王丁眾，張啟東，劉俊輝，柴國璧，張文娟，霍現(xiàn)寬，孫世豪，宗永立，張建勛，朱　琦，孫姝軍

(1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，煙草行業(yè)煙草香料基礎(chǔ)研究重點實驗室，河南 鄭州　450001；2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，河南 鄭州　450016；3.中國煙草總公司，北京　100045)

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煙氣苦味成分的感官導(dǎo)向鑒定和液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析

王丁眾1，張啟東1，劉俊輝1，柴國璧1，張文娟1，霍現(xiàn)寬1，孫世豪1，宗永立1，張建勛1，朱琦2，孫姝軍3

(1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，煙草行業(yè)煙草香料基礎(chǔ)研究重點實驗室，河南 鄭州450001；2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，河南 鄭州450016；3.中國煙草總公司，北京100045)

煙氣中苦味化合物多為難揮發(fā)成分，種類多、含量低。本研究采用感官導(dǎo)向鑒定法與液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(LC-HRMS)相結(jié)合分析煙氣苦味成分，利用凝膠色譜分離主流煙氣粒相物水溶性成分，并對各流分進(jìn)行感官評價以確定苦味流分，合并后得到苦味特征組分。采用Q-Exactive型LC-HRMS儀器分析苦味特征組分，通過保留時間和二級質(zhì)譜定性，對化合物標(biāo)準(zhǔn)品水溶液進(jìn)行味覺評價，確定苦味化合物。在苦味特征組分中共鑒定出16種化合物，其中有苦味特征的是新煙草堿、降煙堿、麥斯明、可替寧、2-丁基咪唑、2-異丙基咪唑、煙酰胺、N-甲基煙酰胺、N-乙基煙酰胺和3-乙基-4-甲基-3-二氫吡咯-2-酮。該方法可為鑒定煙氣中關(guān)鍵的苦味成分，實現(xiàn)卷煙產(chǎn)品的定向設(shè)計，提高卷煙的感官舒適性提供參考。

苦味化合物；煙氣；感官導(dǎo)向鑒定；液相色譜-高分辨質(zhì)譜(LC-HRMS)

卷煙煙氣成分復(fù)雜，通過紫外、紅外、色譜、質(zhì)譜、以及核磁共振等方法已鑒定了其中6 010種化合物[1]。卷煙產(chǎn)品的感官品質(zhì)與煙氣中的化學(xué)成分密切相關(guān)，找到影響感官品質(zhì)的關(guān)鍵化學(xué)成分有助于定向設(shè)計卷煙產(chǎn)品，提升感官舒適性。感官特征主要分為嗅覺、味覺和化學(xué)感覺，味覺又分為酸、甜、苦、咸、鮮5種[2]，其中，苦味作為一種不良味覺，相關(guān)的研究很少。這是因為，一方面苦味化合物大多有毒或有害[3]，常見的研究方法是選擇已知的苦味化合物進(jìn)行分析[4-6]；另一方面，苦味物質(zhì)種類繁多，不同食品之間的苦味成分種類和含量差別較大[7]，難以直接借鑒已有的研究結(jié)果。對于復(fù)雜的煙氣成分來說，直接對已知化合物進(jìn)行評價是耗時耗力且有一定危險性的工作。因此，本研究擬采用感官導(dǎo)向的分析方法，探索卷煙煙氣中的未知苦味化合物。

感官導(dǎo)向的分析方法是以感官評價結(jié)果為導(dǎo)向，在分離過程中定位感官特征組分，然后利用色譜、質(zhì)譜和核磁共振等技術(shù)對組分中的化合物進(jìn)行鑒定，最后用感官評價的方法對鑒定出的化合物的感官特征進(jìn)行確證。該方法能夠簡化和聚焦研究對象，已成功用于烤可可豆[8]、紅酒[9]、鱷梨[10]和啤酒花[11]等食品提取物中苦味關(guān)鍵成分的確定。對于揮發(fā)性或半揮發(fā)性化合物，常采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)進(jìn)行鑒定，但苦味物質(zhì)大多為低含量的難揮發(fā)化合物，如生物堿、萜類、糖苷、鹽類、氨基酸和多肽等[12]，GC/MS分析此類化合物有很大的局限性。以靜電場軌道阱質(zhì)量分析器為核心的高分辨質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，為復(fù)雜樣品中非揮發(fā)性化合物的鑒定提供了可能性[13]。

煙氣中的苦味物質(zhì)進(jìn)入口腔后溶于唾液，然后引起味蕾上的味覺神經(jīng)末梢刺激，傳遞到大腦形成苦味[2]。從苦味的產(chǎn)生過程來看，物質(zhì)具有一定的水溶性是其在口腔中產(chǎn)生苦味的前提，因此將研究對象限定為煙氣粒相物水溶性組分。本研究擬通過感官導(dǎo)向的分離方法從煙氣粒相物水溶性組分中提取苦味特征組分，用液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(LC-HRMS)進(jìn)行定性分析和定量檢測，并對鑒定出的化合物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行感官評價，找到對煙氣苦味有貢獻(xiàn)的化合物。

1　實驗部分

1.1儀器與裝置

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀、Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀：均為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品，配有Xcalibur 2.2數(shù)據(jù)處理軟件；凝膠色譜柱：德國Buchi公司產(chǎn)品；Sephadex LH-20填料：瑞典GE Healthcare公司產(chǎn)品；SM450型20孔道直線型吸煙機(jī)：英國Cerulean公司產(chǎn)品；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司產(chǎn)品；劍橋濾片(44 mm)：英國Whatman公司產(chǎn)品。

1.2材料與試劑

煙堿、假木賊堿：加拿大Toronto Research Chemical公司產(chǎn)品；麥斯明(98%)、降煙堿(98%)、2-羥基吡啶(98%)、3-羥基吡啶(98%)、5-羥基-2-甲基吡啶(98%)、異喹啉(98%)、4-乙烯基吡啶(95%，含穩(wěn)定劑HQ)：北京百靈威科技有限公司產(chǎn)品；新煙草堿(97%)：美國Matrix Scientific公司產(chǎn)品；可替寧(98%)：阿法埃沙(中國)化學(xué)有限公司產(chǎn)品；4-羥甲基-5-甲基咪唑鹽酸鹽(>98%)、3-乙基-4-甲基-3-二氫吡咯-2-酮(>98%)、煙酰胺(99.5%)、N-甲基煙酰胺(>98%)、N-乙基煙酰胺(>98%)、2-乙烯基吡啶(>97%，含穩(wěn)定劑TBC)：梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；喹啉、2-異丙基咪唑(98%)、2-丁基咪唑(99%)：瑞士Adamas Reagent公司產(chǎn)品；甲醇、乙醇、乙腈(HPLC純)：美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品；甲酸銨(HPLC純)：德國CNW Technologies GmbH公司產(chǎn)品；超純水(18.20 MΩ·cm)：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.3煙氣粒相物苦味特征組分的制備

參照文獻(xiàn)[14]，選擇巴西濃香型煙葉制成的單料煙，按ISO 3308和GB/T 19609—2004規(guī)定的方法抽吸。利用劍橋濾片收集4支卷煙的主流煙氣粒相物，每個濾片用120 mL乙醇萃取3次，合并萃取液；除去乙醇，加水溶解、過濾，然后將水溶液冷凍干燥、除去水分，得到的棕紅色粘稠固體即為煙氣粒相物的水溶性組分。

將得到的固體溶于4 mL水中，通過凝膠色譜分離。凝膠色譜柱(2.6 cm×100 cm)中的填料是Sephadex LH-20，流動相為水，流速1 mL/min，每隔10 min收集1個流分，共收集40個；然后由6位味覺評價人員通過舌尖品嘗的方式對各流分的味覺特征進(jìn)行評價，確定含有苦味的流分；合并苦味流分，冷凍干燥后，于-20 ℃儲存，得到苦味特征組分。在味覺評價前，味覺評價人員依照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 12312—2012 感官分析味覺敏感度的測定方法》配制苦味標(biāo)準(zhǔn)溶液鹽酸奎寧(0.010 g/L)，進(jìn)行苦味校準(zhǔn)。

1.4定性分析條件

1.4.1色譜條件Acquity UPLC BEH HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm×1.7 μm)；流動相：A為10 mmol/L甲酸銨，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～0.5 min、80%B，0.5～6.5 min、80%B～40%B，6.5～7 min、40%B～80%B，保持1 min；流速0.2 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件采用Xcalibur 2.2軟件采集數(shù)據(jù)，掃描模式分別為一級質(zhì)譜全掃描(LC-HRMS分析時)和目標(biāo)二級質(zhì)譜掃描target-MS2(LC-MS/MS分析時)；離子源為加熱電噴霧(HESI)；加熱溫度至300 ℃；噴霧電壓3.5 kV；所用載氣為N2；鞘氣、輔助氣和尾吹氣流速分別為30、10和0個單位；離子傳輸毛細(xì)管溫度為320 ℃；一級質(zhì)譜全掃描模式下，質(zhì)量掃描范圍為m/z80～500；target-MS2模式下，碰撞氣為N2，歸一化的HCD碰撞能量為100%，其他參數(shù)為儀器默認(rèn)。

1.5定量分析條件

以甲醇為溶劑，配制已鑒定化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇二烯煙堿為內(nèi)標(biāo)物，以目標(biāo)化合物和內(nèi)標(biāo)物的[M+H]+峰為檢測對象，通過LC-HRMS法測定苦味特征組分中這些化合物的含量。掃描模式為選擇離子監(jiān)測(target-SIM)，其他分析條件同1.4節(jié)。

1.6標(biāo)準(zhǔn)品味覺評價

將苦味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成0.5 g/L的水溶液，由6位評價人員分別評價其味覺特征。以超過半數(shù)評價人員的評價結(jié)果為準(zhǔn)，確定苦味特征組分中的苦味化合物。評價之前按照1.3節(jié)的方法對評價人員進(jìn)行苦味校準(zhǔn)。

2　結(jié)果與討論

2.1主流煙氣粒相物水溶性組分味覺評價結(jié)果

將2.53 g煙氣粒相物水溶性組分溶于水，加入到凝膠色譜柱中，用水作為流動相進(jìn)行分離后，收集了40個流分，依次編號為F1～F40。40個流分的味覺評價結(jié)果列于表1。其中，F(xiàn)1～F5和F28～F40均為淺黃色液體，沒有明顯的味覺特征；F6～F27顏色較深，其味覺特征依次表現(xiàn)為酸、辣和苦；不同于辣感和酸味流分的強(qiáng)烈刺激感和集中分布，F(xiàn)13～F27流分能感受到中到弱的苦味。合并這些流分并冷凍干燥后，共收集30 mg苦味特征組分。由此可見，雖然苦味物質(zhì)存在于多個流分中，但其總含量很低。

表1　凝膠色譜流分味覺評價結(jié)果

2.2定性分析

以m/z值的±5×10-6為限，對苦味特征組分全掃描圖譜中主要的[M+H]+峰離子流圖進(jìn)行提取，并在F13～F27各流分單獨的全掃描圖譜中搜索，通過比較提取[M+H]+峰的色譜保留時間，確定了65種在苦味特征組分和合并前任一流分中共存的化合物，其中大部分在m/z90～200范圍內(nèi)。

定性分析過程以LC-HRMS掃描苦味特征組分中[M+H]+峰m/z163.122 6為例：利用Xcalibur軟件計算該化合物的分子式為C10H14N2，推測為煙堿或假木賊堿[15]；經(jīng)LC-MS/MS分析，得到[M+H]+m/z163.122 6的離子流圖和二級質(zhì)譜圖，示于圖1?？梢钥闯觯b定化合物與煙堿的保留時間接近，但與假木賊堿有明顯差異；在二級質(zhì)譜圖中，待鑒定化合物和煙堿標(biāo)準(zhǔn)品最大豐度的碎片離子峰均為m/z117.057 1和m/z130.064 7，而假木賊堿為m/z118.065 0和m/z92.049 8，因此判斷該化合物為煙堿。

按照同樣的方法，在煙氣苦味特征組分中共鑒定出16種化合物，結(jié)果列于表2。定性分析這些化合物時遇到的情況主要分為3類：1) 特征組分中色譜峰為單峰，推測的結(jié)構(gòu)為常見煙氣成分，可直接通過標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行確定，如煙堿、新煙草堿、降煙堿、麥斯明、可替寧、煙酰胺、N-甲基煙酰胺、N-乙基煙酰胺等；2) 特征組分中色譜峰為單峰，但推測的化合物存在多種同分異構(gòu)體，例如[M+H]+峰m/z96.044 5對應(yīng)的化合物為C5H5NO，查閱文獻(xiàn)可知，煙氣中存在2-羥基吡啶和3-羥基吡啶同分異構(gòu)體[15]，二者的保留時間與樣品一致，需通過二級質(zhì)譜圖確定該化合物為3-羥基吡啶；3) 色譜峰為多個峰的混合，且同分異構(gòu)體眾多，通過保留時間和二級質(zhì)譜圖只能確定其中存在的某一種同分異構(gòu)體，例如2-丁基咪唑、2-異丙基咪唑。

目前已鑒定出的化合物只占樣品中非常少的一部分，主要原因是無法得到推測化合物的標(biāo)準(zhǔn)品。例如，推測[M+H]+峰m/z203.117 5是N-乙?；聼煵輭A(C12H14N2O)，m/z191.117 5可能是N′-乙酰基降煙堿或N′-甲?；倌举\堿(C11H14N2O)。但由于沒有用于結(jié)構(gòu)驗證以及后續(xù)味覺評價的標(biāo)準(zhǔn)品，限制了對潛在苦味物質(zhì)的進(jìn)一步確證。

此外，一些化合物雖然有標(biāo)準(zhǔn)品，但由于保留時間差異較大，不能確定其結(jié)構(gòu)式。 例如，[M+H]+峰m/z130.064 7可能是喹啉或者異喹啉(C9H8N)，它們的二級質(zhì)譜圖均與樣品相同，但保留時間差異明顯，示于圖2。同樣的情況還出現(xiàn)在峰m/z106.065 1上，不能確定是2-乙烯基吡啶還是4-乙烯基吡啶。這可能是因為復(fù)雜樣品中的目標(biāo)化合物以鹽、復(fù)合物等形式存在，影響了其保留時間。

圖1　[M+H]+峰m/z 163.122 6的離子流圖(a)和二級質(zhì)譜圖(b)Fig.1　Ion current chromatogram (a) and secondary mass spectra (b) of m/z 163.122 6

序號[M+H]+峰(m/z)實際值理論值分子式可能的化合物保留時間/min樣品標(biāo)準(zhǔn)品196.044596.0444C5H5NO3-羥基吡啶2.602.562110.0599110.0600C6H7NO2-甲基-5-羥基吡啶2.682.653111.0916111.0917C6H10N22-異丙基咪唑3.403.604113.0711113.0709C5H8N2O4-羥甲基-5-甲基咪唑3.713.735123.0553123.0553C6H6N2O煙酰胺2.682.746125.1073125.1073C7H12N22-丁基咪唑3.613.477126.0913126.0916C7H11NO3-乙基-4-甲基-3-二氫吡咯-2-酮2.482.508132.0807132.0808C9H9N2-甲基吲哚5.385.269137.0707137.0709C7H8N2ON-甲基煙酰胺2.732.7410147.0915147.0917C9H10N2麥斯明3.063.0411148.0755148.0757C9H9NO5-羥基-2-甲基吲哚2.472.2512149.1069149.1073C9H12N2降煙堿5.245.2413151.0866151.0866C8H10N2ON-乙基煙酰胺2.782.6514161.1072161.1073C10H12N2新煙草堿4.884.8815163.1226163.1230C10H14N2煙堿5.395.4016177.1020177.1022C10H12N2O可替寧2.933.00

注：a.苦味特征組分；b.喹啉；c.異喹啉圖2　[M+H]+峰m/z 130.064 7的離子流圖和各個峰的二級質(zhì)譜圖Fig.2　Ion current chromatogram and secondary mass spectra of m/z 130.064 7

2.3定量結(jié)果

為降低復(fù)雜樣品基質(zhì)的干擾，對樣品進(jìn)行了稀釋，配制的煙氣苦味特征組分濃度分別為1、10和100 mg/L，定量結(jié)果列于表3。由表3可知，各化合物的含量差異較大。由于離子化效率存在差異，各化合物的含量與質(zhì)譜信號強(qiáng)度沒有相關(guān)性，由此可見，分析過程中不能忽視那些響應(yīng)較弱的化合物。

2.4化合物的味覺評價

苦味容易被酸、甜、辣等味覺和化學(xué)感覺掩蓋，因此在評價各化合物是否有苦味時，需要單獨評價每個標(biāo)準(zhǔn)品的水溶液。考慮到各化合物的水溶性，統(tǒng)一將味覺評價所用的標(biāo)準(zhǔn)品濃度定為0.5 g/L。6名評價人員一致認(rèn)為，新煙草堿、降煙堿、麥斯明、可替寧和2-丁基咪唑具有明顯的苦味；煙堿為強(qiáng)烈的辣感，這與文獻(xiàn)[16]報道的一致。半數(shù)以上評價人員認(rèn)為，3-乙基-4-甲基-3-二氫吡咯-2-酮、煙酰胺、N-甲基煙酰胺、N-乙基煙酰胺略有苦味；2-異丙基咪唑入口為甜味，隨后為苦味；3-羥基吡啶、2-甲基-5-羥基吡啶、2-甲基吲哚、5-羥基-2-甲基吲哚沒有苦味。此外，4-羥甲基-5-甲基咪唑鹽酸鹽為酸苦，可能是鹽酸的存在影響了化合物的味覺特征，因此不能準(zhǔn)確判斷其味覺特征。綜合以上評價結(jié)果，鑒定出煙氣粒相物中的苦味成分有新煙草堿、降煙堿、可替寧、麥斯明、2-丁基咪唑、2-異丙基咪唑、煙酰胺、N-甲基煙酰胺、N-乙基煙酰胺和3-乙基-4-甲基-3-二氫吡咯-2-酮等，它們均為含氮雜環(huán)化合物。

表3　苦味特征組分中已知化合物的定量結(jié)果

3　結(jié)論

基于感官導(dǎo)向分離得到了卷煙煙氣水溶性成分中的苦味組分，通過LC-HRMS的保留時間和二級質(zhì)譜定性分析該樣品，然后對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行味覺評價。共鑒定出16種化合物，明確了對煙氣苦味有貢獻(xiàn)的化合物為新煙草堿、降煙堿、可替寧、麥斯明、2-丁基咪唑、2-異丙基咪唑、煙酰胺、N-甲基煙酰胺、N-乙基煙酰胺、3-乙基-4-甲基-3-二氫吡咯-2-酮。同時還發(fā)現(xiàn)，這幾種化合物并不能代表煙氣苦味的全部，要想全面深入地了解苦味組分的成分和各組分對于整體苦味的貢獻(xiàn)，還需要盡可能得到推測化合物的標(biāo)準(zhǔn)品；另外，由于不同化合物的苦味強(qiáng)度差別較大，不能忽視低含量化合物對煙氣苦味的貢獻(xiàn)。

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Sensory-Oriented Identification and LC-HRMS Analysis of Bitter Compounds in Cigarette Smoke

WANG Ding-zhong1, ZHANG Qi-dong1, LIU Jun-hui1, CHAI Guo-bi1,ZHANG Wen-juan1, HUO Xian-kuan1, SUN Shi-hao1, ZONG Yong-li1,ZHANG Jian-xun1, ZHU Qi2, SUN Shu-jun3

(1.KeyLaboratoryofTobaccoFlavorBasicResearchofCNTC,ZhengzhouTobaccoResearchInstituteofCNTC,Zhengzhou450001,China;2.ChinaTobaccoHenanIndustrialCo.Ltd.,Zhengzhou450016,China;3.ChinaNationalTobaccoCorporation,Beijing100045,China)

The bitter compounds in cigarette smoke have non-volatility, diversity and low-abundance. Sensory-oriented separation followed with liquid chromatography coupled with high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) was proved as a feasible solution for exploring unknown bitter compounds. In this research, water-soluble particulate of cigarette smoke was separated by gel chromatography into several fractions, which were tasted by six experienced reviewers to orient the bitter fractions. Then the bitter fractions were combined to obtain bitter-characteristic component. Sixty-five compounds existing both in this component and in any bitter fraction were preliminarily found with Q-Exactive, a LC-HRMS instrument, using retention time and accurate molecular weight as filter. Sixteen structural formulas of these compounds were confirmed with LC-MS/MS, using retention time and secondary mass spectra of supposed standard substances as references. Finally the proved standard compounds were dissolved in water and tasted by six experienced reviewers. The result shows that ten bitter compounds in bitter-characteristic component were confirmed by more than half of them, which are anatabine, nornicotine, myosmine, cotinine, 2-n-butylimidazole, 2-isopropylimidazole, nicotinamide,N-methylnicotinamide,N-ethylnicotinamide and 3-ethyl-4-methyl-3-pyrrolin-2-one. This method is helpful to identify the key bitter ingredients of cigarette smoke, directionally design cigarette products so as to improve the sensory comfort.

bitter compounds; cigarette smoke; sensory-oriented identification; liquid chromatography coupled with high resolution mass spectrometry (LC-HRMS); Q-Exactive

2016-02-24;

2016-04-11

國家自然科學(xué)基金委青年科學(xué)基金項目(21405177)；國家煙草專賣局項目(110201202008)；河南中煙項目(ZW2014058)資助

王丁眾(1986—)，男(漢族)，河南人，工程師，從事色譜-質(zhì)譜研究。E-mail: wdz426@163.com

朱琦(1970—)，男(漢族)，河南人，工程師，從事煙草化學(xué)研究。E-mail: zhuq@hatic.com

孫姝軍(1961—)，女(漢族)，北京人，工程師，從事卷煙增香保潤和卷煙產(chǎn)品品質(zhì)控制工作。E-mail: sunsj@tobacco.gov.cn

O657.63

A

1004-2997(2016)05-0414-08

10.7538/zpxb.2016.37.05.0414