(duì)照Table 2 Results of different number model cells to form tumor in different time

3.4.2細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)后小鼠生存時(shí)間研究

將2×106個(gè)細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)后，大約需要2周的時(shí)間會(huì)有可捫及的腫瘤生成，隨后腫瘤逐漸增大，到60 d左右，會(huì)從0.1 cm3增大到2.5～3 cm3.實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，腫瘤生長(zhǎng)過大后，小鼠的皮膚被撐而變薄，在小鼠活動(dòng)的過程中腫瘤很容易發(fā)生破裂的現(xiàn)象.而腫瘤一旦破裂將很快導(dǎo)致小鼠死亡.由于破裂導(dǎo)致小鼠非正常死亡以及個(gè)體差異，導(dǎo)致最終的死亡時(shí)間差異較大.由圖6（a）可見，小鼠的整個(gè)帶瘤生存時(shí)間在35～65 d不等.將小鼠的生存時(shí)間進(jìn)行非配對(duì)t檢驗(yàn)，比較發(fā)兩者之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.

3.5腫瘤攻擊免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物攻瘤實(shí)驗(yàn)是腫瘤治療型疫苗和藥物效果檢測(cè)的最常用手段，主要方法是對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種后，將腫瘤細(xì)胞移植到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，通過觀察腫瘤細(xì)胞成瘤以及腫瘤的生長(zhǎng)情況來判斷疫苗或藥物的作用.本研究中，為了避免腫瘤過大破裂導(dǎo)致的小鼠非正常死亡，使最終數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，最終決定當(dāng)腫瘤大于2 cm3的時(shí)候即視為小鼠疫苗死亡.由圖7可見，疫苗組與PBS對(duì)照組差別顯著.在80 d內(nèi)，PBS組小鼠攻瘤后的45～60 d內(nèi)完全死亡，死亡率100%.TC-1組，由于腫瘤細(xì)胞中不攜帶有HPV16L1基因不表達(dá)蛋白而無(wú)法進(jìn)行有效提呈，最終表現(xiàn)與PBS組一致，小鼠80 d內(nèi)死亡率100%.而TC-1-HPV16L1疫苗組小鼠有2只發(fā)生腫瘤（40%），并且腫瘤的發(fā)生早期生長(zhǎng)比較緩慢，需要大約50 d腫瘤體積到約1 cm3，此后腫瘤增長(zhǎng)變快，到大約70 d后腫瘤體積到達(dá)2 cm3.其他3只，沒有產(chǎn)生可捫及的腫瘤，到80 d生存狀態(tài)良好.由此可見，疫苗對(duì)小鼠產(chǎn)生了比較好的保護(hù)作用，同時(shí)證明，TC-1-HPV16L1細(xì)胞對(duì)疫苗有著良好的敏感性.

4　討論

目前已經(jīng)公認(rèn)高危型HPV病毒感染與人類多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，但是并非所有感染高危型HPV病毒的人都會(huì)發(fā)生腫瘤.在HPV病毒高危型16和18型感染后超過80%的人會(huì)在自身免疫的作用下在6個(gè)月到2 a內(nèi)自發(fā)痊愈，而剩余的20%的人會(huì)由于持續(xù)的感染，病毒基因發(fā)生整合導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［13］.目前針對(duì)HPV16、18型的治療型疫苗的研究主要集中在了E6、E7兩個(gè)靶點(diǎn)，因?yàn)镋6、E7基因可以整合到了宿主細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致了細(xì)胞的癌變.但對(duì)于已經(jīng)感染病變而未發(fā)生細(xì)胞轉(zhuǎn)化的患者來說，HPV的L1蛋白只參與免疫反應(yīng)而與細(xì)胞轉(zhuǎn)化無(wú)關(guān)，是更安全的疫苗靶點(diǎn)［14］.

本研究的主要目的在于構(gòu)建一個(gè)可以用于以HPV16L1為主要靶點(diǎn)的疫苗的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的模型細(xì)胞，并利用此細(xì)胞在小鼠體內(nèi)能夠構(gòu)建出腫瘤.利用這個(gè)模型細(xì)胞或腫瘤模型能夠在體內(nèi)外檢測(cè)疫苗的免疫學(xué)性質(zhì)和保護(hù)功效.為了到達(dá)這個(gè)目標(biāo)，首先構(gòu)建了質(zhì)粒載體，并利用這個(gè)質(zhì)粒將HPV16L1基因轉(zhuǎn)染到了TC-1這個(gè)HPV疫苗的主要模型細(xì)胞中，并篩選到穩(wěn)定表達(dá)該蛋白的細(xì)胞株.針對(duì)這個(gè)穩(wěn)定表達(dá)HPV16L1的細(xì)胞株進(jìn)行了一系列的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).其中包括2個(gè)方面:一個(gè)方面是外源基因HPV16L1整合到TC-1細(xì)胞后，對(duì)模型細(xì)胞TC-1的自身生長(zhǎng)增殖情況的影響，以及在動(dòng)物體內(nèi)成瘤特性的影響；另一方面需要驗(yàn)證，穩(wěn)定表達(dá)HPV16L1的TC-1細(xì)胞株對(duì)以HPV16L1為靶點(diǎn)的疫苗免疫過的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在體內(nèi)外是否敏感，是否能夠被疫苗免疫過動(dòng)物的淋巴細(xì)胞殺傷，從而到達(dá)保護(hù)性作用.

結(jié)果顯示，外源基因插入TC-1細(xì)胞基因組后，HPV16L1蛋白能夠在細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá).在體外殺傷實(shí)驗(yàn)中，疫苗免疫過的小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)TC-1-HPV16L1細(xì)胞有明顯的殺傷作用，說明細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)HPV16L1為靶點(diǎn)的疫苗敏感.在動(dòng)物模型構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)中，TC-1與TC-1-HPV16L1形成腫瘤所需的細(xì)胞數(shù)與時(shí)間無(wú)顯著差別.體內(nèi)保護(hù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腫瘤攻擊后，TC-1組（包括PBS組和疫苗組）、TC-1-HPV16L1的PBS組腫瘤迅速增長(zhǎng)，而TC-1-HPV16L1疫苗組達(dá)到了比較好的保護(hù)效果，只有40%小鼠有腫瘤發(fā)生.而且，攻擊TC-1-HPV16L1細(xì)胞的疫苗組小鼠的腫瘤形成情況與其他組也不相同，初期腫瘤發(fā)生晚生長(zhǎng)速度慢，末期才增長(zhǎng)迅速.具體的原因與免疫反應(yīng)情況有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證.綜上，成功構(gòu)建了一個(gè)用于檢測(cè)HPV16病毒感染治療藥物或疫苗效果的模型細(xì)胞，并利用這個(gè)細(xì)胞構(gòu)建了腫瘤模型.這個(gè)模型細(xì)胞中不但包含了HPV病毒的早期基因（E基因），還包含了晚期基因L1，使TC-1這株模型細(xì)胞的用途得到了擴(kuò)展.

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（責(zé)任編輯 鄭筱梅）

Establishment and Evaluation of TC-1-HPV16L1 Cell Model and Animal Model

LI Lili1，WANG Herong1，ZHOU Zhiyi1，LUO Jing1，ZHOU Yubai1，ZENG Yi2
（1.Beijing Key Laboratory of Environmental and Viral Oncololgy，College of Life Science and Bio-Engineering，Beijing University of Technology，Beijing 100124，China；2.State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control，National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100052，China）

The main purpose of this research is to construct a model cell which can form tumor in experimental animals，and the model cell and model animal can be used to study the vaccine of HPV16L1 as the main target in vitro and in vivo.First of all，HPV16L1 gene sequences were obtained by polymerase chain reaction（PCR）amplification and full-length open reading frame（ORF）was constructed in-frame into the pcDNA 3.1/blasticidin expression plasmid.The cell line of stable expression of HPV16L1 was obtained by transfection of recombinant plasmid into TC-1 cell line under the resistant screening of blasticidin.The addition of exogenous gene HPV16L1 did not cause significant changes in the characteristics of cells through the comparison of proliferation and tumorigenesis between TC-1 and TC-1-HPV16L1.TC-1-HPV16L1 can be killed by the spleen lymphocytes of miceimmunized by HPV16L1 target vaccine in vitro test.Experiment of tumor challenge proved that the vaccine had protective effect on TC-1-HPV16L1 in animals.

model cell；model animal；human papillomavirus16L1

U 461；TP 308

A

0254-0037（2016）10-1581-07

10.11936/bjutxb2015090056

2015-09-21

國(guó)家“863”計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012AA02A404）

李莉莉（1979—），女，博士研究生，主要從事病毒感染引起的腫瘤預(yù)防與治療型疫苗方面的研究，E-mail:chuji79 @126.com

周玉柏（1976—），男，副教授，主要從事免疫與病毒學(xué)方面的研究，E-mail:zhouyubai@bjut.edu.cn