應(yīng) 娟， 程青云， 袁必鋒*， 馮鈺锜

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

圖1 三種抗抑郁藥的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of the antidepressants

抑郁癥是一種常見(jiàn)的、威脅人們生命安全的慢性疾病，而大約有15%的抑郁癥患者自殺身亡[1]。西酞普蘭(Citalopram)、氟西汀(Fluoxetine)、舍曲林(Sertraline)屬于抗抑郁藥中選擇性5羥色胺再吸收抑制劑(SSRIs)類(lèi)藥物，是第二代抗抑郁藥[2]，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。相對(duì)于第一代單胺氧化酶抑制劑類(lèi)(MAOIs)以及三環(huán)類(lèi)(TCAs)抗抑郁藥，SSRIs有較小的抗膽堿性和副作用，因此廣泛用于臨床上抑郁癥的治療[3]。為了能夠準(zhǔn)確、合理用藥以提高藥效，降低副作用，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，需對(duì)患者進(jìn)行血藥濃度的監(jiān)測(cè)，以利于臨床對(duì)癥治療[4]。因此，對(duì)抗抑郁藥進(jìn)行快速提取及分析檢測(cè)十分重要。

在抗抑郁藥的檢測(cè)過(guò)程中，為排除基質(zhì)的干擾和提高檢測(cè)方法的靈敏度，固相萃取(SPE)[5]、液液萃取(LLE)[6]、固相微萃取(SPME)[7]等方法都被應(yīng)用于血清樣品的預(yù)處理中。固相微萃取可避免普通固相萃取技術(shù)中的繁瑣過(guò)柱操作、吸附柱易堵塞、重現(xiàn)性差等問(wèn)題，且具有操作簡(jiǎn)單、萃取時(shí)間短、有機(jī)試劑用量少等優(yōu)點(diǎn)，受到眾多關(guān)注[8 - 10]。其中磁固相萃取(MSPE)[11 - 14]的磁性萃取介質(zhì)可直接分散于樣品溶液中，尤其適用于含固體懸浮的樣品以及生物樣品。

西酞普蘭、氟西汀和舍曲林同為胺類(lèi)化合物，分子中都含有兩個(gè)苯環(huán)和氨基基團(tuán)，具有一定的疏水性和離子性，疏水功能基團(tuán)C8及離子基團(tuán)-SO3H改性的Fe3O4/SiO2有望對(duì)其進(jìn)行富集。本研究將MSPE引入血清樣品的預(yù)處理中，結(jié)合高效液相色譜-紫外檢測(cè)(HPLC-UV)測(cè)定血液中這3種抗抑郁藥，方法的選擇性高、重現(xiàn)性好，可以有效地對(duì)血清樣品中的抗抑郁藥物進(jìn)行定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

三種目標(biāo)物儲(chǔ)備液濃度為1 mg/mL，以甲醇逐級(jí)稀釋目標(biāo)物儲(chǔ)備液，配制不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液(15、20、50、100、200、400、800和1 000 ng/mL)，于4 ℃避光保存。

鹽酸氟西汀(純度≥98%)、鹽酸舍曲林(純度≥99.90%)(百靈威化學(xué)技術(shù)公司)，草酸西酞普蘭(純度≥98%)(美國(guó)Aladdin公司)；乙腈(ACN)、乙醇、甲苯、三乙胺、乙二醇、乙二胺、無(wú)水NaAc、NaH2PO4、H2SO4、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、正硅酸四乙酯、FeCl3·6H2O、NH3·H2O、30%H2O2、NaOH(分析純，上海國(guó)藥基團(tuán)試劑有限公司)；正辛基三乙氧基硅烷(OTS，純度≥97%，湖北武大有機(jī)硅新材料股份有限公司)、3-巰丙基三乙氧基硅烷(MPS，純度≥95%，湖北德邦化工新材料有限公司)；超純水(Millipore公司，美國(guó))。

空白血清樣品來(lái)自無(wú)藥史的健康志愿者(武漢大學(xué)校醫(yī)院)血樣，置于-80 ℃保存。

1.2 磁性材料(Fe3O4/SiO2/C8-SO3H)的制備

包硅磁性材料(Fe3O4/SiO2)的制備參考文獻(xiàn)方法[11]。辛基磺酸基共同改性的磁性材料(Fe3O4/SiO2/C8-SO3H)的制備參考文獻(xiàn)方法[15]并進(jìn)行改進(jìn)。取Fe3O4/SiO22.07 g，NaOH 0.17 g，CTAB 0.53 g 及H2O 31.4 mL，置于聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，于溫度130 ℃反應(yīng)24 h，冷卻后經(jīng)水和乙醇交替清洗數(shù)次，60 ℃真空干燥后，放于馬弗爐中550 ℃煅燒7 h。取煅燒后的磁性顆粒1.97 g，無(wú)水甲苯140 mL，OTS 1.00 g，MPS 0.87 g，三乙胺30 μL，置于聚四氟乙烯反應(yīng)釜中。于130 ℃反應(yīng)20 h，清洗后放于真空干燥箱中干燥。將干燥后的磁顆粒置于250 mL燒瓶中，加入30%H2O2191 mL，甲醇57 mL，3滴濃H2SO4，機(jī)械攪拌，30 ℃反應(yīng)16 h，產(chǎn)物用水與甲醇清洗，真空干燥，待用。

1.3 血清樣品制備

移取300 μL血清樣品，加入西酞普蘭、氟西汀和舍曲林標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用50 mmol/L NaH2PO4(pH=6.0)稀釋至3 mL。準(zhǔn)確稱取35 mg磁性材料于15 mL安普瓶中，分別用2 mL乙醇、2 mL 50 mmol/L NaH2PO4溶液(pH=6.0)活化，然后加入上述3 mL加標(biāo)溶液，渦旋萃取1 min后，在外磁場(chǎng)作用下分離棄去上清液。再用2 mL 水∶甲醇∶甲酸(95∶5∶0.5，V/V/V)混合溶液清洗3次，再用3 mL 5 mmol/L甲醇-氨水(90∶10，V/V)渦旋解吸1 min，解吸液在氮?dú)庀麓蹈?，?00 μL流動(dòng)相重新溶解，取20 μL進(jìn)行液相色譜-紫外檢測(cè)。

1.4 儀器與色譜條件

LC-20A高效液相色譜(日本，島津公司)，配二元LC-20AD泵，DGU-20A3脫氣機(jī)，SIL20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20A柱溫箱，SPD-20A紫外檢測(cè)器；WELTECH C18色譜柱(150×4.6 mm i.d.,5 μm)，柱溫35 ℃；流動(dòng)相為乙腈-10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=3.5)(40∶60，V/V)，流速1 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1基質(zhì)的pH值抗抑郁藥為堿性胺類(lèi)化合物，溶液pH值會(huì)影響分析物的存在狀態(tài)，并進(jìn)一步影響萃取效果。配制pH值分別為3～9的緩沖溶液，考察pH值對(duì)萃取效果的影響。由圖2A可知，在pH為3～6的條件下，萃取效果相差不大。pH>6時(shí)，萃取效率逐漸下降。這是由于西酞普蘭、氟西汀和舍曲林的pKa分別為9.59、10.05和9.47，吸附材料與目標(biāo)物之間既有疏水作用，又有離子交換作用，當(dāng)pH>6時(shí)，目標(biāo)物逐漸以分子形式存在，離子交換作用逐漸減弱，萃取效率下降。本研究選擇基質(zhì)pH值為6。

2.1.2緩沖溶液的濃度配制了不同濃度的NaH2PO4緩沖液(5、10、20、50、100和200 mmol/L)，考察緩沖液濃度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2B。鹽濃度的增加降低了抗抑郁藥與萃取材料的離子交換作用，從而使萃取效率增加。實(shí)驗(yàn)選取緩沖液的濃度為50 mmol/L。

2.1.3材料用量和解吸體積考察了萃取材料用量為15、25、35、45和55 mg時(shí)的萃取效果，如圖2C。由圖可見(jiàn)，萃取材料適宜用量選取35 mg。考察了解吸體積為1、2、3、4和5 mL時(shí)的萃取效果，如圖2D。當(dāng)萃取體積增加時(shí)，萃取效率稍有增加，為保證實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性，同時(shí)減少氮?dú)獯蹈傻臅r(shí)間，本研究中解吸體積選取3 mL。

2.1.4萃取時(shí)間和解吸時(shí)間考察了萃取時(shí)間分別為1、2、3、4和5 min的萃取效果，如圖2E。結(jié)果表明，萃取時(shí)間對(duì)萃取效果無(wú)顯著影響，在1 min時(shí)已達(dá)平衡。本研究選取1 min作為萃取時(shí)間?？疾炝私馕鼤r(shí)間為1、2、3、4和5 min時(shí)的萃取效果，見(jiàn)圖2F。結(jié)果表明，解吸時(shí)間對(duì)萃取效果同樣無(wú)顯著影響。本研究選取1 min作為解吸時(shí)間。

圖2 MSPE萃取條件的優(yōu)化：(A)磷酸緩沖鹽的pH；(B)磷酸緩沖鹽濃度；(C)材料的用量；(D)解吸液的體積；(E)萃取時(shí)間；(F)解吸時(shí)間Fig.2 Optimization of MSPE conditions:(A) matrix pH;(B) salt concentration;(C) amount of sorbent;(D) desorption volume;(E) extraction time;(F) desorption time

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1線性方程及檢出限以空白血清為基質(zhì)，分別配制15、20、50、100、200、400、800和1 000 ng/mL系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)條件下測(cè)定，以分析物峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在15～1 000 ng/mL濃度范圍內(nèi)，三種抗抑郁藥均呈良好的線性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 三種抗抑郁藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

2.2.2回收率和精密度為了考察方法的重現(xiàn)性，添加低、中、高3個(gè)濃度水平的待測(cè)物至上樣液中進(jìn)行萃取，對(duì)1 d內(nèi)獨(dú)立配制的樣品進(jìn)行5次測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以連續(xù)3 d獨(dú)立配制的樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，本方法具有較好的重現(xiàn)性。

表2 三中抗抑郁藥在三種濃度水平下的加標(biāo)回收率及日內(nèi)、日間精密度

圖3 加標(biāo) (a)和空白(b)血清樣品色譜圖Fig.3 Chromatograms of serum sample spiked with three antidepressants at 400 ng/mL (a) and blank serum sample (b)1.Cltalopram;2.Sertraline;3.Fluoxetine.

a:Values are mean ±SD of five experiments.

2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

在最優(yōu)條件下，按1.3所述方法分別對(duì)空白血清以及加標(biāo)的空白血清進(jìn)行提取測(cè)定，色譜圖如圖3所示。由圖可以看出在三種分析物保留時(shí)間處無(wú)其他干擾峰，除雜效果良好。

2.4 與其它文獻(xiàn)方法的比較

將本文建立的方法與文獻(xiàn)已報(bào)道的西酞普蘭、舍曲林和氟西汀的萃取檢測(cè)方法進(jìn)行了比較，結(jié)果見(jiàn)表3。由表可知，本方法的線性范圍更寬，并且檢出限(LOD)值明顯低于SPE-LC-UV和LLE-HPLC-UV，略高于MSPE-LC-UV。本方法有著十分顯著的優(yōu)勢(shì)。

表3 所建方法與已報(bào)道的西酞普蘭，氟西汀和舍曲林萃取檢測(cè)方法的比較

3 結(jié)論

本文將疏水功能基團(tuán)C8及離子基團(tuán)-SO3H改性的Fe3O4/SiO2材料引進(jìn)樣品預(yù)處理技術(shù)中用于血清中抗抑郁藥的萃取富集，通過(guò)優(yōu)化樣品預(yù)處理以及結(jié)合HPLC測(cè)定方法，建立了簡(jiǎn)便、快速、有效地測(cè)定血清中抗抑郁藥的分析方法。