韓峰　黃華　呂黃勇　聶川　林玲解放軍第五十九中心醫(yī)院消化內科，云南　開遠　66600昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院消化內科，昆明　650000

膜聯(lián)蛋白Ⅱ在胃癌組織中的表達及其在胃癌轉移中的作用

韓峰1黃華2#呂黃勇1聶川1林玲1
1解放軍第五十九中心醫(yī)院消化內科，云南開遠661600
2昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院消化內科，昆明650000

目的探討膜聯(lián)蛋白Ⅱ（AnnexinⅡ）在胃癌組織中的表達及其在胃癌轉移中的作用。方法采用免疫組織化學法檢測AnnexinⅡ在51例胃癌組織和24例癌旁組織中的表達，并統(tǒng)計AnnexinⅡ陽性表達與胃癌患者臨床特征的關系。用AnnexinⅡ特異性siRNA在胃癌HGC-27細胞抑制AnnexinⅡ的表達，應用黏附實驗、侵襲實驗檢測抑制AnnexinⅡ表達后對胃癌細胞的黏附、侵襲能力的影響。結果AnnexinⅡ蛋白在胃癌組織中陽性率為82.4%，在癌旁組織中陽性率為37.5%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；并且AnnexinⅡ陽性表達與患者的性別與年齡無關（P＞0.05），而與腫瘤大小、組織分化程度、臨床分期、淋巴結轉移臨床特征有關，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在胃癌HGC-27細胞轉染AnnexinⅡsiRNA后，細胞中AnnexinⅡ的蛋白和mRNA水平均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。并且抑制AnnexinⅡ表達后，胃癌HGC-27細胞的黏附、侵襲能力下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論AnnexinⅡ在胃癌組織中高表達，AnnexinⅡ蛋白表達與腫瘤大小、組織分化程度、臨床分期、淋巴結轉移臨床特征有關，并且AnnexinⅡ高表達可促進胃癌轉移。因此，AnnexinⅡ可以作為抑制胃癌轉移的潛在靶點，開發(fā)靶向AnnexinⅡ的藥物可能成為治療胃癌轉移的新方法。

胃癌；AnnexinⅡ；轉移

Oncol Prog，2016，14（7）

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在消化道惡性腫瘤中居首位，在世界范圍內也具有較高的發(fā)病率和病死率。由于其癥狀隱匿，病情發(fā)展較快，診斷時多為中晚期，治療效果往往較差，嚴重威脅人類健康。但早期胃癌的治療效果好，行根治術后5年生存率可達90%以上，因此深入研究胃癌的發(fā)生發(fā)展機制，對于早期診斷胃癌及指導胃癌的治療有著十分重要的臨床意義。膜聯(lián)蛋白Ⅱ（AnnexinⅡ）是一種鈣離子依賴性的磷脂結合蛋白，主要以單體、二聚體及四聚體形式存在，研究顯示，AnnexinⅡ在肝癌、乳腺癌、腸癌等多種惡性腫瘤中均有高表達，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉移過程中發(fā)揮重要的作用。本研究通過采用免疫組織化學法檢測AnnexinⅡ在51例胃癌組織和24例癌旁組織中的表達，統(tǒng)計AnnexinⅡ陽性表達與胃癌患者臨床特征的關系。并用AnnexinⅡ特異性siRNA在胃癌HGC-27細胞抑制AnnexinⅡ的表達，檢測細胞黏附、侵襲能力的變化。現(xiàn)將結果報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

收集解放軍第五十九中心醫(yī)院2012年1月至2014年12月手術切除胃癌標本51例，51例胃癌組織標本中27例取自2012年1月至2013年10月胃癌術后制作好的蠟塊組織，沒有癌旁組織標本。其中男30例，女21例；年齡32～78歲，平均年齡58.6歲；病理分級：低分化36例，高分化15例；TNM分期：Ⅰ期0例，Ⅱ期17例，Ⅲ期26例，Ⅳ期8例（患者出現(xiàn)明顯的消化道出血且內科治療效果差或出現(xiàn)消化道梗阻，患者及其家屬要求行減瘤手術姑息治療）。以上病例術前均未作放療、化療等抗腫瘤治療。從以上51例胃癌患者的胃正常切緣組織中隨機抽取24例作為對照組。所有標本用甲醛固定，石蠟包埋，切片。胃癌HGC-27細胞購自上海生化與細胞生物學研究所細胞庫。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學法染色AnnexinⅡ抗體購自Abcam試劑公司；免疫組化檢測試劑盒、DAB試劑盒購自碧云天試劑公司。切片進行高溫高壓組織抗原修復。染色步驟按試劑盒說明書進行，用已知陽性片作陽性對照，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作陰性對照。結果判斷：AnnexinⅡ陽性表達為細胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒狀物質。每張切片選擇5個具有代表性的高倍視野，每個視野計數約100個細胞，將陽性細胞的百分率和染色強度分別計分。具體判斷標準如下：①根據染色程度進行評分，無染色為0分，染色強度弱為1分，中等染色強度為2分，染色強度強為3分。②根據著色細胞百分率進行評分，著色細胞占計數細胞百分率＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。①+②為總積分，總分0～7分。總分0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～5分為陽性（++），6～7分為強陽性（+++）。

1.2.2細胞培養(yǎng)胃癌HGC-27細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（BSA）的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37℃、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3細胞轉染胃癌HGC-27細胞（1×105/ml）接種于24孔板，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜。無血清培養(yǎng)基洗滌細胞，將1μ（l20 pmol）AnnexinⅡsiRNA溶于49 μl無血清培養(yǎng)基，再將脂質體1 μl溶于59 μl無血清培養(yǎng)基，室溫靜置10 min后，將兩種液體混合，室溫靜置20 min。然后將混合液加入待轉染細胞的24孔板，補加無血清培養(yǎng)基至500 μl，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6 h后更換為含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。

1.2.4實時定量PCR用Trizol法提取細胞的總RNA，將提取的細胞總RNA樣品反轉錄成cDNA，用如下反應體系：2 μg模板RNA、1 μl Oligo dT primer、2 μl dNTP mixture、1 μl Ace反轉錄酶、1 μl RNase inhibitor、4 μl 5×RT buffer，10 μl RNase-free水。反應條件：第一步37℃30 min，第二步84℃30 s。反應產物4℃保存，然后進行實時定量PCR反應。用如下反應體系：12.5 μl RealMasterMix（SYBR I）、2 μl模板cDNA、1 μl正向引物、1 μl反向引物、8.5 μl RNase-free水。反應條件：第一步94℃5 min；第二步94℃60 s、57℃30 s、72℃30 s，共30個循環(huán)；第三步72℃5 min；最后4℃結束反應。用實時定量PCR儀的Option Monitor V3.1軟件分析實驗結果數據。

1.2.5免疫印記實驗將生長狀態(tài)良好的待檢測細胞用裂解液冰上裂解，收集裂解液，用BCA蛋白定量試劑盒對細胞裂解液進行總蛋白定量，上樣后，進行SDS電泳，轉膜后用5%脫脂奶粉封閉，接著加入待檢測AnnexinⅡ蛋白的抗體室溫孵育2 h，洗膜后加入相應HRP標記二抗。取化學發(fā)光檢測A液和B液各0.1 ml混勻后，避光滴加至PVDF膜上。將PVDF膜置于Western Blot化學發(fā)光檢測系統(tǒng)中，曝光適當時間后，進行拍照與定量。

1.2.6細胞黏附實驗取0.1 ml的Matrigel膠加入96孔培養(yǎng)板中，4℃預冷過夜。吸出上清液后用含5%BSA的PBS室溫封閉30 min，然后用PBS洗2次。細胞計數后用含0.1%BSA的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細胞，以1×105/孔接種于Matrigel膠包被的孔中。37℃培養(yǎng)箱中孵育45 min后，吸出上清培養(yǎng)液和未黏附的細胞，每孔加入0.1 ml含0.2% Cristal viole（t75%乙醇配制）室溫染色15 min后，流水沖洗2 min，然后將培養(yǎng)板置于空氣中干燥。每孔加入0.1 ml含5%SDS的50%乙醇裂解細胞，靜置30 min后，用酶標儀在540 nm波長下檢測吸光值。

1.2.7細胞侵襲實驗將1∶3稀釋的Matrige（lRMPI 1640稀釋）加入Matrigel侵襲小室上室，37℃放置2 h，將2×104胃癌細胞分別重懸于0.1%胎牛血清培養(yǎng)液中并接種于小室上室，在小室下室的24孔板內加入含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24 h。取出侵襲小室，用棉簽輕輕擦去上室中未穿過的細胞，甲醛固定10 min，蘇木精-伊紅染色，切下濾膜，中性樹膠封片，光鏡下計數穿膜的細胞數。光鏡下任取10個視野計算穿膜的細胞數。每個獨立實驗重復3次。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16-.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1胃癌組織及癌旁組織中AnnexinⅡ的表達

AnnexinⅡ蛋白的陽性表達為細胞質中出現(xiàn)黃色顆粒狀物質，主要定位于細胞質中（圖1）。在51例胃癌組織中有42例為陽性，其中強陽性3例，陽性12例，弱陽性27例，陰性9例，陽性率為82.4%。在24例癌旁組織中，有9例陽性表達，其中強陽性0例，陽性3例，弱陽性6例，陽性率為37.5%。胃癌組織中AnnexinⅡ蛋白的表達明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.0001）。

圖1　免疫組化檢測AnnexinⅡ蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的表達

2.2AnnexinⅡ蛋白的表達與胃癌患者臨床特征的關系

AnnexinⅡ蛋白的陽性表達與患者的性別與年齡無關（P＞0.05），而與腫瘤大小、組織分化程度、臨床分期、淋巴結轉移臨床特征有關，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表2）

2.3AnnexinⅡ在胃癌轉移中的作用

表2　AnnexinⅡ蛋白表達與胃癌患者臨床特征的關系

2.3.1siRNA抑制AnnexinⅡ的表達將靶向AnnexinⅡ的siRNA片段（AnnexinⅡsiRNA）轉染人胃癌HGC-27細胞，24 h后采用Western Blot和Real Time-PCR檢測人胃癌HGC-27細胞中AnnexinⅡ的蛋白表達和mRNA轉錄的情況，并轉染無關干涉siRNA片段（control siRNA）作為陰性對照組。Western Blot結果表明，AnnexinⅡsiRNA可以顯著抑制人胃癌HGC-27細胞中AnnexinⅡ的蛋白表達，差異具有統(tǒng)計學意義（t=15.81，P＜0.05），詳見圖2。Real Time-PCR結果表明，AnnexinⅡsiRNA可以顯著抑制人胃癌HGC-27細胞中AnnexinⅡ的mRNA轉錄，差異具有統(tǒng)計學意義（t=8.04，P＜0.05），詳見圖3。

圖2　AnnexinⅡsiRNA對人胃癌HGC-27細胞中AnnexinⅡ蛋白表達的影響

圖3　AnnexinⅡsiRNA對人胃癌HGC-27細胞中AnnexinⅡmRNA轉錄的影響

2.3.2AnnexinⅡ對胃癌細胞黏附能力的影響為檢測AnnexinⅡ對胃癌細胞黏附能力的作用，將胃癌細胞轉染AnnexinⅡsiRNA抑制AnnexinⅡ的表達，采用細胞黏附實驗檢測細胞黏附能力變化。與對照組比較，人胃癌HGC-27細胞轉染AnnexinⅡsiRNA后細胞的黏附能力降低，差異具有統(tǒng)計學意義（t=7.02，P＜0.05）。（圖4）

圖4　AnnexinⅡsiRNA對人胃癌HGC-27細胞黏附能力的影響

2.3.3AnnexinⅡ對胃癌細胞侵襲能力的影響為檢測AnnexinⅡ對胃癌細胞侵襲能力的作用，將胃癌細胞轉染AnnexinⅡsiRNA抑制AnnexinⅡ的表達，采用細胞侵襲實驗檢測細胞侵襲能力變化。與對照組比較，人胃癌HGC-27細胞轉染AnnexinⅡsiRNA后細胞的侵襲能力降低，差異具有統(tǒng)計學意義（t=7.82，P＜0.05）。（圖5、圖6）

圖5　AnnexinⅡsiRNA對人胃癌HGC-27細胞侵襲能力的影響

圖6　統(tǒng)計學分析AnnexinⅡsiRNA對人胃癌HGC-27細胞侵襲率的影響

3　討論

膜聯(lián)蛋白（Annexin，ANX）是一類鈣離子依賴性的磷脂結合蛋白，廣泛存在于細胞膜、細胞質或細胞外基質中，在結構上均具有兩個基本的功能結構域：高度保守的C末端核心區(qū)和高度可變的N末端結構域，前者具有Ca2+與膜的結合位點，以鈣離子依賴的方式可逆的與細胞膜磷脂結合，后者決定了Annexin特異的生物學功能。Annexin參與細胞的一系列活動，如胞吞、胞吐、細胞增殖、分化和凋亡、細胞骨架活動及信號轉導等。AnnexinⅡ作為Annexin家族A亞家族的一員，又名p36、AXA2、LIP2等，其基因位于15q21～q22，含1.4 kb編碼基因，蛋白分子量為36 kD，其具有RNA結合的特性，除在細胞分泌、增殖、細胞骨架連接及纖溶等方面發(fā)揮作用外，還可以結合到C-myc mRNA上，可上調C-myc蛋白，其表達異常與胃癌發(fā)生、發(fā)展關系密切，如介導凋亡、誘導分化等［4-6］。

本研究對胃癌組織、癌旁組織中AnnexinⅡ的表達情況進行了分析，結果顯示胃癌組織中AnnexinⅡ蛋白的表達明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），并且發(fā)現(xiàn)AnnexinⅡ陽性表達與患者的性別與年齡無關（P＞0.05），而與腫瘤大小、組織分化程度、臨床分期、淋巴結轉移臨床特征有關，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。以上研究結果提示AnnexinⅡ蛋白與胃癌的惡性程度密切相關。

腫瘤轉移是腫瘤最重要的惡性表現(xiàn)，是造成高致死率的直接原因。腫瘤轉移需要在腫瘤細胞本身、宿主細胞及細胞外基質之間相互作用下才能完成，涉及一系列復雜過程與步驟，包括腫瘤細胞從原發(fā)瘤灶脫離，通過分泌基質金屬蛋白酶（MMP）降解細胞外基質進入血管或淋巴管中遷移到遠處，再侵襲到繼發(fā)組織或器官中形成轉移灶［7-11］。因此研究腫瘤轉移對于臨床診治有重要意義。為明確AnnexinⅡ是否在胃癌轉移過程中發(fā)揮作用，我們對胃癌HGC-27細胞應用AnnexinⅡ特異性siRNA抑制AnnexinⅡ的表達，研究在AnnexinⅡ的表達降低后，胃癌HGC-27細胞的轉移能力，包括黏附、侵襲能力的變化。在研究中發(fā)現(xiàn)，在胃癌HGC-27細胞中應用AnnexinⅡ特異性siRNA抑制AnnexinⅡ的表達后，胃癌細胞的黏附、侵襲能力均降低，提示AnnexinⅡ在胃癌轉移過程中發(fā)揮了重要的作用。

綜上所述，AnnexinⅡ在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達，并與胃癌組織分化程度、臨床分期、淋巴結轉移臨床特征有關，應用AnnexinⅡ特異性siRNA在胃癌HGC-27細胞抑制AnnexinⅡ的表達后，胃癌細胞黏附、侵襲、遷移能力均降低，提示AnnexinⅡ在胃癌轉移過程中發(fā)揮了重要的作用。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個復雜的多因素參與的綜合結果，目前關于胃癌的病因學和發(fā)病機制研究較多，但并未明了，本研究證實了AnnexinⅡ在胃癌組織中高表達并且具有促進胃癌轉移的重要作用。隨著相關研究的不斷深入，AnnexinⅡ基因的表達、生物學功能及在胃癌進展中的作用將逐步明確，有望應用于胃癌的早期檢測、診斷和治療，成為胃癌預測預后的標志物和治療靶點。

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The expression of Annexin II in gastric cancer and the role in gastric cancer metastasis

HAN Feng1HUANG Hua2#LV Huang-yong1NIE Chuan1LIN Ling1
1Deparement of Gastroenterology，the PLANo.59 Hospital，Kaiyuan 661600，Yunnan，China
2Deparement of Gastroenterology，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650000，Yunnan，China

ObjectiveTo investigate the significance and the role of Annexin II expression in gastric cancer tissues and gastric cancer metastasis.MethodExpression of annexin II in 51 cases of gastric cancer and 24 cases of adjacent normal gastric tissues was detected by immunohistochemistry staining，then the correlation between positive expression of Annexin II and clinical characteristics of gastric cancer patients were summarized and analyzed.Annexin II specific siRNA interference was established in human gastric cancer HGC-27 cells to downregulate the expressions of Annexin II，and cell adherence test and cell invasion test were performed to evaluate the adhesion and invasion potential of gastric cancer cells as Annexin II expression was inhibited.ResultThe positive expression rate of Annexin II in gastric cancer tissues was 82.4%，significantly higher than that in the adjacent normal gastric tissues at 37.5%，with significant difference observed（P＜0.01）；Besides，the positive expression of Annexin II was independent of gender or age of gastric cancer patients（P＞0.05），while was correlated with tumor size，histological differentiation，clinical TNM stage，and lymph nodes metastasis（all P＜0.05）.The transfection of Annexin II siRNA in human gastric cancer HGC-27 cells led to significant decreases of Annexin II protein and mRNA（P＜0.05），and as the Annexin II expression was downregulated，the adhesion and invasion potential of human HGC-27 gastric cancer cells were significantly decreased（P＜0.05）.Conclusion Annexin II is over-expressed in gastric cancer tissues and the positive expression of Annexin II is correlated with tumor size，histological differentiation and lymph node metastasis，and the high expression of Annexin II may promote the metastasis of gastric cancer，so Annexin II may be an alternative and potential target for preventing metastasis of gastric cancer，and annexin II targeted medication is a promising option in countering cancer metastasis.

gastric cancer；annexin II；metastasis

R735.2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.07.11

2016-01-15）

（corresponding author），郵箱：hanfeng568@sohu.com