田　曄，江　驥，胡　蓓，薛金萍，王洪允

(1.福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，福建省功能材料工程研究中心，福建省光動(dòng)力治療藥物與診療工程技術(shù)研究中心，福建 福州　350108；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院臨床藥理中心，北京　100730)

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超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人血漿中精氨酸及衍生物含量

田曄1,2，江驥2，胡蓓2，薛金萍1，王洪允2

(1.福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，福建省功能材料工程研究中心，福建省光動(dòng)力治療藥物與診療工程技術(shù)研究中心，福建 福州350108；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院臨床藥理中心，北京100730)

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法同時(shí)測(cè)定使用艾普拉唑后人血漿中二甲基精氨酸(ADMA)、對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸(SDMA)、單甲基精氨酸(NMMA)、瓜氨酸(Cit)和L-精氨酸(L-Arg)的濃度。采用HILIC親水相互作用色譜和非衍生化的蛋白沉淀法進(jìn)行分離分析，色譜柱選取Waters Atlantic HILIC柱(2.1 mm×50 mm×3 μm)，流動(dòng)相由乙腈(含0.5%乙酸和0.025%三氟乙酸)-水(含0.5%乙酸和0.025%三氟乙酸)(85∶15,V/V)組成，流速0.25 mL/min。采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式，以電噴霧離子源(ESI)正離子方式檢測(cè)。結(jié)果顯示，ADMA、SDMA、NMMA、L-Arg和Cit的線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.994 0；ADMA、SDMA和NMMA的線(xiàn)性范圍為0.1～5 mmol/L，L-Arg和Cit的線(xiàn)性范圍為10～250 mmol/L；5種氨基酸的日內(nèi)、日間精密度均小于15%，準(zhǔn)確度在85%～115%之間。該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏，可為相關(guān)疾病的臨床診斷提供一種高效的檢測(cè)手段。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)；艾普拉唑；蛋白沉淀法；親水性色譜

一氧化氮是人體重要的信使分子，L-精氨酸(L-Arg)在一氧化氮全酶(NOS)的催化下，產(chǎn)生一氧化氮(NO)和瓜氨酸(Cit)[1-2]。蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMTS)以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，可使各種多肽中的L-精氨酸殘基甲基化，甲基化的蛋白質(zhì)水解后即可產(chǎn)生甲基化的精氨酸，此過(guò)程產(chǎn)生了不對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸(ADMA)，單甲基精氨酸(NMMA)和對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸(SDMA)，其關(guān)系示于圖1[3]。ADMA是NOS的內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，通過(guò)抑制NOS的活性，從而抑制NO的產(chǎn)生[4-6]；研究表明，使用質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)可提高ADMA的水平，從而增加心血管不良事件的發(fā)生率[7]。雖然NMMA也可以抑制NO的產(chǎn)生，但其在人體中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于A(yíng)DMA。SDMA不直接抑制NO的合成，但可與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體競(jìng)爭(zhēng)，從而加劇精氨酸的缺乏[8]；另有研究表明，SDMA可作為腎功能和缺血性中風(fēng)所引起死亡的新型標(biāo)記物[9]。

圖1　ADMA，SDMA，NMMA，Cit和L-Arg的關(guān)系Fig.1　Relationship of ADMA, SDMA, NMMA, Cit and L-Arg

目前，檢測(cè)氨基酸含量常用的方法有薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、電泳法(EC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC/MC)、氨基酸分析儀法等[10-12]。近年來(lái)，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法在生物醫(yī)學(xué)和藥物研究領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展迅速。

根據(jù)ADMA、SDMA、NMMA、Cit 和L-Arg之間的關(guān)系，本工作擬選用強(qiáng)極性和強(qiáng)親水性的 HILIC色譜柱，采用UPLC技術(shù)進(jìn)行色譜分離，以電噴霧離子源正離子方式和多反應(yīng)離子掃描模式測(cè)定人服用PPIs后，血漿中ADMA、SDMA、NMMA、Cit 和L-Arg的濃度，希望為相關(guān)疾病的臨床診斷提供方法參考。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與裝置

Acquity UPLC超高效液相色譜儀，Xevo TQS三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源及MassLynx 4.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；低溫高速離心機(jī)和渦流混合器：德國(guó)Heraeus公司產(chǎn)品；純水機(jī)：美國(guó)Milli-Q公司產(chǎn)品；AX240十萬(wàn)分之一分析天平：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；WinNonlin軟件Version 6.3：美國(guó)Pharsight 公司產(chǎn)品。

1.2主要材料與試劑

ADMA、SDMA、NMMA、Cit和L-Arg標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，其結(jié)構(gòu)列于表1；D7-ADMA內(nèi)標(biāo)對(duì)照品：美國(guó)Cambridge Isotope公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)：美國(guó)Honeywell Burdick & Jackson公司產(chǎn)品；乙酸(色譜純)：美國(guó)Fisher Scientific公司產(chǎn)品；三氟乙酸(TFA，色譜純)：百靈威科技有限公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：由Milli-Q純化系統(tǒng)制備；空白血漿：由北京協(xié)和醫(yī)院血庫(kù)提供。

1.3實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件色譜柱：Waters Atlantic HILIC柱(2.1 mm×50 mm×3 μm)；流動(dòng)相：乙腈(含0.5%乙酸和0.025%TFA)-水(含0.5%乙酸和0.025%TFA)(85∶15,V/V)；流速：0.25 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；毛細(xì)管電壓3 kV；錐孔電壓50 V；錐孔氣流速150 L/h；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流速650 L/h；碰撞氣為氬氣；以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描方式進(jìn)行測(cè)定，詳細(xì)的質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

表1　L-Arg、Cit、ADMA、SDMA和NMMA的MRM參數(shù)

1.4血漿樣品的測(cè)定

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和質(zhì)控血漿樣品的測(cè)定取20 μL空白血漿，加入20 μL待測(cè)化合物工作液和10 μL 10 mg/L內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋振蕩20 s；隨后加入160 μL乙腈(含0.5%乙酸和0.025%TFA)，再渦旋振蕩3 min，以13 000 r/min離心10 min后，取上清液，進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣體積10 μL。

1.4.2實(shí)際血漿樣本的測(cè)定取20 μL實(shí)際血漿樣品，加入20 μL純水和10 μL 10 mg/L內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋振蕩20 s；隨后加入160 μL乙腈(含0.5%乙酸和0.025%TFA)，再渦旋振蕩3 min，以13 000 r/min離心10 min后，取上清液，進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣體積10 μL。

1.5方法學(xué)考察

參照美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)在2013年頒布的指導(dǎo)原則[13]，對(duì)本方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性，準(zhǔn)確度和日內(nèi)、日間精密度，萃取回收率和基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察。

2　結(jié)果與討論

2.1色譜分析

空白樣品中，除不加內(nèi)標(biāo)外，其他按1.4節(jié)條件進(jìn)行分析，因L-Arg、Cit、ADMA、SDMA、NMMA均為內(nèi)源性氨基酸，故在空白血漿中均有檢出，其質(zhì)量色譜圖示于圖2?？梢?jiàn)，L-Arg、Cit、ADMA、SDMA和NMMA的保留時(shí)間分別為0.96、0.95、0.96、0.95和0.96 min，色譜峰形良好。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性和方法定量限

按照1.4.1節(jié)方法制備并測(cè)定血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品，ADMA、SDMA和NMMA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)濃度點(diǎn)依次為0.1、0.25、0.5、1、2、4和5 mmol/L；L-Arg和Cit的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)濃度點(diǎn)依次為10、25、50、100、200、400和500 mmol/L。由于A(yíng)DMA、SDMA、NMMA、L-Arg和Cit均屬于內(nèi)源性物質(zhì)，故每批制備5個(gè)BK(只含內(nèi)標(biāo)不含化合物的樣品)，分別計(jì)算出5個(gè)BK中5種氨基酸的峰面積，并將其與內(nèi)標(biāo)峰面積之比的均值作為空白本底。以ADMA、SDMA、NMMA、L-Arg和Cit濃度為橫坐標(biāo)，以5種氨基酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比減去空白本底為縱坐標(biāo)，權(quán)重系數(shù)1/x2，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到的回歸方程列于表2。

2.3準(zhǔn)確度和日內(nèi)、日間精密度

按照1.4.1節(jié)方法制備并測(cè)定低、中、高3種濃度的質(zhì)控樣品，低濃度質(zhì)控樣品中，ADMA、SDMA和NMMA的濃度均為0.3 mmol/L，Cit和L-Arg的濃度均為25 mmol/L；中濃度質(zhì)控樣品中，ADMA、SDMA和NMMA的濃度均為2.5 mmol/L，Cit和L-Arg的濃度均為250 mmol/L；高濃度質(zhì)控樣品中，ADMA、SDMA和NMMA的濃度均為4 mmol/L，Cit和L-Arg的濃度均為400 mmol/L。每個(gè)濃度平行測(cè)定5個(gè)樣品，連續(xù)測(cè)定3天，計(jì)算準(zhǔn)確度和日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果列于表3。

2.4萃取回收率

2.4.1萃取樣品取20 μL血漿樣品，加入20 μL待測(cè)化合物工作液(低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，n=6)，渦旋振蕩20 s，隨即加入160 μL乙腈(含0.5%乙酸和0.025%TFA)，按1.4節(jié)方法制備并測(cè)定。

2.4.2未萃取樣品配制與2.3節(jié)相同的低、中、高3種濃度的質(zhì)控樣品(溶劑為乙腈，含0.5%乙酸和0.025%TFA)，取空白血漿，按照1.4節(jié)方法處理，取180 μL上清液，加入20 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋振蕩并測(cè)定(每一濃度平行測(cè)定6個(gè)樣品，共18個(gè))。

將萃取樣品與相同濃度未萃取樣品的峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算ADMA、SDMA、NMMA、Cit和L-Arg的萃取回收率分別為：(92.5±8.6)%、(88.5±6.5)%、(50.6±3.1)%、(27.0±0.3)%和(33.9±2.1)%。

2.5基質(zhì)效應(yīng)

配制與2.3節(jié)相同的低、中、高3種濃度的質(zhì)控樣品(溶劑為乙腈，含0.5%乙酸和0.025%TFA)。取6份來(lái)自不同個(gè)體的空白血漿，按1.4節(jié)方法處理，取180 μL上清液，加入20 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋振蕩并測(cè)定(每一濃度測(cè)定6個(gè)樣品，共18個(gè))；將180 μL乙腈(含0.5%乙酸和0.025%TFA)加入 20 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液中，直接測(cè)定獲得的峰面積，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。ADMA、SDMA、NMMA、Cit和L-Arg的基質(zhì)效應(yīng)分別為：(90.5±6.3)%、(83.0±3.5)%、(50.6±2.5)%、(41.0±0.1)%和(32.9±0.2)%。

圖2　空白血漿(a)，空白血漿中加入內(nèi)標(biāo)(b)和受試者服藥2 h后(c)的典型質(zhì)量色譜圖Fig.2　Typical MRM chromatograms of double blank plasma (a), blank plasma spiked with IS (b) and a subject plasma sample after 2 h post-dose (c)

化合物線(xiàn)性方程相關(guān)系數(shù)(r)定量限/(mmol/L)線(xiàn)性范圍/(mmol/L)ADMAy=0.3851x+0.20770.99670.10.1～5SDMAy=0.4180x+0.20070.99830.10.1～5NMMAy=0.3662x+0.048310.99850.10.1～5L-Argy=0.01153x+1.20490.99801010～500City=0.04321x+8.31540.99411010～500

表3　ADMA，SDMA，NMMA，L-Arg和Cit的準(zhǔn)確度和日內(nèi)、日間精密度

2.6方法應(yīng)用

艾普拉唑是一種質(zhì)子泵抑制劑，在十二指腸潰瘍患者中多次給藥試驗(yàn)后，檢測(cè)體內(nèi)ADMA、SDMA、NMMA、Cit和L-Arg的濃度變化。選取10名十二指腸潰瘍患者進(jìn)行隨機(jī)、開(kāi)放、平行、陽(yáng)性藥對(duì)照試驗(yàn)，給藥劑量20 mg，于第1天早晨靜脈輸注，采集給藥后25 min、45 min、55 min、1.5 h、2 h、3 h、5 h、8 h、12 h和24 h共計(jì)11個(gè)采血點(diǎn)的系列血樣。采用UPLC-MS/MS法測(cè)定10名受試者的系列血樣，得到的平均血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)示于圖3。結(jié)果表明，在短時(shí)間內(nèi)，使用高劑量的PPIs，體內(nèi)ADMA、SDMA、NMMA、Cit和L-Arg的濃度并沒(méi)有發(fā)生明顯的改變。

圖3　十二指腸潰瘍患者靜脈注射20 mg艾普拉唑后，ADMA、SDMA、NMMA、Cit和L-Arg的平均血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)(n=10)Fig.3　Mean plasma concentration-time curves of ADMA, SDMA, NMMA, Cit and L-Arg in duodenal ulcer patients intravenous PPIs 20 mg (n=10)

2.7討論

本工作建立了同時(shí)測(cè)定血漿中ADMA、SDMA、NMMA、L-Arg和Cit濃度的UPLC-MS/MS方法，鑒于以上5種氨基酸水溶性較強(qiáng)，且有一定的極性，因此采用ESI+模式進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)選擇了HILIC親水相互作用色譜柱，因其可為強(qiáng)極性和強(qiáng)親水性化合物提供合適的保留，通過(guò)優(yōu)化多個(gè)色譜參數(shù)，有利于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)組分和基質(zhì)中干擾物質(zhì)的分離，從而降低基質(zhì)效應(yīng)的影響；又因其流動(dòng)相中含高比例水溶性有機(jī)相，有利于提高質(zhì)譜的離子化效率和分析靈敏度。實(shí)驗(yàn)選擇蛋白沉淀法或固相萃取法進(jìn)行樣品前處理，因固相萃取法價(jià)格昂貴，技術(shù)要求高，操作步驟繁瑣，故采用了既能滿(mǎn)足要求，操作又相對(duì)簡(jiǎn)單的蛋白沉淀法，即加入沉淀劑，直接取上清液進(jìn)樣。此外，分析過(guò)程中氘代同位素內(nèi)標(biāo)的使用有效地提高了本方法的準(zhǔn)確性和適用性。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)10名十二指腸潰瘍患者服用艾普拉唑后的血樣進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用艾普拉唑并未造成體內(nèi)ADMA、SDMA、NMMA、Cit和L-Arg的濃度水平發(fā)生明顯的變化，說(shuō)明人體在使用艾普拉唑后，不會(huì)增加心血管不良事件的發(fā)生率，此結(jié)論在Ghebremariam等[14]研究蘭索拉唑與心血管疾病的關(guān)系時(shí)得到證實(shí)。

3　結(jié)論

本工作建立了同時(shí)測(cè)定血漿中ADMA、SDMA、NMMA、L-Arg和Cit濃度的UPLC-MS/MS方法，可實(shí)現(xiàn)5種氨基酸在3.0 min內(nèi)的快速檢測(cè)。該方法采用HILIC親水相互作用色譜和非衍生化的蛋白沉淀法，具有快速、簡(jiǎn)便和靈敏的優(yōu)點(diǎn)，可為今后相關(guān)疾病的臨床診斷提供一種高效的檢測(cè)手段。

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Determination of Amino Acid Biomarkers in Human Plasma by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

TIAN Ye1,2, JIANG Ji2, HU Pei2, XUE Jin-ping1, WANG Hong-yun2

(1.FujianEngineeringResearchCenterforDrugandDiagnoses-TreatofPhotodynamicTherapy,CollegeofChemistry,FuzhouUniversity,Fuzhou350108,China;2.ClinicalPharmacologyResearchCenter,PekingUnionMedicalCollegeHospital,ChineseAcademyofMedicalScience,Beijing100730,China)

An ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was developed for the simultaneous determination of ADMA, SDMA, NMMA,L-Arg and Cit in human plasma after administration of ilaprazole. The plasma samples were prepared using protein precipitation by acetonitrile after addition of deuterated internal standard. The analytical column was Waters Atlantic HILIC (2.1 mm×50 mm×3 μm), and the mobile phase was composed of acetonitrile (containing 0.5% acetic acid and 0.025% trifluoroacetic acid)-water (containing 0.5% acetic acid and 0.025% trifluoroacetic acid) (85∶15,V/V). The flow rate was 0.25 mL/min and the sample run time was 3.0 min. A tandem mass spectrometer coupled with positive electro-spray ionization (ESI) source was used for detection. The quantitative analysis was performed on selective ion chromatograms acquired by a multiple reaction monitoring (MRM) mode of following transitions: ADMA (m/z203.2→46.0), SDMA (m/z203.2→172.1), NMMA (m/z189.0→70.0), Cit (m/z176.0→70.0),L-Arg (m/z175.1→60.071), and D7-ADMA (m/z210.0→77.1). The specificity, accuracy, linearity, intra-day and inter-day precision, recovery and matrix effect were investigated in this study according to the guidance issued by the Food and Drug Administration (FDA) of USA. The method was validated over the concentration range of 0.1-5 mmol/L for ADMA, SDMA and NMMA, 10-250 mmol/L forL-Arg and Cit, respectively. Inter-day and intra-day precision were less than 15% and accuracy was within 85%-115%. The linear regression (weighed by 1/x2) was applied to establish the relationship between plasma concentration and peak area ratio of each analyte (minus that of the blank) to its IS. Topical equations of ADMA, SDMA, NMMA,L-Arg and Cit were as follows:y=0.385 1x+0.207 7 (r=0.996 7),y=0.418 0x+0.200 7 (r=0.998 3),y=0.366 2x+0.048 31(r=0.998 5),y=0.011 53x+1.204 9 (r=0.998 0), andy=0.043 21x+8.315 4 (r=0.994 1), respectively. The extraction recoveries of ADMA, SDMA, NMMA, Cit andL-Arg were (92.5±8.6)%, (88.5±6.5)%, (50.6±3.1)%, (27.0±0.3)% and (33.9%±2.1)%, respectively. The matrix effects about ADMA, SDMA, NMMA, Cit andL-Arg were (90.5±6.3)%, (83.0±3.5)%, (50.6±2.5)%, (41.0±0.1)%, and (32.9±0.2)%, respectively. Therefore, this method is rapid, simple and sensitive, and which can provide a highly efficient detection means to the future clinical disease diagnosis.

ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); ilaprazole; protein precipitation; hydrophilic chromatography (HILIC)

2015-12-29;

2016-03-01

田曄(1988—)，女(漢族)，河南周口人，碩士研究生，從事藥代動(dòng)力學(xué)研究。E-mail: tianye504@163.com

王洪允(1975—)，男(滿(mǎn)族)，遼寧撫順人，副研究員，從事藥代動(dòng)力學(xué)研究。E-mail: wanghy@pumch.cn

O657.63

A

1004-2997(2016)05-0446-07

10.7538/zpxb.youxian.2016.0036

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-07-05；網(wǎng)絡(luò)出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160705.1020.004.html