黃 荷，張 勇，楊舒婷，符曉華

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管疾病研究室，長沙 410113）

DFMG調(diào)節(jié)TLR-4抑制損傷內(nèi)皮細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞增殖和遷移促進(jìn)作用

黃 荷，張 勇，楊舒婷，符曉華

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管疾病研究室，長沙 410113）

目的：觀察7 -二氟亞甲基- 5，4-二甲氧基異黃酮（DFMG）是否能干預(yù)損傷內(nèi)皮細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用，且其干預(yù)過程是否與TLR4信號通路相關(guān)。方法：采用CCK-8法和Transwell遷移法測定LPC誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的損傷對平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移的影響。采用Western blot和熒光定量PCR測定損傷共培養(yǎng)體系中的內(nèi)皮細(xì)胞TLR4在蛋白水平和基因水平的表達(dá)。運用TLR4特異性激動劑（LPS）和特異性的抑制劑（CLI095），采用CCK8法和Transwell遷移法測定損傷共培養(yǎng)體系中平滑肌細(xì)胞的增殖能力和遷移能力。結(jié)果：①隨著LPC濃度的增加，LPC誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移的效應(yīng)增強(qiáng)，并且選取30 μM的LPC作用于內(nèi)皮細(xì)胞并與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)作為實驗的損傷共培養(yǎng)模型。②經(jīng)光密度值分析，LPC組的內(nèi)皮細(xì)胞TLR4的表達(dá)量是對照組的2倍；經(jīng)熒光定量PCR分析，LPC組的內(nèi)皮細(xì)胞TLR4的表達(dá)量是對照組的2.414倍。③相比，損傷組和LPS組的平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力較對照組更強(qiáng)；相比，CLI095組和DFMG組的平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力較損傷組更弱。結(jié)論：LPC誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的損傷可以引起平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，而DFMG可能是通過抑制TLR4信號阻礙損傷的內(nèi)皮細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用。

內(nèi)皮細(xì)胞；平滑肌細(xì)胞；增殖；遷移；共培養(yǎng)；DFMG、TLR4

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種炎癥性疾病［1-3］，是心血管病中常見的最重要的病理過程。而血管內(nèi)皮的損傷被認(rèn)為是AS的“始發(fā)因素”。血管內(nèi)皮損傷可引起血管壁通透性增加，減少NO、內(nèi)皮素-1的分泌并促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移以及巨噬細(xì)胞活化成為泡沫細(xì)胞，進(jìn)而引起AS［4-6］。研究表明，TLR4參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展［7-10］。7-二氟甲氧基-5，4’-二甲氧基金雀異黃素（7-difluoromethoxy-5，4’- dimethoxygenistein，DFMG），是本課題組自主合成的新型活性化學(xué)實體（專利申請?zhí)枺?007101043894；公開號：CN 101225081A）［11］。前期試驗證實DFMG有抗動脈粥樣硬化的作用。那么，DFMG是否可能是通過抑制TLR4信號來拮抗損傷內(nèi)皮細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用？

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人血管內(nèi)皮細(xì)胞（VECs）和人血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）由本實驗室保存；7-二氟甲氧基-5，4’-二甲氧基金雀異黃素，即DFMG，由本實驗室合成并保存；溶血性磷脂酰膽堿（LPC）購自美國Sigma公司；實時定量PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自中國唯贊公司；DAB顯影試劑盒購自以色列Bioind公司；TLR4一抗購自美國ABGENT公司；GAPDH一抗購自中國康為世紀(jì)公司；二抗購自中國康為世紀(jì)公司；Transwell共培養(yǎng)板購自美國康寧公司。

1.2 氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞-平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)模型的制備 按照以下方法進(jìn)行損傷共培養(yǎng)模型的建立。血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞分別稀釋成細(xì)胞懸液1× 105/mL。血管內(nèi)皮細(xì)胞種于下室，并用LPC進(jìn)行預(yù)處理。然后，平滑肌細(xì)胞種于上室。細(xì)胞之間內(nèi)沒有直接的物理連接，但能通過分泌可溶性因子通過聚碳酸酯膜進(jìn)行相互作用。其模型的最佳濃度用LPC設(shè)置的濃度梯度（0，10，20，30，40和50 μM）經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析最終獲取。

1.3 CCK-8法檢測平滑肌細(xì)胞活力 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長至80%融合時，接種到Transwell下室，并與1 μM 的DFMG、1 μM的LPS或者1 μM的CLI095進(jìn)行預(yù)孵育，再進(jìn)行損傷共培養(yǎng)模型的建立。24h后進(jìn)行CCK-8的測定。加 CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。每孔加入20 μL的CCK-8 試劑（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 O.D值的讀數(shù)）。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時后，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。 最后根據(jù)O.D值計算細(xì)胞活力值。

1.4 Transwell遷移實驗測定平滑肌細(xì)胞的遷移能力

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長至80%融合時，接種到Transwell下室，并與1 μM的DFMG、1 μM的LPS或者1 μM的CLI095進(jìn)行預(yù)孵育，再進(jìn)行損傷共培養(yǎng)模型的建立。24 h后，取出Transwell小室（孔徑8 μm），棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30分鐘，將小室適當(dāng)風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色或者PI染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗3遍。隨機(jī)四個高倍視野計數(shù)。

1.5 Western blot實驗測定TLR4蛋白水平的表達(dá)30 μM 的LPC作用于內(nèi)皮細(xì)胞，并與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)，24小時收集內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白樣品，使用裂解液，反復(fù)凍融法提取蛋白。收集完蛋白樣品后，測定每個蛋白樣品的蛋白濃度（BCA法）。按照參考文獻(xiàn)資料配制SDS-PAGE凝膠。并在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）。100℃變性 10 min，每孔蛋白上樣量約為 50 μg。開始電泳。待溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，隨即轉(zhuǎn)膜并4℃ 封閉過夜。隨后，參照抗體說明書進(jìn)行一抗（TLR4稀釋比例1∶1000；GAPDH稀釋比例1∶5000）和二抗（稀釋比例 1∶10000）的孵育。最后用ECL類試劑和顯影儀來檢測蛋白。結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行光密度值測定TLR4的相對表達(dá)量。

1.6 實時熒光定量PCR法檢測TLR4 mRNA的表達(dá)情況 采用Trizol法提取內(nèi)皮細(xì)胞的總RNA。提取完畢后，采用紫外吸收測定法，即取少量液體用TE稀釋（一般1∶100稀釋）后，讀取其在分光光度計260 nm和280 nm處的吸收值，可以測定RNA溶液濃度和純度。并按照中國唯贊公司提供的操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-PCR，RT-PCR），得到比較穩(wěn)定的cDNA。然后，根據(jù)NCBI中公布的TLR4基因序列（NM_138554），使用DNAMAN軟件，設(shè)計擴(kuò)增TLR4基因的引物，引物設(shè)計好后交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，采用PAGE純化。引物序列為：TLR4-UP：5'- CCGAGGCCATTATGCTATGT -3'；TLR4-DN：5'- TCCCTTCCTCCTTTTCCCTA -3'。按照中國唯贊公司提供的操作說明進(jìn)行實時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）。得到的數(shù)據(jù)用于計算TLR4 mRNA 的相對表達(dá)量（以GAPDH基因為內(nèi)參照）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗、單因素方差分析的統(tǒng)計學(xué)分析。若方差齊，則使用SNK法進(jìn)行多樣本之間的兩兩比較，若方差不齊，則使用Dunnett-t進(jìn)行多樣本之間的兩兩比較。當(dāng)P＜0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPC誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的損傷促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖 不同濃度的LPC（0，10，20，30，40和50 μm）作用于內(nèi)皮細(xì)胞，并與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)，24小時后收集平滑肌細(xì)胞，用CCK-8法測定平滑肌細(xì)胞的增殖，結(jié)果如圖所示（圖1）。由結(jié)果可知，從30 μm開始，隨著LPC濃度的增加，平滑肌細(xì)胞的增殖能力也增加。

圖1 損傷VECs對VSMCs增殖的影響

2.2 LPC誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的損傷促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的遷移

不同濃度的LPC（0，10，20，30，40和50 μm）作用于內(nèi)皮細(xì)胞，并與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)，24小時后收集平滑肌細(xì)胞，用PI染色，在熒光顯微鏡下計數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果如圖所示（圖2）。由結(jié)果可知，從30 μm開始，隨著LPC濃度的增加，平滑肌細(xì)胞的增殖能力也增加。并且選取30 μm的LPC作用于內(nèi)皮細(xì)胞并與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)作為實驗的損傷共培養(yǎng)模型。

圖2 損傷VECs對VSMCs遷移的影響

根據(jù)LPC濃度分為六組：（A）Control組/0 μM組，（B）10 μM組，（C）20 μM組，（D）30 μ組，（E）40 μM組，（F）50 μM組；采用PI染色計數(shù)遷移的平滑肌細(xì)胞（200×）

2.3 損傷共培養(yǎng)模型中內(nèi)皮細(xì)胞的TLR4的表達(dá)將30 μm 的LPC作用于內(nèi)皮細(xì)胞后與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)，作為本實驗的LPC組，而正常內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)作為對照組。24小時后收集LPC組和對照組中的內(nèi)皮細(xì)胞，提蛋白和RNA，Western Blot（圖3A）和實時熒光定量PCR（圖3B）的結(jié)果如圖所示。經(jīng)光密度值分析結(jié)果可知，LPC組內(nèi)皮細(xì)胞TLR4的表達(dá)量約為對照組的2.3倍；經(jīng)實時定量PCR相對定量分析可知，LPC組內(nèi)皮細(xì)胞TLR4的表達(dá)量約為對照組的2.4倍。

圖3（A） 損傷共培養(yǎng)體系中損傷VECs的TLR4蛋白水平的表達(dá)

圖3（B） 損傷共培養(yǎng)體系中損傷VECs的TLR4基因水平的表達(dá)

2.4 DFMG通過TLR4抑制損傷內(nèi)皮細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用 實驗分為五組：對照組（正常內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)組）、損傷組（即LPC組或損傷共培養(yǎng)模型組，用30 μm的LPC損傷內(nèi)皮細(xì)胞再與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)）、TLR4激動劑組（即LPS組，內(nèi)皮細(xì)胞提前與LPS進(jìn)行預(yù)孵育，再進(jìn)行損傷共培養(yǎng)模型的建立）、TLR4抑制劑組（即CLI095組，內(nèi)皮細(xì)胞提前與CLI095進(jìn)行預(yù)孵育，再進(jìn)行損傷共培養(yǎng)模型的建立）和DFMG組（內(nèi)皮細(xì)胞提前與DFMG進(jìn)行預(yù)孵育，再進(jìn)行損傷共培養(yǎng)模型的建立）。采用CCK-8法測量以上各組中平滑肌細(xì)胞的增殖，結(jié)果如圖所示（圖4）。由結(jié)果可知，與對照組相比，損傷組和LPS組的平滑肌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；與損傷組相比，CLI095組和DFMG組的平滑肌細(xì)胞的增殖能力減弱。

2.5 DFMG通過TLR4抑制損傷內(nèi)皮細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用 實驗分組如下（同3.4）：對照組、損傷（LPC）組、TLR4激動劑（LPS）組、TLR4抑制劑（CLI095）組和DFMG組，采用結(jié)晶紫染色計數(shù)遷移的平滑肌細(xì)胞，結(jié)果如圖所示（圖5）。由結(jié)果可知，與對照組相比，損傷組和LPS組的平滑肌細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)；與損傷組相比，CLI095組和DFMG組的平滑肌細(xì)胞的遷移能力減弱。

圖4 DFMG通過TLR4抑制損傷VECs對VSMCs增殖的促進(jìn)作用

圖5 DFMG通過TLR4抑制損傷VECs對VSMCs遷移的促進(jìn)作用

3 討論

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）始于血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。內(nèi)皮細(xì)胞是位于血流與血管平滑肌之間一層表面光滑的細(xì)胞。它不但是一道生理屏障，而且能分泌合成多種血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子和粘附因子等，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞與血管功能。血管內(nèi)皮損傷可引起血管壁通透性增加，減少NO、內(nèi)皮素-1的分泌并促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移以及巨噬細(xì)胞活化成為泡沫細(xì)胞，最后引起AS［4-6］。所以拮抗內(nèi)皮細(xì)胞損傷對于防止AS十分重要。但內(nèi)皮細(xì)胞并不是參與AS的唯一細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等都參與其中。這些因素相互作用，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。其中，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞又是構(gòu)成血管壁最主要的細(xì)胞成分，兩種細(xì)胞間的相互調(diào)節(jié)、相互影響和相互作用是血管壁自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性得以維持的關(guān)鍵。因此研究內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞之間的相互作用尤為關(guān)鍵。近來興起的Transwell共培養(yǎng)技術(shù)使得研究兩種細(xì)胞之間的相互作用成為可能。本研究運用Transwell共培養(yǎng)技術(shù)建立的損傷內(nèi)皮細(xì)胞-平滑肌細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，將內(nèi)皮細(xì)胞的損傷設(shè)為起始因素，觀察其對平滑肌細(xì)胞的作用。結(jié)果（圖1和圖2）發(fā)現(xiàn)在損傷共培養(yǎng)體系中，平滑肌細(xì)胞的增殖能力和遷移能力均增強(qiáng)。

許多研究表明，動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾?。?-10］。而TLR4在AS的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中有重要作用。Medzhito V［12］等于1997年首次發(fā)現(xiàn)并命名TLR4。Masakazu Shinohara［13］等指出TLRs以固有免疫和適應(yīng)性免疫的方式參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，并且起著關(guān)鍵的作用。S Gargiulo［7］等指出人和動物的動脈粥樣硬化瘢塊中，TLR4表達(dá)增多，并且TLR4的活化能上調(diào)多種細(xì)胞因子、趨化因子和粘附分子（IL-6，IL-1β，TNF-α，MMP-9等），這些因子和分子參與細(xì)胞募集和增殖，進(jìn)而觸發(fā)炎性反應(yīng)，促進(jìn)內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞集聚。在本研究中，我們用Western Blot和熒光定量PCR驗證了在損傷共培養(yǎng)體系中內(nèi)皮細(xì)胞TLR4的總蛋白與基因表達(dá)量增多（圖3）。這些已有的研究成果以及我們的前期抗體芯片的結(jié)果均提示TLR4可能成為預(yù)防和治療AS的重要靶點。

金雀異黃素（genistein，GEN），化學(xué)名為5，7，4’-三羥基異黃酮，是一種來源于豆類植物的異黃酮。已有研究證明金雀異黃素（Genistein，GEN）可通過TLR4及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展［14，15］。7-二氟甲氧基-5，4’-二甲氧基金雀異黃素（7-difluoromethoxy-5，4’- dimethoxygenistein，DFMG），是本課題組針對GEN的缺點進(jìn)行改造得到的新型活性化學(xué)實體［11，16］。我們的前期試驗證實DFMG具有抗動脈粥樣硬化的作用。但是，在內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞共同存在的情況下，DFMG的作用及其機(jī)制還不十分明確。本研究通過建立損傷內(nèi)皮細(xì)胞-平滑肌細(xì)胞共

培養(yǎng)體系，模擬DFMG對內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的作用方式，觀察DFMG對損傷共培養(yǎng)體系中平滑肌增生遷移的影響。同時，運用TLR4激動劑（LPS）和TLR4拮抗劑（CLI095）驗證DFMG的作用機(jī)制。結(jié)果（圖4和圖5）發(fā)現(xiàn)，與對照組的平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力相比，損傷組和LPS組的平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力增強(qiáng)；與損傷組的平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力相比，CLI095組和DFMG組的平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力減弱。也就是說，損傷的內(nèi)皮細(xì)胞和TLR4激動劑（LPS）刺激的內(nèi)皮細(xì)胞均能引起平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力增強(qiáng)，而DFMG和TLR4拮抗劑（CLI095）的處理后的內(nèi)皮細(xì)胞均能抑制損傷共培養(yǎng)模型中平滑肌細(xì)胞的增殖。一方面表明DFMG能抑制損傷共培養(yǎng)體系中平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移；另一方面揭示了DFMG的這一抑制作用可能跟TLR4信號密切相關(guān)。但是在損傷共培養(yǎng)體系中，DFMG是如何發(fā)揮作用的，還有賴于更多的直接實驗進(jìn)行證實。本研究為進(jìn)一步探討DFMG 拮抗內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞的相互作用機(jī)制提供了理論和實驗基礎(chǔ)。

［1］ Galkina E， Ley K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis［J］. Annu Rev Immunol ， 2009， 27： 165-197.

［2］ Geng YJ， Jonasson L. Linking Immunity to Atherosclerosis： Implications for Vascular Pharmacology-A tribute to G?ran K. Hansson［J］. Vascul Pharmacol， 2012， 56（1-2）： 29-33.

［3］ Hansson GK. Inflammation and immune response in atherosclerosis［J］. Curr Atheroscler Rep， 1999， 1（2）： 150-155.

［4］ Bertoluci MC， Cé GV， da Silva AM， et al. Endothelial dysfunction as a predictor of cardiovascular disease in type 1 diabetes［J］. World J Diabetes， 2015， 6（5）： 679-692.

［5］ Fu XH， Wang L， Zhao H， et al. Synthesis of genistein derivatives and determination of their protective effects against vascular endothelial cell damages caused by hydrogen peroxide［J］. Bioorg Med Chem Lett， 2008，18（2）： 513-517.

［6］ 李丹， 李玉潔， 楊慶， 等. 血管內(nèi)皮功能障礙與動脈粥樣硬化研究進(jìn)展［J］. 中國實驗方劑學(xué)雜志， 2012（08）： 272-276.

［7］ Gargiulo S， Gamba P， Testa G， et al. Relation between TLR4/NF-κB signaling pathway activation by 27-hydroxycholesterol and 4-hydroxynonenal， and atherosclerotic plaque instability［J］. Aging Cell，2015， 14（4）： 569-581.

［8］ Scholtes VP， Versteeg D， de Vries JP， et al. Toll-like receptor 2 and 4 stimulation elicits an enhanced inflammatory response in human obese patients with atherosclerosis［J］. Clin Sci （Lond）， 2011， 121（5）：205-214.

［9］ 耿紅蓮， 屠小卿， 朱燁， 等. 動脈粥樣硬化相關(guān)自身抗體的檢測及臨床意義［J］. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志， 2004， 27（2）： 82-84.

［10］ 盛富強(qiáng)， 程龍獻(xiàn). TLR4信號通路與動脈粥樣硬化的研究進(jìn)展［J］.心臟雜志， 2009（04）： 572-574.

［11］ Zhao H， Li C， Cao JG， et al. 7-Difluoromethyl-5， 4'-dimethoxygenistein，a novel genistein derivative， has therapeutic effects on atherosclerosis in a rabbit model［J］. J Cardiovasc Pharmacol， 2009， 54（5）： 412-420.

［12］ Medzhitov R， Preston-Hurlburt P， Janeway CA Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity［J］. Nature， 1997， 388（6640）： 394-397.

［13］ Shinohara M， Hirata K， Yamashita T， et al. Local Overexpression of Toll-Like Receptors at the Vessel Wall Induces Atherosclerotic Lesion Formation［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2007， 27（11）： 2384-2391

［14］ Dijsselbloem N， Goriely S， Albarani V， et al. A critical role for p53 in the control of NF-κB-dependent gene expression in TLR4-stimulated dendritic cells exposed to Genistein［J］. J Immunol， 2007， 178（8）：5048-5057.

［15］ Zhou X， Yuan L， Zhao X， et al. ， Genistein antagonizes inflammatory damage induced by β-amyloid peptide in microglia through TLR4 and NF-κB［J］. Nutrition， 2014， 30（1）： 90-95.

［16］ Zhang Y， Li L， You J， et al. Effect of 7-difluoromethyl-5， 4'-dimethoxygenistein on aorta atherosclerosis in hyperlipidemia ApoE（-/-）mice induced by a cholesterol-rich diet［J］. Drug Des Devel Ther， 2013，7： 233-242.

DFMG Inhibited Proliferation and Migration of Smooth Muscle Cells Stimulated by LPCInduced Injured Endothelial Cells through Depressing TLR4

Huang He， Zhang Yong， Yang Shu-ting， Fu Xiao-hua
（Department of Cardiovascular disease， Medicine College， Hunan Normal University， Changsha 410006， China）

Objective To observe the effect of 7-Difluoromethyl-5，4’-dimethoxygenistein （DFMG） on the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells（VSMCs） stimulated by LPC-induced injured vascular endothelial cells（VECs），and whether the intervention process of DFMG is related to the TLR4. Methods The proliferation and migration of VSMCs was detected by CCK-8 assay and Transwell-migration method. The TLR4 protein and gene expression of VECs was detected by western blot and fluorescence quantitative PCR. Using TLR4 specific agonist （LPS） and specific inhibitor （CLI095）， the proliferation and migration ability of VSMCs was analysed by CCK-8 assay and Transwell-migration method. Results The injured VECs induced by LPC caused the proliferation and migration of VSMCs， and VSMCs cocultured with VECs induced by 30 μM LPC became the injured coculture model of the following experiment. TLR4 protein expression of the injured VECs in the injured coculture model was 2.3 times as much as that of the normal VECs in the normal coculture model； TLR4 gene expression of the injured VECs in the injured coculture model was 2.4 times as much as that of the normal VECs in the normal coculture model. The proliferation and migration capacity of the injured group and the agonist group were stronger than that of the normal group. In addition， the proliferation and migration capacity of the inhibitor group and the DFMG-treated group were weaker than that of the injured group. Conclusion The injured VECs induced by LPC caused the proliferation and migration of VSMCs， and DFMG inhibited proliferation and migration of VSMCs in the LPC-induced injured VECs-VSMCs cocultured model by depressing TLR4.

TLR4； DFMG； VECs； VSMCs； Proliferation； Migration； Co-culture

R363

A

1673-016X（2016）01-0001-05

2015-11-13

國家自然科學(xué)基金資助項目（81370382）；湖南省自然科學(xué)基金項目（14JJ2059）

符曉華，E-mail：fuxh1@126.com