張 林， 湯 勻， 肖榮榮， 劉渝寧， 謝 敏， 黃衛(wèi)華*

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

細(xì)胞在體內(nèi)處于非常復(fù)雜的胞外基質(zhì)環(huán)境中。胞外基質(zhì)主要包含物理因素如基質(zhì)硬度、微納級(jí)形貌等，以及化學(xué)因素如多種因子及其濃度等[1]，這些因素通過在時(shí)間及空間上形成梯度，影響細(xì)胞粘附、分化、遷移和生長(zhǎng)等行為[2]。作為神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，神經(jīng)元對(duì)這些梯度極其敏感，在神經(jīng)元極化過程中，生長(zhǎng)錐末端偽足(尺寸100～300 nm)[3]能感應(yīng)納米級(jí)梯度而定向延伸，形成軸突并不斷生長(zhǎng)[4]。此外，物理和化學(xué)梯度在引導(dǎo)軸突向靶細(xì)胞延伸[5]以及促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[6]方面也扮演著重要角色。因此，研究軸突對(duì)物理和化學(xué)梯度的響應(yīng)規(guī)律具有重要意義。

已有文獻(xiàn)報(bào)道體外構(gòu)建微環(huán)境研究神經(jīng)元對(duì)物理或化學(xué)因素的響應(yīng)。為了提供接近體內(nèi)粗糙度的微環(huán)境，可采用納米材料形成納米結(jié)構(gòu)基底，研究神經(jīng)細(xì)胞響應(yīng)。結(jié)果表明，納米金顆粒[7]、二氧化硅納米顆粒[8]、碳納米管[9]以及特殊設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)[10]有利于神經(jīng)元的生長(zhǎng)和導(dǎo)向。為了探究神經(jīng)元對(duì)梯度納米結(jié)構(gòu)的響應(yīng)，Li等[11]建立了一種基于微米粒子的粗糙度梯度，并發(fā)現(xiàn)了最適合背根神經(jīng)節(jié)(DRGs)細(xì)胞生長(zhǎng)的粗糙度。對(duì)于化學(xué)因素，隨著微納加工與制造技術(shù)的發(fā)展，基于分子擴(kuò)散[12]、吸附[13,14]和化學(xué)反應(yīng)[15,16]等，各種因子可在二維或三維環(huán)境下形成分子梯度，精確調(diào)控軸突分化和生長(zhǎng)等行為。最近有文獻(xiàn)報(bào)道在同一基底表面依次或同時(shí)形成物理-化學(xué)雙重梯度，研究其對(duì)神經(jīng)元行為的協(xié)同作用。如Gomez等[17]將神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)化學(xué)鍵合到微米級(jí)的圖案基底上，結(jié)果表明與未修飾及無圖案的基底相比，神經(jīng)元分化率更高，軸突更長(zhǎng)。Dinis等[18]采用靜電紡絲技術(shù)，建立了一種纖維密度和NGF的同向雙重梯度，發(fā)現(xiàn)DRGs軸突沿著纖維密度和NGF濃度增加的方向生長(zhǎng)。但是基于納米顆粒密度的物理或物理-化學(xué)雙重梯度定量研究神經(jīng)元行為的報(bào)道甚少。

本文建立了基于納米金密度梯度和納米金-化學(xué)因子雙重梯度的模型，并定量研究了其對(duì)神經(jīng)元軸突導(dǎo)向和生長(zhǎng)的影響。細(xì)胞結(jié)果表明，軸突更傾向沿著納米金密度增加的方向生長(zhǎng)，且當(dāng)納米金密度梯度和化學(xué)梯度結(jié)合后，這種趨勢(shì)更為明顯。本文建立的納米金密度梯度及納米金-化學(xué)因子雙重梯度模型可用于軸突響應(yīng)定量化研究，為神經(jīng)發(fā)育和修復(fù)研究提供了更多可能和選擇。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

聚賴氨酸(PLL)和層粘連蛋白(Laminin)購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))，IKVAV片段(CSRARKQAASIK-VAVSADR)和FITC-IKVAV(FITC標(biāo)記的IKVAV)購(gòu)自中肽公司(常州)，重組人肝配蛋白A5嵌合體購(gòu)自R &D Systems(美國(guó))。用于細(xì)胞培養(yǎng)的DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司(美國(guó))，L-谷氨酰胺購(gòu)自Ameresco公司(美國(guó))，用于細(xì)胞活性染色的鈣黃綠素(calcein-AM)和碘化丙啶(PI)購(gòu)自Dojindo Laboratory(美國(guó))。玻璃基底購(gòu)自百斯特公司(常州)。其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 納米金溶液的合成

納米金溶液根據(jù)之前Frens報(bào)道的經(jīng)典方法[19]合成。首先將50 mL 2.5 mmol·L-1氯金酸溶液加入到干凈的100 mL圓底燒瓶中，置于油浴鍋中攪拌加熱至120 ℃，沸騰后，向其中加入0.75 mL 1%(wt%)的檸檬酸鈉溶液，幾分鐘內(nèi)顏色發(fā)生明顯變化，最后穩(wěn)定為酒紅色。然后在溫度120 ℃下持續(xù)攪拌25 min左右，最后關(guān)閉油浴，停止反應(yīng)，溶液自然冷卻，備用。

1.3 玻璃基底上納米金組裝和密度梯度形成

所用玻片基底(0.5 cm×0.5 cm)依次用丙酮、無水乙醇和超純水超聲清洗30 min后，氧等離子體(清洗儀：Harrick Scientific,Ossining,NY，美國(guó))處理80 s后，立即將其浸泡到0.01%(wt%)的PLL溶液中3 h。將包覆有PLL的玻璃基底固定，豎直懸空，伸至裝有2 mL納米金溶液的玻璃稱量瓶(25 mm×40 mm o.d.)液面下1 mm位置，然后采用微注射泵(保定蘭格恒流泵有限公司)注入方式[20]，將1.5 mL超純水以375 μL·h-1的速度注入到稱量瓶中。4 h后液面上升大約1 mm，因此，在玻璃基底0.5 cm×1 mm區(qū)域內(nèi)(圖1a)便形成了納米金密度梯度。組裝納米金的玻璃基底用超純水沖洗并用氮?dú)獯蹈?，備用?/p>

1.4 化學(xué)因子梯度形成

物理-化學(xué)雙重梯度形成方式與上述納米金密度梯度類似(圖1b)。首先將組裝有納米金密度梯度(梯度范圍：0.5 cm×1 mm)的玻片豎直置于離心管中，管中預(yù)先加入55 μL IKVAV蛋白(50 μg·mL-1)或ephrin-A5(40 μg·mL-1)溶液，使玻璃底端剛好位于液面以下1 mm位置。再借助微注射泵以5 μL·h-1的速度向其中注入55 μL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，使液面上升大約1 mm，從而在0.5 cm×1 mm的區(qū)域內(nèi)形成物理-化學(xué)同向的雙重梯度(圖1b-i)。此外，通過將組裝有物理梯度的玻璃基底預(yù)先旋轉(zhuǎn)90度置入離心管中，可在1 mm×1 mm范圍內(nèi)形成正交雙重梯度(圖1b-ii)。

圖1 基于納米金密度的物理梯度及物理-化學(xué)雙重梯度示意圖Fig.1 Schematic diagram of forming AuNPs based physical and physical-chemical dual gradients(a) Formation of the AuNPs density gradient on PLL precoated glass via a syringe pump.(b) Formation of the factor gradients on AuNPs density gradient to generate:(i) homodromously dual gradient,(ii) perpendicularly dual gradient,purple and green arrows represent the direction of the AuNPs density(physical) and the factor(chemical) gradients,respectively.

1.5 海馬神經(jīng)元分離與培養(yǎng)

海馬神經(jīng)元按照Kaech報(bào)道的方法[21]分離和培養(yǎng)。將懷孕18 d左右的SD大鼠孕鼠(武漢大學(xué)中南醫(yī)院)解剖，取出胎鼠，從其大腦中將海馬組織解離，用0.125%(wt%)的胰酶于37 ℃消化8 min，隨后用含血清的培養(yǎng)基終止胰酶消化并采用新鮮培養(yǎng)基稀釋到所需細(xì)胞濃度。在神經(jīng)元種植前，組裝物理或物理-化學(xué)雙重梯度的玻璃基底于紫外燈下照射1 h滅菌。接著，將密度約為8.0×105cells·mL-1的細(xì)胞懸液種植在上述基底上，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)中15 min使其貼壁。然后，向已貼壁的細(xì)胞中補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F-12中添加100 U·mL-1的青霉素/鏈霉素，2%B27，3%谷氨酰胺，10 ng·mL-1NGF)，將其放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。

1.6 金納米顆粒和神經(jīng)元的電鏡表征

采用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM，德國(guó)ZEISS 公司)表征金納米顆粒和玻璃基底上神經(jīng)元形貌。在進(jìn)行納米顆粒成像前，納米金基底首先用氮?dú)獯蹈?，然后在真空環(huán)境下噴金30 s。對(duì)于神經(jīng)元成像，細(xì)胞首先用2.5%(wt%)的戊二醛于4 ℃固定30 min，然后采用一系列具有濃度梯度的乙醇依次脫水處理，自然干燥，最后于其表面真空濺射噴金50 s。

1.7 顯微成像和數(shù)據(jù)分析

使用Nano measurer 1.2.5軟件分析金納米顆粒粒徑，采用倒置熒光顯微鏡(AxioObserver Z1，德國(guó)ZEISS 公司)觀察化學(xué)因子梯度和海馬神經(jīng)元。ImageJ軟件用來分析分子梯度熒光強(qiáng)度，軸突的長(zhǎng)度通過ImageJ所帶插件Neuron J定量分析，只有具有明顯方向且長(zhǎng)度超過胞體兩倍以上的軸突才被統(tǒng)計(jì)。SPSS 19.0軟件用來進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析(one-way ANOVA)，誤差棒代表樣本的標(biāo)準(zhǔn)偏差(n≥3)。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米金密度梯度形成

首先合成了粒徑均一的納米金顆粒(荷負(fù)電，粒徑：29±3 nm)，并基于其和玻璃基底上荷正電的PLL之間的靜電作用[22]，將其組裝在玻璃基底上。通過調(diào)節(jié)組裝時(shí)間及納米金溶液的濃度形成納米金密度梯度。如圖1所示，向納米金溶液中低速注入超純水，液面緩慢上升，PLL包被的玻璃基底從下往上逐漸浸入納米金溶液中，且溶液濃度逐漸減小，便在玻璃基底上形成了納米金密度梯度。電鏡結(jié)果(圖2A、2B)表明，在1 mm距離內(nèi)形成了明顯的納米金密度梯度。經(jīng)計(jì)算物理梯度的分辨率(定義為單位距離內(nèi)每平方微米納米金顆粒個(gè)數(shù)差值)為151 μm-2·mm-1，該值比之前報(bào)道的結(jié)果[22]高10倍以上。這說明每50 μm 距離納米金密度的差值約為8 μm-2，該值能被長(zhǎng)達(dá)數(shù)十至數(shù)百微米的軸突很好地感應(yīng)到，從而有助于單根軸突對(duì)納米金密度梯度的響應(yīng)性研究。

2.2 物理-化學(xué)雙重梯度形成

類似于納米金密度梯度形成原理，通過調(diào)節(jié)化學(xué)因子的濃度和吸附時(shí)間，從而控制目標(biāo)分子在組裝有物理梯度的基底上吸附量不同(圖1b)。分別選用IKVAV(Laminin的活性片段[23]，能引導(dǎo)軸突極化和促進(jìn)神經(jīng)突修復(fù)[24,25])和ephrin-A5(對(duì)神經(jīng)元具有排斥效應(yīng)[26])兩種目標(biāo)分子，形成物理-化學(xué)雙重梯度。通過改變物理基底置入方向，可以形成不同角度組合的物理-化學(xué)雙重梯度，如同向(圖1b-i)和正交(圖1b-ii)的雙重梯度等。本文主要研究了同向雙重梯度，F(xiàn)ITC-IKVAV熒光照片和和熒光強(qiáng)度曲線分別如圖2C、2D所示。

圖2 物理和化學(xué)梯度的表征Fig.2 Characterization of physical and chemical gradients(A) SEM micrographs of three positions(a,c,e) and(B) AuNPs density statistics of five positions(a-e) on the AuNPs density gradient,a-e represent five positions in 1 mm width region with AuNPs density gradient,respectively,scale bar=1 μm.Fluorescent graph(C) and normalized fluorescence intensity profile(D) of a homodromously AuNPs density-FITC-IKVAV dual gradient,only fluorescent signal could be observed here,scale bar=100 μm.

2.3 海馬神經(jīng)元對(duì)納米金密度梯度的響應(yīng)

為了探究納米金顆粒的生物兼容性，將海馬神經(jīng)元培養(yǎng)在組裝有均勻納米金的基底上，培養(yǎng)2 d后，采用熒光探針Calcein-AM/PI表征細(xì)胞活力。結(jié)果表明，在均勻組裝的低密度(54±4 μm-2)和高密度(127±5 μm-2)納米金顆粒上，神經(jīng)元生長(zhǎng)和分化良好，95%以上的細(xì)胞都表現(xiàn)出良好的活力(圖3A)，說明30 nm粒徑的納米金顆粒具有良好的細(xì)胞相容性。另外，SEM結(jié)果顯示，高密度納米金上神經(jīng)元生長(zhǎng)錐末端比低密度上的具有更多偽足(圖3B、3C)，這說明高密度納米金更有利于神經(jīng)元分化和生長(zhǎng)。兩種納米金密度基底上細(xì)胞分化率和軸突長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，高密度基底上兩者均明顯高于低密度基底結(jié)果(圖3D、3E)。而當(dāng)納米金基底與化學(xué)因子Laminin結(jié)合后，兩種密度基底上分化率和軸突長(zhǎng)度均分別得到進(jìn)一步增加，但兩種密度之間仍表現(xiàn)出顯著性差異。

圖3 海馬神經(jīng)元的活性和實(shí)驗(yàn)可行性證明Fig.3 Viability of hippocampal neurons and feasibility of the experiment(A) A fluorescent image of calcein-AM stained neurons cultured on AuNPs substrate with a density of 128 μm-2,scale bar=100 μm.(B) A SEM micrograph of a neuron on an AuNPs substrate with a density of 128 μm-2,scale bar=10 μm.(C) The magnified SEM micrograph of(B),scale bar=1 μm.(D) Differentiation rates of neurons after 2 days cultured in low(52 μm-2) and high(128 μm-2) AuNPs density groups with or without laminin(LN) precoating,the statistical numbers of neurons were 523 and 654 for without and with LN groups,respectively.(E) Mean axonal length of the two groups,the statistical numbers of neurons were 177 and 238 for without and with LN groups,respectively.***p<0.001,**p<0.01,*p<0.05.

我們研究了海馬神經(jīng)元在納米金密度梯度基底上的響應(yīng)，將神經(jīng)元培養(yǎng)在納米金密度梯度基底上，培養(yǎng)2 d后觀察并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計(jì)時(shí)，將納米金密度梯度基底劃分為兩個(gè)區(qū)域(一個(gè)是平均密度較高區(qū)域，另一個(gè)是平均密度較低區(qū)域，兩者由圖4A中的虛線分隔)，以此比較兩區(qū)域內(nèi)軸突的平均長(zhǎng)度。圖4C結(jié)果表明，高密度區(qū)域內(nèi)軸突平均長(zhǎng)度(59.31±1.79 μm)明顯高于低密度區(qū)域(44.64±3.76 μm)，這與之前均勻密度基底上結(jié)果一致。我們進(jìn)一步分析了納米金密度梯度對(duì)軸突的導(dǎo)向作用，從細(xì)胞顯微圖片(圖4B)可知，軸突更傾向沿著納米金密度增加的方向(圖中紅色箭頭所示)生長(zhǎng)，表明軸突生長(zhǎng)錐能靈敏感應(yīng)納米顆粒密度差異。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，62.21%±4.00%(圖4D)的軸突朝向納米金密度增加的方向生長(zhǎng)(p≤0.001)，說明納米金密度梯度有利于軸突導(dǎo)向。這些結(jié)果表明在神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育過程中，神經(jīng)元的極化可由物理因素形成的梯度調(diào)控。

圖4 神經(jīng)元對(duì)納米金密度梯度的響應(yīng)Fig.4 Results of neurons responding to AuNPs density gradient(A) Definition of analyzed regions of axonal length(high and low density regions are divided by a dashed line) and axons growing direction(up and down the gradient).(B) A representative phase contrast image of neurons,red and white arrows represent axons growing up and down the gradient respectively,scale bar=50 μm.(C) Mean axonal length of neurons on high and low density regions divided as(A),the statistical number of neurons was 179.(D) Percentage of neurons whose axons grow up and down the gradient,the statistical number of neurons was 235.***p<0.001.

2.4 海馬神經(jīng)元對(duì)物理-化學(xué)雙重梯度的響應(yīng)

為了研究軸突對(duì)同向雙重梯度的響應(yīng)，分別使用吸引性因子IKVAV和排斥性因子ephrin-A5，在組裝有物理梯度的基底上形成物理-化學(xué)雙重梯度，研究神經(jīng)細(xì)胞軸突響應(yīng)。物理-吸引因子雙重梯度基底上細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，高密度納米金-高濃度IKVAV區(qū)域與低密度納米金-低濃度IKVAV區(qū)域相比，軸突平均長(zhǎng)度更長(zhǎng)(93.60±4.65 μmvs.73.21±5.64 μm，圖5B，統(tǒng)計(jì)的兩區(qū)域劃分和圖4A類似)，并且兩區(qū)域間的軸突平均長(zhǎng)度差值(20.39 μm)明顯超過單一物理梯度(14.67 μm)。另外，軸突導(dǎo)向數(shù)據(jù)也顯示，與單一物理梯度相比，更多的軸突朝向雙重梯度顆粒密度及因子濃度增加的方向(圖5A、5C)。這些結(jié)果表明作為一種吸引性因子，IKVAV濃度梯度與納米金密度梯度，協(xié)同促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和增強(qiáng)軸突導(dǎo)向作用。

在物理-抑制因子同向雙重梯度基底上，培養(yǎng)神經(jīng)元2 d后發(fā)現(xiàn)，高密度納米金-高濃度ephrin-A5區(qū)域與低密度納米金-低濃度ephrin-A5區(qū)域相比，兩者軸突平均長(zhǎng)度并無明顯差別(圖5E)，表明高密度納米金對(duì)軸突生長(zhǎng)的促進(jìn)作用被排斥性因子ephrin-A5抵消。與此同時(shí)，朝向和背向雙重梯度顆粒密度及因子濃度增加方向的軸突比例也無明顯差別(圖5D、5F)，這也表明排斥性因子梯度消除了納米金密度梯度對(duì)軸突的導(dǎo)向作用。

圖5 神經(jīng)元對(duì)物理-化學(xué)同向雙重梯度的響應(yīng)Fig.5 Results of neurons responding to the homodromously physical-chemical dual gradients(A,B,C) The group of physical-IKVAV homodromously dual gradient.(D,E,F) The group of physical-ephrin-A5 homodromously dual gradient.(A,D) Representative phase contrast images of neurons,red and white arrows in the pictures represent axons growing up and down the gradients respectively,scale bar=50 μm.(B,E) Mean axonal length of neurons on high and low density regions,the statistical numbers of neurons were 190 and 159,respectively.(C,F) Percentage of neurons whose axons grow up and down the gradients,the statistical numbers of neurons were 202 and 128,respectively.***p<0.001;n.s.,not significant.

以上結(jié)果表明，物理和化學(xué)梯度在影響軸突導(dǎo)向和生長(zhǎng)方面具有協(xié)同作用，這為體外或體內(nèi)調(diào)控軸突響應(yīng)提供了更多選擇。

3 結(jié)論

本文建立了高空間分辨的納米金密度梯度，隨后基于分子吸附形成了物理-化學(xué)雙重梯度，以此定量研究了神經(jīng)元軸突在這些梯度基底上的響應(yīng)規(guī)律。初步結(jié)果表明，粒徑約為30 nm的納米金顆粒有利于神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)，而且其密度梯度對(duì)軸突生長(zhǎng)具有很好的導(dǎo)向作用，在此基礎(chǔ)上結(jié)合化學(xué)因子梯度，進(jìn)一步協(xié)同調(diào)控軸突生長(zhǎng)和導(dǎo)向等發(fā)育過程。本文建立的基于納米顆粒密度形成的物理和物理-化學(xué)雙重梯度模型，可望發(fā)展成為一種實(shí)用的技術(shù)平臺(tái)，用于神經(jīng)科學(xué)研究。