徐　晨，陳維佳，于江洪，劉　舒，劉志強(qiáng)，宋鳳瑞

(1.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春　130022；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春　130021；3.吉林省東北亞藥業(yè)股份有限公司，吉林 敦化　133700)

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基于液相色譜-質(zhì)譜的代謝組學(xué)方法研究卷柏治療高尿酸血癥大鼠的作用機(jī)制

徐晨1，陳維佳2，于江洪3，劉舒1，劉志強(qiáng)1，宋鳳瑞1

(1.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春130022；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021；3.吉林省東北亞藥業(yè)股份有限公司，吉林 敦化133700)

采用基于超高效液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-ESI-QTOF/MS)的代謝組學(xué)方法研究卷柏治療高尿酸血癥大鼠的作用機(jī)制，運(yùn)用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)方法對(duì)健康對(duì)照組、高尿酸血癥模型組和卷柏組的大鼠尿液中內(nèi)源性代謝物進(jìn)行分析，尋找卷柏治療高尿酸血癥大鼠的潛在生物標(biāo)記物。結(jié)果表明，經(jīng)PCA和OPLS-DA分析后，健康對(duì)照組、高尿酸血癥模型組和卷柏組的大鼠尿液代謝物譜能得到有效地區(qū)分；發(fā)現(xiàn)并鑒定了9個(gè)潛在生物標(biāo)記物，分別為尿酸、尿囊素、黃尿酸、犬尿酸、硫酸吲哚酚、馬尿酸、肌酐、富馬酸和檸檬酸。卷柏對(duì)高尿酸血癥大鼠的治療主要體現(xiàn)為對(duì)嘌呤代謝、色氨酸代謝、三羧酸循環(huán)、精氨酸和脯氨酸代謝以及苯丙氨酸代謝的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，通過(guò)檢測(cè)血清生化指標(biāo)，表明卷柏能降低高尿酸血癥大鼠的血尿酸水平，并起到保護(hù)腎臟的作用。

代謝組學(xué)；卷柏；高尿酸血癥；液相色譜-質(zhì)譜

高尿酸血癥是由于嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致血尿酸升高的一種疾病，其診斷標(biāo)準(zhǔn)為血尿酸濃度男性高于7.0 mg/dL，女性高于6.0 mg/dL[1]。高尿酸血癥與內(nèi)皮功能紊亂、心血管疾病及腎臟疾病等密切相關(guān)[2-5]。該病多發(fā)于中年男性，但是近年來(lái)，隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，年輕人和絕經(jīng)女性的患病率逐漸增高[6]。

目前，從天然資源中尋找治療高尿酸血癥的藥物已成為藥學(xué)研究的熱點(diǎn)。其中，以黃嘌呤氧化酶為靶點(diǎn)，篩選抗痛風(fēng)中藥是現(xiàn)行的主流方法，并且取得了很好的研究進(jìn)展。有研究表明，卷柏(Selaginellatamariscina(P. Beauv.)Spring)雙黃酮提取物能夠明顯的抑制黃嘌呤氧化酶的活性[7-8]，但關(guān)于卷柏治療高尿酸血癥的整體作用機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。

代謝組學(xué)是通過(guò)考察生物體系受刺激或擾動(dòng)后，以其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化來(lái)研究生物體系代謝途徑的一門科學(xué)[9]。該學(xué)科發(fā)展迅速，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、藥物研發(fā)、藥物治療、毒性評(píng)價(jià)等領(lǐng)域[10-13]。液相色譜-質(zhì)譜(LC/MS)聯(lián)用技術(shù)，特別是超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC/MS)聯(lián)用技術(shù)，因具有較高的靈敏度和分辨率，以及較寬的動(dòng)態(tài)范圍，而被廣泛用于代謝組學(xué)研究。

本研究擬采用超高效液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UPLC-ESI-QTOF/MS)檢測(cè)經(jīng)卷柏治療的高尿酸血癥大鼠尿液中代謝物的變化，通過(guò)主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)尋找潛在的生物標(biāo)記物，并由此探索卷柏的作用機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器

Waters Synapt G2四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品，配有Acquity UPLC系統(tǒng)、ESI電噴霧離子源；Centrifuge 5810R超速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2主要試劑

黃嘌呤：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；氧嗪酸鉀：成都西亞試劑有限公司產(chǎn)品；HE染色(蘇木精-伊紅染色法)相關(guān)試劑：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；Masson染色(馬松三色染色法)試劑盒：南京建成生物研究所產(chǎn)品；卷柏：北京同仁堂制藥有限公司產(chǎn)品；尿酸、尿囊素、黃尿酸、犬尿酸、硫酸吲哚酚、馬尿酸、肌酐、富馬酸和檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品：均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.3卷柏提取物的制備

卷柏粉碎，過(guò)60目篩后，加入10倍質(zhì)量的水，浸潤(rùn)40 min，然后回流提取40 min；過(guò)濾出濾液后，再加入10倍質(zhì)量的水，回流提取40 min；合并2次濾液，于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，凍干；凍干粉加水溶解后使用。

1.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

18只Wistar大鼠(體重200～250 g)，購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)環(huán)境7天后，隨機(jī)分成3組：1) 健康對(duì)照組(HCG)：連續(xù)13天按照0.5 mL/100 g體重腹腔注射生理鹽水，每日2次；2) 高尿酸血癥模型組(MG)：連續(xù)13天按照0.5 mL/100 g體重腹腔注射造模藥(黃嘌呤和氧嗪酸鉀均為60 g/L的混合液)，每日2次；3) 卷柏組(STG)：連續(xù)13天按照0.5 mL/100 g體重腹腔注射造模藥(黃嘌呤和氧嗪酸鉀均為60 g/L的混合液)，每日2次，從第4天開(kāi)始，按照320 mg/100 g體重灌胃給藥卷柏提取物，一日1次，連續(xù)10天。

1.5樣品收集與制備

在實(shí)驗(yàn)第13天收集大鼠的18 h尿液，以10 000 r/min離心10 min，取上清液，冷凍貯藏于-80 ℃冰箱中。樣品檢測(cè)前，在4 ℃冰箱中解凍尿液樣品，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，取上清液，用超純水以1∶10(V/V)稀釋，供UPLC-ESI-QTOF/MS測(cè)定。

在實(shí)驗(yàn)第3天，取大鼠眼眶血，備用；第14天，處死大鼠，取血液；2次所得的血液均以4 000 r/min離心10 min，取上清液作為血清儲(chǔ)備液，冷凍貯藏于-80 ℃冰箱中。

1.6實(shí)驗(yàn)條件

1.6.1色譜條件Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm×2.1 mm×50 mm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為乙腈；梯度洗脫：0～5 min、5%B～20%B，5～8 min、20%B～50%B，8～10.5 min、50%B～100%B；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣室溫度4 ℃；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

1.6.2質(zhì)譜條件Waters Synapt G2四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，正離子模式毛細(xì)管電壓2.5 kV，負(fù)離子模式毛細(xì)管電壓2.0 kV，錐孔電壓40 V，萃取錐電壓2.0 V，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，錐孔氣流速50 L/h，脫溶劑氣流速800 L/h，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000，碰撞能量10～40 eV。測(cè)樣前，使用甲酸鈉進(jìn)行校正，采用分辨率模式；測(cè)樣時(shí)，采用2 μg/L亮氨酸腦啡肽實(shí)時(shí)校正，15 s校正1次，每次采集亮氨酸腦啡肽信號(hào)0.5 s，亮氨酸腦啡肽進(jìn)樣流速5 μL/min。

1.7數(shù)據(jù)處理

樣品經(jīng)UPLC-ESI-QTOF/MS檢測(cè)獲得原始數(shù)據(jù)，采用Markerlynx XS v4.1軟件進(jìn)行峰檢測(cè)、峰對(duì)齊以及歸一化。以精確分子質(zhì)量-保留時(shí)間和歸一化后的峰面積建立數(shù)據(jù)矩陣，數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入多變量統(tǒng)計(jì)軟件SIMCA-P(Umetrics, Ume?, Sweden)中進(jìn)行PCA和OPLS-DA多元變量分析。使用生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，如HMDB(http:∥www.hmdb.ca/)、METLIN (http:∥metlin.scripps.edu/)、Massbank(http:∥www.massbank.jp/)和KEGG(http:∥www.kegg.com/)進(jìn)行生物標(biāo)記物的鑒定和代謝通路的分析。

1.8血清生化指標(biāo)及腎組織切片檢測(cè)

大鼠血清中尿酸及肌酐的含量測(cè)定采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法(UPLC-TQ-MS)，具體實(shí)驗(yàn)步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。

2　結(jié)果與討論

2.1血清生化指標(biāo)檢測(cè)

血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果列于表1?？梢钥闯觯涸趯?shí)驗(yàn)第3天，模型組和卷柏組的血尿酸含量顯著升高，表明高尿酸血癥模型成功建立；在第14天，即經(jīng)過(guò)10天的卷柏給藥，卷柏組的血尿酸含量相對(duì)模型組降低，表明卷柏具有降低高尿酸血癥大鼠血尿酸的作用。通常，血清肌酐含量可作為衡量腎臟功能的指標(biāo)，在第14天，模型組血清肌酐含量與健康組相比升高，表明模型組大鼠的腎臟功能受損，而卷柏組大鼠的血清肌酐含量相對(duì)模型組降低，說(shuō)明卷柏具有保護(hù)腎臟的作用。

2.2尿液代謝物譜分析和潛在生物標(biāo)記物鑒定

采用UPLC-ESI-QTOF/MS法進(jìn)行尿液樣品的分離和數(shù)據(jù)采集，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA和OPLS-DA分析，PCA在正離子模式和負(fù)離子模式下的得分圖示于圖1?？梢钥闯?，健康對(duì)照組、模型組和卷柏組能完全分開(kāi)，表明這3組大鼠的尿液代謝物譜發(fā)生了明顯變化。為了更好的區(qū)分并找到影響分組的代謝物，采用OPLS-DA法研究模型組和卷柏組大鼠的代謝物譜差異。

表1　血清尿酸和血清肌酐的濃度(平均值±SD,n=6)

注：*表示與模型組相比P<0.01；**表示與模型組相比P<0.05

圖1　健康對(duì)照組、模型組和卷柏組在正離子模式(a)和負(fù)離子模式(b)下的PCA得分圖Fig.1　PCA score plots of HCG, MG and STG in positive ion mode (a) and negative ion mode (b)

OPLS-DA在正離子模式和負(fù)離子模式下的得分圖分別示于圖2，可以看出，模型組和卷柏組有明顯區(qū)別，經(jīng)卷柏給藥后大鼠的代謝狀況發(fā)生了明顯改變。模型組和卷柏組在正離子模式和負(fù)離子模式下的S-plot示于圖3，每個(gè)點(diǎn)表示1個(gè)化合物，離原點(diǎn)距離越遠(yuǎn)表示這個(gè)化合物對(duì)模型組和卷柏組大鼠分組的貢獻(xiàn)越大。選擇VIP值大于1的代謝物為潛在生物標(biāo)記物，共找出了對(duì)模型組和卷柏組分類貢獻(xiàn)較大的9個(gè)化合物，即卷柏治療高尿酸血癥大鼠的潛在生物標(biāo)記物。根據(jù)質(zhì)荷比和串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并與標(biāo)準(zhǔn)品和數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，鑒定出9個(gè)潛在生物標(biāo)志物，結(jié)果列于表2。以負(fù)譜m/z212.002 7代謝物為例說(shuō)明鑒定過(guò)程：首先，準(zhǔn)分子離子峰的質(zhì)荷比為212.002 7，經(jīng)計(jì)算其化學(xué)式為C8H7NO4S，此代謝物初步鑒定為硫酸吲哚酚；由串聯(lián)質(zhì)譜圖可知，此代謝物有2個(gè)碎片離子m/z132.05和m/z79.96，經(jīng)計(jì)算，這2個(gè)碎片離子分別為[M—H—SO3]-和[SO3]-；綜上，鑒定此代謝物為硫酸吲哚酚。

圖2　模型組和卷柏組在正離子模式(a)和負(fù)離子模式(b)下的OPLS-DA得分圖Fig.2　OPLS-DA score plots of MG and STG in positive ion mode (a) and negative ion mode (b)

Fig.3　模型組和卷柏組在正離子模式(a)和負(fù)離子模式(b)下的S-plotFig.3　S-plots of OPLS-DA for MG and STG in positive ion mode (a) and negative ion mode (b)

模式VIP值化合物分子式測(cè)定質(zhì)荷比m/z理論質(zhì)荷比m/z誤差/10-6串聯(lián)質(zhì)譜變化趨勢(shì)*變化趨勢(shì)**變化倍數(shù)*變化倍數(shù)**正離子1.34肌酐C4H7N3O114.0663114.0662+0.8844.10上調(diào)下調(diào)2.061.942.52黃尿酸C10H7NO4206.0443206.0448-2.43160.04上調(diào)下調(diào)1.741.842.04馬尿酸C9H9NO3180.0658180.0655+1.67105.05,上調(diào)下調(diào)1.791.6777.022.21犬尿酸C10H7NO3190.0500190.0499+0.53144.05,上調(diào)下調(diào)1.931.71116.061.16尿囊素C4H6N4O3159.0511159.0513-1.2661.04,上調(diào)下調(diào)2.482.0399.03負(fù)離子5.17硫酸吲C8H7NO4S212.0027212.0023-1.89132.05,上調(diào)下調(diào)4.942.69哚酚79.962.27檸檬酸C6H8O7191.0200191.0197+1.57111.01下調(diào)上調(diào)1.511.285.57尿酸C5H4N4O3167.0214167.0211+1.80124.02,上調(diào)下調(diào)3.011.8996.02,69.011.12富馬酸C4H4O4115.0036115.0037-0.8771.10下調(diào)上調(diào)1.471.68

注：*為模型組vs健康對(duì)照組，P<0.05；**為卷柏組vs模型組，P<0.05

2.3卷柏治療高尿酸血癥大鼠作用機(jī)制分析

實(shí)驗(yàn)表明，卷柏給藥組大鼠尿液中的尿酸含量明顯降低，說(shuō)明卷柏有降低尿酸的作用。尿酸是人類嘌呤代謝的終產(chǎn)物，但大鼠體內(nèi)存在將尿酸氧化為尿囊素的尿酸酶。本研究采用氧嗪酸鉀抑制尿酸酶活性來(lái)造模，但是尿酸能夠通過(guò)非酶途徑被氧化為尿囊素，因此尿囊素含量的變化也代表了尿酸含量的變化。

黃尿酸、犬尿酸以及硫酸吲哚酚是色氨酸代謝通路的重要代謝物。已有研究[15-16]表明，在腎功能不全的大鼠體內(nèi)，黃尿酸和犬尿酸的含量會(huì)升高。硫酸吲哚酚是吲哚酚的二相代謝產(chǎn)物，其在慢性腎病大鼠血清中明顯升高[17]。在本研究中，黃尿酸、犬尿酸以及硫酸吲哚酚在模型組中含量升高，除此以外，與腎損傷有關(guān)的標(biāo)記物，包括精氨酸和脯氨酸代謝通路的肌酐和苯丙氨酸代謝通路的馬尿酸也都在模型組中上調(diào)。這些代謝物含量的變化都表明，模型組大鼠具有腎臟損傷。在卷柏組，這些與腎臟功能相關(guān)的代謝物含量都下調(diào)，表明卷柏能夠起到保護(hù)腎臟的作用。

富馬酸和檸檬酸是三羧酸循環(huán)的重要中間物。三羧酸循環(huán)是能量代謝的重要組成部分，是能量物質(zhì)(如糖、脂肪酸和氨基酸)氧化的途徑。在模型組中，富馬酸和檸檬酸含量降低，說(shuō)明高尿酸血癥大鼠體內(nèi)能量代謝異常；在卷柏組中，富馬酸和檸檬酸含量相比模型組均有上調(diào)，表明卷柏能夠調(diào)節(jié)高尿酸血癥大鼠的能量代謝。

3　結(jié)論

本研究采用基于UPLC-ESI-QTOF/MS的代謝組學(xué)方法研究了卷柏治療高尿酸血癥大鼠的尿液代謝譜變化，并檢測(cè)了大鼠的血清生化指標(biāo)。結(jié)果表明，卷柏調(diào)節(jié)了高尿酸血癥大鼠的9個(gè)代謝物，包括尿酸、尿囊素、黃尿酸、犬尿酸、硫酸吲哚酚、馬尿酸、肌酐、富馬酸和檸檬酸，這些潛在生物標(biāo)志物的變化趨勢(shì)反映了卷柏在嘌呤代謝、色氨酸代謝、三羧酸循環(huán)、精氨酸和脯氨酸代謝以及苯丙氨酸代謝的調(diào)節(jié)作用。

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Metabonomics Study ofSelaginellatamariscinafor Hyperuricemia in Rats Using UPLC-ESI-QTOF/MS

XU Chen1, CHEN Wei-jia2, YU Jiang-hong3, LIU Shu1, LIU Zhi-qiang1, SONG Feng-rui1

(1.ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022,China;2.SchoolofPharmaceuticalScience,JilinUniversity,Changchun130021,China;3.JilinNortheastAsiaPharmaceuticalCo.,Ltd.,Changchun133700,China)

A urinary metabonomics method based on ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization quadruple time-of-flight/mass spectrometry (UPLC-ESI-QTOF/MS) was developed to study the effects ofSelaginellatamariscinaon hyperuricemic rats. Principal components analysis (PCA) and orthogonal partial least-squares discriminant analysis (OPLS-DA) were applied to analyze the metabolites in healthy control group (HCG), model group (MG) andSelaginellatamariscina-treated group (STG). The results show that significant differences in urinary metabolic profiles are observed from HCG, MG and STG by using PCA and OPLS-DA. And nine potential biomarkers including uric acid, allantoin, xanthurenic acid, kynurenic acid, indoxyl sulfate, hippuric acid, creatinine, fumaric acid and citric acid are found. Pathways of purine metabolism, tryptophan metabolism, tricarboxylic acid cycle, arginine and proline metabolism and phenylalanine metabolism are in response to the therapeutic effects ofSelaginellatamariscina. Besides, the serum biochemical analysis demonstrated thatSelaginellatamariscinacan not only reduce the amount of uric acid but also protect the kidney of hyperuricemic rat.

metabonomics;Selaginellatamariscina; hyperuricemia; LC/MS

2015-09-28;

2015-11-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21175128，81303280)資助

徐晨(1988—)，女(漢族)，河南焦作人，博士研究生，藥物分析專業(yè)。E-mail: xuchen214@126.com

劉舒(1985—)，女(漢族)，山東菏澤人，副研究員，從事質(zhì)譜分析研究。E-mail: mslab20@ciac.ac.cn

O657.63

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1004-2997(2016)05-0440-06

10.7538/zpxb.youxian.2016.0018

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-03-28；網(wǎng)絡(luò)出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160328.1443.020.html