陳海玲， 謝維平

(1.泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，福建泉州 362100；2.泉州市疾病預(yù)防控制中心，福建泉州 362018)

萊克多巴胺(Ractopamine)作為主要的β2-受體激動劑，它能夠改善動物養(yǎng)分的代謝途徑，提高胴體瘦肉率[1]。由于其易在動物肝臟中積聚殘留，并可通過食物鏈進(jìn)入人體，人食用后可能出現(xiàn)心跳加快、震顫、心悸等癥狀，嚴(yán)重危害人類健康。因此，研究苯克多巴胺的分析方法十分重要。目前，動物源性食品中瘦肉精檢測方法很多，主要有國家標(biāo)準(zhǔn)方法[2]、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法[3]和文獻(xiàn)報道方法[4]等。這些方法均采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，能準(zhǔn)確測定目標(biāo)物，但樣品的前處理步驟過于復(fù)雜，使得檢驗效率低，不能實(shí)現(xiàn)對動物源性食品的快速監(jiān)測。

β2-受體激動劑易在動物肝臟中積聚殘留，所以本方法主要對豬肝樣品中萊克多巴胺殘留檢驗的前處理步驟進(jìn)行簡化，以提高檢測效率，建立的方法可達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，Agilent公司)，配有電噴霧離子源，AB SciEX API 4000+；DC-12氮吹儀(上海安譜)；GL-20G -Ⅱ高速冷凍離心機(jī)(上海安亭)；A-1000S固相萃取裝置(日本，EYELA)；MCX固相萃取柱(60 mg/3mL，德國CNW)。

鹽酸萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確移取1.00 mL的鹽酸萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研環(huán)境監(jiān)測所)，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。氨化甲醇溶液：移取10.0 mL氨水于250 mL容量瓶中，用甲醇定容，混合均勻。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。實(shí)驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器工作條件

液相色譜條件：色譜柱為Waters ATLANTICS C18柱(150×2.1 mm i.d.，5 μm)；流動相A為0.1%甲酸/水，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1.0 min 95%A;1.0～5.0 min,95%～55%A;5.0～5.2 min,55%～95%A;5.2～10.0 min,95%A。流動相流速為0.3 mL/min；柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。噴霧電壓(IS)5 500 V，輔助氣溫度(TEM)600 ℃，進(jìn)樣錐孔盤加熱器(ihe)設(shè)置為on，霧化氣(GS)壓力為50 kPa，輔助氣(GS)壓力為50 kPa，氣簾氣(CUR)壓力為35 kPa，碰撞室(CAD)氣體壓力為6 kPa。Ract的MRM離子對及質(zhì)譜條件見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測離子對及質(zhì)譜條件

1.3 樣品提取及凈化

將洗凈、除去表面水分并剔除組織等雜質(zhì)的豬肝樣品切小塊，準(zhǔn)確稱取100.00 g于料理杯中，或加入100 μL 10 μg/mL萊克多巴胺溶液充分?jǐn)囁椋频秘i肝樣品或萊克多巴胺含量為10 μg/kg的加標(biāo)樣品。準(zhǔn)確稱取2.00 g已制備好的豬肝樣品或加標(biāo)樣品于50 mL離心管中，加入20 mL 0.1 mol/L HCl，漩渦5 min，充分混勻，超聲提取10 min后，加入200 μL HClO4(70%～72%)，漩渦混合均勻，4 ℃、8 000 r/min離心10 min。將上清液倒入另一50 mL離心管中，加入10 mL正己烷，在振蕩器上振蕩10 min，4 ℃、8 000 r/min離心10 min。棄去正己烷和乳化層，取下層液體10.00 mL于活化好的MCX交換柱上[1]，控制流速約1 d/10s。然后依次用水3.0 mL和甲醇-水(1+1)溶液3.0 mL淋洗柱子。淋洗完全后，抽真空3 min。以3.0 mL氨化甲醇溶液洗脫，溫度40 ℃水浴下用氮?dú)獯抵两?，殘渣用甲醇定容?.00 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，在儀器工作條件下測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 高氯酸的作用

肉制品的主要成分是蛋白質(zhì)和脂肪，在樣品提取和純化過程中除去主要干擾成分蛋白質(zhì)和脂肪至關(guān)重要[5]。而采用陽離子交換固相萃取柱檢測β2-受體激動劑時，必須調(diào)節(jié)樣品的pH值以達(dá)到被測物在水相或有機(jī)相分配的目的，但存在被測物被吸附等缺點(diǎn)[6]。本實(shí)驗在酸解的同時加入少量HClO4，一方面可以沉淀蛋白質(zhì)，另外可以水解一部分脂肪，同時使測定的目標(biāo)物在酸性條件下離子化，增大溶出率和提取效率，而不需要特意調(diào)節(jié)pH值，簡化了操作步驟。

2.2 酸解與酶解的對比

β2-受體激動劑在動物體內(nèi)代謝過程中會在葡萄糖醛苷、硫酸酯蛋白等作用下發(fā)生各種軛合反應(yīng)，生成的軛合物將長期存在[7,8]，必須破壞這種結(jié)構(gòu)使之游離出來才能進(jìn)行測定。國家標(biāo)準(zhǔn)方法[2]及文獻(xiàn)報道的方法[7 - 9]中動物源性食品常用酶解法，即用β-鹽酸葡萄糖醛甙酶-芳基硫酯酶，本文采用HCl酸解，實(shí)驗將兩種方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，兩種方法回收率相差不大，均能符合分析方法的要求。但酶解法成本昂貴且前處理步驟過于復(fù)雜，檢驗效率低，增加了大量肉制品檢驗和風(fēng)險監(jiān)控的難度。不能及時反映豬肉質(zhì)量或市場情況。

2.3 豬肝樣品對萊克多巴胺吸附時間對吸附率的影響

實(shí)驗考察陰性豬肝樣品對萊克多巴胺吸附時間對提取效率的影響。按上述方法制備加標(biāo)樣品后，實(shí)驗考察了吸附時間為0、1、2、12、24、36 h后，酸的提取效率，結(jié)果表明，不同吸附時間下，平均回收率在75%～80%。這說明吸附時間對回收率的影響并不大，HCl均能夠有效提取豬肝樣品中的萊克多巴胺。所以，后續(xù)實(shí)驗選擇吸附時間為0 h，即豬肝樣品加標(biāo)后馬上用酸提取。

2.4 酸的種類對提取效果的影響

按上述方法，實(shí)驗考察了濃度均為0.1 mol/L的HCl、H2SO4、HNO3、H3PO4、HClO4和三氯乙酸對提取效果的影響。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，對于萊克多巴胺含量為10 μg/kg的豬肝樣品，H3PO4和三氯乙酸提取的回收率相對較低，分別是56.7%和53.5%，且用三氯乙酸提取后樣品雜質(zhì)峰相對較多。用HCl、H2SO4、HNO3、HClO4提取效果相近，回收率分別為77.6%、75.4%、74.6%和76.0%。用HCl和HNO3提取時，加入200 μL HClO4溶液(70%～72%)后，可沉淀豬肝樣品中的蛋白質(zhì)，使樣品初步凈化。實(shí)驗選擇HCl用來提取豬肝中的萊克多巴胺。

2.5 酸的濃度、提取時間等因素對提取效果的影響

對萊克多巴胺含量為10 μg/kg的加標(biāo)樣品，實(shí)驗采用正交試驗L16(45)對酸的濃度、提取時間、提取溫度和HClO4用量進(jìn)行考察，每個樣品號平行測定3次。正交試驗表見表2。

表2 L16(45)正交設(shè)計試驗表

實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HCl濃度≥0.2 mol/L，HClO4體積≥100 μL時，方法的回收率在80%～110%之間，符合食品分析方法的要求。為了使提取方法簡便易行，提取溶液澄清易過柱，盡可能使方法回收率高，選擇HCl濃度為0.2 mol/L、提取時間為40 min、提取溫度為25 ℃、高氯酸用量為200 μL為最佳提取方法。

2.6 精密度實(shí)驗

取未檢出目標(biāo)物的豬肝空白樣品，加標(biāo)制備萊克多巴胺濃度為10.0 μg/kg的加標(biāo)樣品。按正交試驗所篩選的最佳條件進(jìn)行處理，平行處理6份進(jìn)行測定，測得日內(nèi)精密度為3.13%。連續(xù)處理3 d，每天平行處理6份，日間精密度為3.86%。

2.7 加標(biāo)實(shí)驗

在未檢出目標(biāo)物的豬肝空白樣品中，分別添加一定體積的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使添加濃度分別為0.50、5.00和10.0 μg/kg。按正交試驗所篩選的最佳條件進(jìn)行處理，平行測定6次，計算回收率，結(jié)果分別為82.0%、88.0%和102.0%，本方法可以滿足不同濃度水平萊克多巴胺的檢測要求。

3 結(jié)論

研究了HCl結(jié)合HClO4直接提取豬肝樣品中的萊克多巴胺，方法操作簡單，靈敏度高，回收率高，分析成本低，滿足國家及行業(yè)對動物源性食品的萊克多巴胺進(jìn)行快速提取，有望推廣至動物源性食品中多種β2-受體激動劑的提取。