王　燕，李曉波，李俊杰，熊海燕，彭崇勝

(上海交通大學藥學院，上?！?00240)

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5,6,7,4′-四羥基黃酮和5,6,7,4′-四甲氧基黃酮高分辨電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜裂解規(guī)律對比研究

王燕，李曉波，李俊杰，熊海燕，彭崇勝

(上海交通大學藥學院，上海200240)

以5,6,7,4′-四羥基黃酮和5,6,7,4′-四甲氧基黃酮為例，運用高分辨電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜在正離子模式下(HR-ESI-MS/MS)獲得的碎片離子，根據(jù)一、二級質(zhì)譜離子的精確質(zhì)荷比，分別推導出兩種黃酮可能的裂解途徑，并比較多甲氧基、多羥基黃酮質(zhì)譜裂解規(guī)律的異同。結(jié)果表明：在正離子模式下，5,6,7,4′-四羥基黃酮和5,6,7,4′-四甲氧基黃酮的一級質(zhì)譜均可獲得穩(wěn)定的準分子離子。5,6,7,4′-四羥基黃酮的二級質(zhì)譜碎片離子由準分子離子[M+H]+經(jīng)RDA裂解及進一步脫水和(或)脫一氧化碳中性分子產(chǎn)生，直接由準分子離子脫水及一氧化碳中性分子獲得的碎片離子豐度比較低；5,6,7,4′-四甲氧基黃酮二級質(zhì)譜碎片即可由準分子離子[M+H]+直接經(jīng)RDA裂解，還可先脫去乙烷或甲烷中性分子再經(jīng)RDA裂解(1,3斷裂)獲得。此外，該化合物還有大量的碎片離子是由準分子離子[M+H]+分別經(jīng)脫水、甲烷、乙烷或進一步脫甲基、一氧化碳而獲得。兩個化合物質(zhì)譜碎片的比較結(jié)果表明，多甲氧基黃酮的二級質(zhì)譜碎片裂解機制更復雜，碎片信息更豐富。該方法可為黃酮類化合物成分的快速定性分析提供支持，也可為黃酮類化合物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的LC-MS/MS鑒定提供依據(jù)。

5,6,7,4′-四羥基黃酮；5,6,7,4′-四甲氧基黃酮；高分辨電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜；質(zhì)譜裂解途徑

黃酮是一類廣泛分布于植物藥和天然食物中的生物活性明確的天然有機成分[1]，以多羥基取代黃酮及其苷類較為常見，如槲皮素(3,5,7,3′,4′-五羥基黃酮)、3-O-蕓香糖苷(蘆丁)等。近年來，相繼分離鑒定的多甲氧基黃酮因被證實具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用而受到廣泛關(guān)注[2]。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法已廣泛應用于包括黃酮在內(nèi)的天然化合物的鑒定與分析[3-4]。但如何通過串聯(lián)質(zhì)譜法區(qū)別多羥基、多甲氧基取代的兩類黃酮結(jié)構(gòu)還未見報道。

本工作以5,6,7,4′-四羥基黃酮和5,6,7,4′-四甲氧基黃酮(結(jié)構(gòu)示于圖1)為例，探討正離子模式下，高分辨電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)分析多甲氧基黃酮和多羥基黃酮的質(zhì)譜裂解規(guī)律，并比較兩種黃酮生成碎片離子的差異性，旨為黃酮類化合物以及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物的LC-MS/MS鑒定分析提供依據(jù)。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

Acquity-QTOF Premier四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品，配有在線脫氣四元泵、自動進樣器和Masslynx 4.1工作站；Gradient A10 Mill-Q超純水器：美國Millipore公司產(chǎn)品；Sartorius電子分析天平：賽多利斯儀器(北京)系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品。

圖1　5,6,7,4′-四羥基黃酮(a)和5,6,7,4′-四甲氧基黃酮(b)的結(jié)構(gòu)式Fig.1　Chemical structures of 5,6,7,4′-tetrahydroxy-flavone (a) and 5,6,7,4′-tetramethoxy-flavone (b)

5,6,7,4′-四甲氧基黃酮：純度>98%，本課題組自制；5,6,7,4′-四羥基黃酮：純度>98%，四川省維克奇生物科技有限公司產(chǎn)品；乙腈、甲酸：均為HPLC級，德國Merck公司產(chǎn)品；實驗用水：超純水。

1.2實驗條件

用甲醇配制濃度為100 mg/L的樣品溶液，直接進樣，進樣體積為1 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)正離子模式；毛細管電壓3.0 kV；錐孔電壓35 V；碰撞能量35 eV；離子源溫度115 ℃；脫溶劑溫度350 ℃；錐孔氣和脫溶劑氣均為氮氣，純度為99.99%；錐孔氣流速50 L/h；脫溶劑氣流速600 L/h；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000；掃描時間0.2 s；間隔時間0.02 s；碰撞氣為氬氣，純度為99.99%。

2　結(jié)果與討論

在軟電離條件下，黃酮類化合物母核質(zhì)譜裂解通常發(fā)生在C環(huán)上[4]，產(chǎn)生相應的1,3A+，1,3B+和0,2B+碎片離子，示于圖2。5,6,7,4′-四羥基黃酮的結(jié)構(gòu)特征是：黃酮母核上A環(huán)有3個相鄰羥基取代，B環(huán)4′位有1個羥基取代，黃酮母核是超共軛體系，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，在正離子模式下可獲得穩(wěn)定的準分子離子峰m/z287.055 0([M+H]+)；5,6,7,4′-四甲氧基黃酮在正離子模式下也可獲得穩(wěn)定的準分子離子峰m/z343.124 5([M+H]+)。在ESI正離子模式下，5,6,7,4′-四羥基黃酮和5,6,7,4′-四甲氧基黃酮的高分辨二級質(zhì)譜圖示于圖3，二者的二級質(zhì)譜碎片離子元素組成的分析數(shù)據(jù)分別列于表1、表2。

圖2　黃酮母核C環(huán)裂解Fig.2　Cleavage at C-ring for flavone

2.15,6,7,4′-四羥基黃酮可能的裂解途徑及特征碎片

由圖3a可見，在5,6,7,4′-四羥基黃酮碎片離子中，C7H5O5(m/z169.013 9)和C8H7O(m/z119.049 2)分別是[M+H]+直接經(jīng)RDA裂解產(chǎn)生的1,3A+、1,3B+，豐度較高；而C環(huán)裂解產(chǎn)生的0,2B+為C7H5O2(m/z121.029 1)，豐度較低；碎片離子C6H3O3(m/z123.007 6)、C5H3O2(m/z95.013 2)只能由RDA碎片1,3A+進一步裂解產(chǎn)生。5,6,7,4′-四羥基黃酮可能的裂解途徑示于圖4。該化合物主要裂解途徑Ⅰ是通過RDA裂解產(chǎn)生C7H5O5，該離子進一步脫水生成碎片離子C7H3O4，再脫去1分子CO，得到基峰C6H3O3(m/z123.007 6)，繼續(xù)脫去1個CO，得到五元芳環(huán)的碎片離子C5H3O2。該化合物的另一個主要裂解途徑Ⅱ是先進行RDA裂解(1，3)產(chǎn)生C8H7O，然后脫去1分子CO，得到較穩(wěn)定的環(huán)庚三烯正離子C7H7。該化合物的裂解途徑Ⅲ產(chǎn)生C7H5O2(m/z121.029 1)。除了RDA裂解及進一步丟失CO、H2O等中性分子產(chǎn)生的特征離子外，還觀察到多次脫去H2O、CO產(chǎn)生的多個碎片離子，如裂解途徑Ⅳ、Ⅴ。另一個碎片離子峰m/z227.033 9比準分子離子少C2H4O2，可能是A環(huán)脫去2個甲醛中性分子得到的離子C13H7O4。

圖3　ESI正離子模式下，5,6,7,4′-四羥基黃酮(a)和5,6,7,4′-四甲氧基黃酮(b)的高分辨二級質(zhì)譜圖Fig.3　High resolution mass spectrometry of 5,6,7,4′-tetrahydroxy-flavone (a) and 5,6,7,4′-tetramethoxy-flavone (b) in ESI positive ion mode

元素組成理論值m/z實測值m/z質(zhì)量誤差/mDa碎片離子來源相對豐度/%C15H9O5269.0450269.0444-0.6[M+H]+-H2O12.61C14H11O5259.0606259.0611+0.5[M+H]+-CO1.73C14H9O4241.0501241.0498-0.3[M+H]+-H2O-CO5.85C13H7O4227.0344227.0339-0.5[M+H]+-C2H4O23.78C13H9O3213.0552213.0555+0.3[M+H]+-H2O-2CO2.57C13H7O2195.0446195.04460[M+H]+-2H2O-2CO1.50C7H5O5169.0137169.0139+0.2[M+H]+-C8H6O16.20C11H9O157.0653157.0655+0.2[M+H]+-H2O-3CO2.38C7H3O4151.0031151.0037+0.6[M+H]+-C8H6O-H2O3.18C6H3O3123..0082123.0076-0.6[M+H]+-C8H6O-H2O-CO36.80C7H5O2121.0290121.0291+0.1[M+H]+-C8H6O47.23C8H7O119.0497119.0492-0.5[M+H]+-C7H4O522.59C5H3O295.013395.0132-0.1[M+H]+-C8H6O-H2O-2CO3.95C7H791.054891.0543-0.5[M+H]+-C7H4O5-CO3.00

表2　ESI正離子模式下，5,6,7,4′-四甲氧基黃酮的質(zhì)譜碎片離子

圖4　ESI正離子模式下，5,6,7,4′-四羥基黃酮可能的裂解途徑Fig.4　Proposed fragmentation pathway of 5,6,7,4′-tetrahydroxy-flavone in ESI positive ion mode

2.25,6,7,4′-四甲氧基黃酮可能的裂解途徑及特征碎片

5,6,7,4′-四甲氧基黃酮可能的裂解途徑及特征碎片示于圖5。該化合物二級質(zhì)譜基峰(m/z153.019 3，C7H5O4)是通過裂解路徑Ⅰ得到的，即首先由準分子離子[M+H]+在A環(huán)脫去1分子乙烷(C2H6)，得到二醌結(jié)構(gòu)碎片(m/z313.071 2，C17H13O6)，再經(jīng)RDA裂解獲得碎片離子1,3A+(m/z181.013 4，C8H5O5)，進一步脫去1分子CO而得到的。二醌碎片離子C17H13O6直接脫1分子CO，得到豐度僅次于基峰的碎片離子C16H13O5(m/z285.076 4)，再脫去甲基游離基，獲得碎片離子C15H10O5(m/z270.057 2)。裂解途徑Ⅰ中出現(xiàn)的碎片離子C8H3O5(m/z178.999 2)可能是RDA裂解后脫去H2獲得的6位甲氧基與4位羰基正離子的成環(huán)產(chǎn)物。裂解途徑Ⅰ產(chǎn)生的二醌碎片離子C17H13O6還可脫去1分子H2O和1分子CO生成稠環(huán)芳香醚類碎片離子C16H11O4(m/z267.068 0)。裂解途徑Ⅱ中，5,6,7,4′-四甲氧基黃酮直接經(jīng)RDA裂解獲得1,3B+(m/z133.066 1，C9H9O)，其離子豐度為36.4%；裂解途徑Ⅲ中，C環(huán)裂解產(chǎn)生0,2B+(m/z135.045 0，C8H7O2)的離子豐度為22.3%；而裂解途徑Ⅳ中，直接經(jīng)RDA裂解產(chǎn)生的1,3A+離子(m/z211.063 0，C10H11O5)豐度僅為4.5%。

該化合物的另一條重要裂解途徑Ⅴ示于圖6。它是由準分子離子[M+H]+的A環(huán)鄰二甲氧基脫去1分子甲烷形成亞甲二氧結(jié)構(gòu)的碎片離子C18H15O6(m/z327.087 4)。該碎片離子可進一步經(jīng)RDA裂解得到1,3A+離子(m/z195.031 4，C9H7O5)；也可在C環(huán)脫1分子CO，生成m/z299.092 3碎片離子C17H15O5；還可進一步在B環(huán)脫CH3得m/z284.070 6碎片離子C16H12O5，繼續(xù)在B環(huán)脫1分子CO得到m/z256.074 7碎片C15H12O4。此外，亞甲二氧碎片離子C18H15O6可先脫去H2O生成稠合的芳香醚碎片離子C18H13O5(m/z309.077 0)，并可在B環(huán)繼續(xù)脫甲基、CO獲得m/z266.059 2碎片離子C16H10O4。由于觀察到m/z325.072 5碎片離子，推測m/z309.077 0碎片可能存在直接由準分子離子[M+H]+脫去1分子H2O后，再脫去1分子CH4的裂解途徑。

圖5　ESI正離子模式下，5,6,7,4′-四甲氧基黃酮可能的裂解途徑Ⅰ～ⅣFig.5　Proposed fragmentation pathwayⅠ-Ⅳ of 5,6,7,4′-tetramethoxy-flavone in ESI positive ion mode

圖6　ESI正離子模式下，5,6,7,4′-四甲氧基黃酮可能的裂解途徑ⅤFig.6　Proposed fragmentation pathway Ⅴ of 5,6,7,4′-tetramethoxy-flavone in ESI positive ion mode

5,6,7,4′-四甲氧基黃酮其他可能的裂解途徑示于圖7。此途徑中，該化合物通過準分子離子[M+H]+同時脫去2分子CH4得到碎片離子C17H11O6(m/z311.058 7)，或同時脫去2個甲氧基得到碎片離子C17H13O4(m/z281.082 0)，并進一步脫去1分子CO得到碎片離子C16H13O3(m/z253.086 0)。也可在A環(huán)同時脫去1分子H2O，1分子CO和1個甲基得到碎片離子C17H14O4(m/z282.088 4)，這與文獻[5]報道的5,6-二甲氧基取代黃酮的質(zhì)譜裂解途徑一致，該碎片離子還可進一步脫去1分子CO和1個甲基得到碎片離子C15H11O3(m/z239.073 1)。

圖7　ESI正離子模式下，5,6,7,4′-四甲氧基黃酮其他可能的裂解途徑Fig.7　Other possible fragmentation pathway of 5,6,7,4′-tetramethoxy-flavone in ESI positive ion mode

2.3討論

黃酮類化合物在化學誘導碰撞解離(CID)中可見C環(huán)裂解模式，分別產(chǎn)生1,3A+、1,3B+和0,2B+3類碎片離子[4]。在電噴霧條件下，C環(huán)裂解模式的研究較少，一般出現(xiàn)于亞甲二氧基取代的黃酮，只提及到1,4B+和0,3A+的裂解途徑，未見裂解產(chǎn)生0,2B+碎片的報道[5]。以往，多甲氧基黃酮較少被關(guān)注，雖有ESI質(zhì)譜特征的報道，但主要觀察到準分子離子脫去CH4、H2O、CO、CO2等中性碎片及甲基自由基，未見C環(huán)裂解的相關(guān)碎片[6]。本研究較系統(tǒng)地對比了多羥基、多甲氧基取代模式的兩種黃酮母核裂解和(或)脫中性分子得到的碎片離子，并給出了可能的裂解途徑。多甲氧基黃酮EI質(zhì)譜的C環(huán)裂解規(guī)律已有文獻報道[7]，但主要得到的是未質(zhì)子化的碎片離子，與ESI質(zhì)譜獲得的質(zhì)子化的碎片離子不同。

3　結(jié)論

本研究以5,6,7,4′-四羥基黃酮和5,6,7,4′-四甲氧基黃酮為例，比較了多羥基取代黃酮與多甲氧基取代黃酮在電噴霧質(zhì)譜正離子模式下的裂解規(guī)律，找到了各自的特征碎片離子。實驗結(jié)果豐富了黃酮類，特別是多甲氧基黃酮的質(zhì)譜裂解規(guī)律，可為黃酮類成分的快速定性分析提供支持。

[1]周傳核. 植物生物活性物質(zhì)[M]. 北京:化學工業(yè)出版社，2005:33-36.

[2]LIN Y S, LI S, HO C T, et al. Simultaneous analysis of six polymethoxyflavones and six 5-hydroxy-polymethoxyflavones by high performance liquid chromatography combined with linear ion trap mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(49): 12 082-12 087.

[3]SCORDINO M, SABATINO L, TRAULO P, et al. HPLC-PDA/ESI-MS/MS detection of polymethoxylated flavones in highly degraded citrus juice: A quality control case study[J]. European Food Research and Technology, 2011, 232(2): 275-280.

[4]MA Y L, LI Q M, van den HEUVEL H, et al. Characterization of flavone and flavonol gglycones by collision-induced dissociation tandem mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1997, 11(12): 1 357-1 364.

[5]MENEZES J C, CAVALEIRO J A S, KAMAT S P, et al. Electrospray tandem mass spectrometry analysis of methylenedioxy chalcones, flavanones and flavones[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2013, 27(12): 1 303-1 310.

[6]WANG K W, ZHANG H. Positive electrospray ionization tandem mass spectrometry of polymethoxylated flavones[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2009, 23(13): 2 107-2 111.

[7]BERAHIA T, GAYDOU E M, CERRATI C, et al. Mass spectrometry of polymethoxylated flavones[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1994, 42(8): 1 697-1 700.

Fragmentation Pathway Comparison of 5,6,7,4′-Tetrahydroxy-Flavone and 5,6,7,4′-Tetramethoxy-Flavone by High Resolution Electrospray Ionization Tandem Mass Spectroscopy

WANG Yan, LI Xiao-bo, LI Jun-jie, XIONG Hai-yan, PENG Chong-sheng

(ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,China)

5,6,7,4′-Tetrahydroxy-flavone and 5,6,7,4′-tetramethoxy-flavone were subjected to high resolution electrospray ionization tandem mass spectrometry (HR-ESI-MS/MS) in positive ion mode to obtain their protonated molecules and subsequent product ions, which were further analyzed to give proposed fragmentation pathways for the two flavones of polyhydroxy and polymethoxy substitution according to the high resolution mass to charge of product ions. The results show that the two compounds give stable pseudo-molecular ions (protonated molecules) in positive ion mode. Product ions for 5,6,7,4′-tetrahydroxy-flavone are mainly produced by Retro Diels-Alder (RDA) reaction from its protonated molecule [M+H]+and subsequent neutral loss of H2O and (or) CO, while direct neutral loss of H2O and (or) CO from [M+H]+give product ions with low relative abundance. Product ions for 5,6,7,4′-tetramethoxy-flavone are obtained both by direct RDA cleavage from protonated molecule [M+H]+and neutral loss of C2H6and CH4with subsequent RDA cleavage. More product ions for 5,6,7,4′-tetramethoxy-flavone are produced by loss of CH4, C2H6, CO and H2O, even CH3. HR-ESI-MS/MS comparison of the two flavones shows very different MS fragmentation pathways, which leads to more special ion peaks for polymethoxy substitution than for polyhydroxy substitution.

5,6,7,4′-tetrahydroxy-flavone; 5,6,7,4′-tetramethoxy-flavone; high resolution electrospray ionization tandem mass spectrometry (HRESI-MS/MS); fragmentation pathways

2015-11-02;

2015-12-09

傣族藥“腎茶”治療慢性腎炎的物質(zhì)基礎(chǔ)及其研究方法課題(81173655)資助

王燕(1990—)，女(漢族)，江蘇人，碩士研究生，藥學專業(yè)。E-mail: sjtuywang@163.com

彭崇勝(1966—)，男(漢族)，安徽人，副教授，從事民族藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: cspeng@sjtu.edu.cn

O657.63

A

1004-2997(2016)05-0385-08

10.7538/zpxb.youxian.2016.0023

網(wǎng)絡出版時間：2016-03-28；網(wǎng)絡出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160328.1443.006.html