張 敏，潘劍珍，劉 彤，劉 杰，熊元元，劉志雄，劉運(yùn)生，吳國輝，劉海蘭，謝楚波，陳江慧，任凱群，王光偉，2*

（1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410013；2.湖南醫(yī)藥學(xué)院，懷化 418000；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，長沙 410008）

KCTD10在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)的初步研究

張 敏1#，潘劍珍1#，劉 彤1#，劉 杰1#，熊元元3，劉志雄3，劉運(yùn)生3，吳國輝1，劉海蘭1，謝楚波1，陳江慧1，任凱群1，王光偉1，2*

（1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410013；2.湖南醫(yī)藥學(xué)院，懷化 418000；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，長沙 410008）

目的：初步探討KCTD10（potassium channel tetramerisation domain-containing 10）基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義。方法：收集人神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本6例，同時收集正常腦組織標(biāo)本2例，用免疫組化染色法檢測KCTD10在這些標(biāo)本中的表達(dá)情況。結(jié)果：在6例人神經(jīng)膠質(zhì)瘤切片中均檢測到KCTD10的高表達(dá)，而在2例正常腦組織中未檢測到KCTD10的表達(dá)。結(jié)論：KCTD10在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中表達(dá)水平較正常腦組織中明顯增高，提示KCTD10可能在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起作用。

KCTD10；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；表達(dá)

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 6例神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本病理切片及兩例正常腦組織切片由中南大學(xué)湘雅附二醫(yī)院病理科提供，病理切片系神經(jīng)外科腫瘤切除手術(shù)標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后切片制成，且相應(yīng)腫瘤在手術(shù)之前均未進(jìn)行任何放療、化療及免疫治療等特殊處理，6例膠質(zhì)瘤標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)檢查均為神經(jīng)膠質(zhì)瘤，2例腦組織標(biāo)本作為正常對照。

1.2 主要儀器和試劑 石蠟包埋機(jī)、Leica石蠟切片機(jī)、Olympus光學(xué)顯微鏡、冰箱；微波爐；KCTD10抗體（一抗）購自Abcam公司，免疫組織化學(xué)所用二抗試劑盒（PV6000）和DAB試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.3 免疫組化染色 實(shí)驗(yàn)組：石蠟切片，厚度4 μm，切片，然后68℃烤片2 h，二甲苯脫蠟及梯度乙醇水化，自來水沖洗，將切片置于檸檬酸抗原修復(fù)液中微波爐修復(fù)，用PBS沖洗切片3次，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗切片3次，加1滴鼠抗人KCTD10 4℃孵育過夜，PBS沖洗3次后，加1滴通用型PV6000二抗試劑室溫下孵育1h，PBS沖洗3次，加2滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～5 min 終止顯色，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，中性樹膠封片。以一抗稀釋溶液代替一抗作陰性對照。對照組操作同實(shí)驗(yàn)組。

1.4 細(xì)胞學(xué)觀察 KCTD10蛋白免疫組化陽性染色結(jié)果應(yīng)為細(xì)胞漿呈棕黃色或棕褐色著色。隨機(jī)選取10個高倍鏡視野，參照Lizasa T的方法進(jìn)行評分，陽性細(xì)胞百分比：無表達(dá)為0，1%～25%為1，25%～50%為2，超過50%為3；著色強(qiáng)度：無著色為0，淡黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3，兩者分值相加為最后得分：0分為陰性，2分為+，3～4分為++，5～6分為+++。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色檢測KCTD10蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá) KCTD10免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如圖1所示，KCTD10蛋白陽性反應(yīng)為棕黃色顆粒，主要位于胞漿，同時在細(xì)胞漿膜也有表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果顯示KCTD10蛋白在神級膠質(zhì)瘤WHOⅠ～Ⅱ級、Ⅱ～Ⅲ級、Ⅳ級標(biāo)本中的均有表達(dá)，在六例神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中，有3例KCTD10表達(dá)為（+++）（6分）；1例為（+++）（5分）；一例為（++）（3分）；1例為（++）（4分）；而在2例正常腦組織標(biāo)本中都沒有檢測到KCTD10的表達(dá)。

圖1 KCTD10在各級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤及正常腦組織中的表達(dá)情況（DAB顯色，×400）

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的一種原發(fā)惡性腫瘤，發(fā)生率約占所有顱內(nèi)腫瘤的40%～50%。每種神經(jīng)膠質(zhì)瘤又根據(jù)其浸潤性和惡性程度分為Ⅰ～Ⅳ級，級別越高則惡性程度越高，預(yù)后也愈差。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生機(jī)理不明，呈浸潤性生長且分界不清、又有分化差、增殖快、侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后惡性程度增高等特點(diǎn)［4］，目前對其只能是以外科手術(shù)切除為主，結(jié)合放療、化療的綜合治療，該方式只能延長患者壽命，不能徹底治愈。近幾年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)了一些對神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展較為重要的相關(guān)基因，包括IMP3、ATX、EGFR、IDH1和p53等。對這些基因的研究和深入探討在膠質(zhì)瘤的防治方面具有重要意義［5-8］。但膠質(zhì)瘤發(fā)生的分子機(jī)制仍未能得到闡明。有關(guān)膠質(zhì)瘤的新的診斷和治療靶點(diǎn)亟需找出，為更精確的診斷和更有效的治療提供新的可能。

人類KCTD10（channel tetramerisation domaincontaining 10）基因位于染色體12q24.11區(qū)域，有7個外顯子，分布在28.8 kb的染色體中，其啟動子富含GC堿基，具有管家基因的特征。與PDIP1家族其它成員一樣，KCTD10在其氨基酸的N端區(qū)域包含一個BTB/POZ結(jié)構(gòu)域，在C末端區(qū)域則有增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的結(jié)合模體［1］，并且也具有與DNA聚合酶δ小亞基P50及PCNA相互結(jié)合的活性，能被腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素6（IL-6）所誘導(dǎo)［8］。因此KCTD10很有可能參與DNA復(fù)制，DNA修復(fù)，細(xì)胞周期調(diào)控過程等生理活動。但目前有關(guān)KCTD10與疾病相關(guān)的研究并不多。有研究顯示KCTD10的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）能夠影響高密度脂蛋白膽固醇的濃度，尤其在攝入高水平碳水化合物的主體中它的作用越明顯［9］。另外KCTD10能直接結(jié)合Tbx5，并抑制它的轉(zhuǎn)錄活性，說明KCTD10基因很有可能是引起先天性心臟病的一大重要基因［10］，KCTD10同樣在血管的形成中發(fā)揮著重要的作用，其對心臟疾病的作用與PCNA和RhoA相關(guān)［11］。并且在胃腸道間質(zhì)瘤中，KCTD10對胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞有腫瘤抑制作用。其在胃腸道間質(zhì)瘤中可能作為一種新型的預(yù)后標(biāo)志物［12］。

本研究結(jié)果表明，KCTD10在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中表達(dá)水平較正常腦組織中明顯增高，這一結(jié)果提示KCTD10在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生中起到了某種作用。結(jié)合上述研究結(jié)果，推測KCTD10可能是通過PCNA介導(dǎo)的信號通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生中起作用的。

本研究從組織水平初步檢測了神經(jīng)膠質(zhì)瘤中KCTD10的表達(dá)情況，基于以上的研究結(jié)果，本課題組擬收集更多的神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本，進(jìn)一步確認(rèn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)中KCTD10的表達(dá)情況，并結(jié)合細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究KCTD10在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用與具體機(jī)制，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供新的線索。

［1］ Zhou J， Ren K， Liu X， et al. A novel PDIP1-related protein， KCTD10，that interacts with proliferating cell nuclear antigen and DNA polymerase delta ［J］. Biochim Biophys Acta， 2005， 1729（3）： 200-203.

［2］ 孫吉康， 張波， 張健， 等. 小鼠KCTD10 特異性抗體制備及其在小鼠背神經(jīng)上皮和背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)［J］. 生物工程學(xué)報， 2007， 23（6）：1011-1016.

［3］ 黃亮， 王光偉， 楊俊梅， 等. KCTD10在上皮型腦膜瘤中表達(dá)的初步研究［J］. 湖南師范大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）， 2013， 10（2）： 5-7.

［4］ Partap S， Fisher PC. Update on new treatments and developments in childhood brain tumor ［J］. Curr Opin Pediatr， 2007， 19（6）： 670-674.

［5］ Suvasini R， Shruti B， Thota B， et al. Insulin growth factor-2 binding protein 3 （IGF2BP3） is a glioblastoma-specific marker that activates phosphatidylinositol 3-kinase/mitogen-activated protein kinase （PI3K/MAPK） pathways by modulating IGF-2. ［J］. J Biol Chem， 2011，286（29）： 25882-25890.

［6］ Schleicher SM， Thotala DK， Linkous AG， et al. Autotaxin and LPA receptors represent potential moleculart argets for the radiosensitization of murine gliomathrough effects on tumor vasculature ［J］. PLoS One， 2011，6（7）： e22182.

［7］ Zhao S， Lin Y， Xu W， et al. Glioma-Derived Mutations in IDH1 Dominantly Inhibit IDH1 Catalytic Activity and induce HIF-1 alpha ［J］. Science， 2009， 324（5924）： 261-265.

［8］ J Zhou， X Hu， X Xiong， et al. Cloning of two rat PDIP1 related genes and their interactions with proliferating cell nuclear antigen ［J］. Journal of experimental zoology， 2005， 303A： 227-240.

［9］ Junyent M， Parnell LD， Lai CQ ， et al. Novel variants at KCTD10，MVK， and MMAB genes interact with dietary carbohydrates to modulate HDL-cholesterol concentrations in the genetics of lipid lowering drugs and diet network study. Am J Clin Nutr， 2009， 90（3）： 686-694.

［10］ Tong X， Zu Y， Li Z， et al. Kctd10 regulates heart morphogenesis by repressing the transcriptional activity of Tbx5a in zebrafish ［J］. Nat Commun， 2014， 5： 3153. doi： 10. 1038/ncomms4153.

［11］ Xiang Hu， Shiquan Gan， Guie Xie ， et al. KCTD10 is critical for heart and blood vessel development of zebrafish. Acta Biochim Biophys Sin 2014， 46（5）： 377-386.

［12］ Daisuke Kubota， Yoshida A， Tsuda H， et al. Gene expression network analysis of ETV1 reveals KCTD10 as a novel prognostic biomarker in gastrointestinal stromal tumor ［J］. PLoS One， 2013， 8（8）： e73896.

A preliminary study on expression of KCTD10 in gliomas

Zhang Min1#， Pan Jian-zhen1#， Liu Tong1#， Liu Jie1#， Xiong Yuan-yuan3， Liu Zhi-xiong3， Liu Yun-sheng3， Wu Guo-hui1，Liu Hai-lan1， Xie Chu-bo1， Chen Jiang-hui1， Ren Kai-qun1， Wang Guang-wei1， 2*
（1.Medical College， Hunan Normal University， Changsha 410013， China； 2. Hunan University of Medicine， Huaihua 418000， China； 3. Department of Neurosurgery， Xiangya Hospital， Central South University， Changsha 410008， China）

Objective To study the expression and significance of KCTD10 （potassium channel tetramerisation domaincontaining 10） gene in gliomas. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of KCTD10 in 2 cases of normal brain tissue and 6 cases of gliomas. Results KCTD10 expression was not detected in 2 cases of normal brain tissue，while they were highly detected in all of the gliomas tissues. Conclusion KCTD10 showed a significantly higher expression in gliomas than in normal brain tissue， and it is suggested that KCTD10 may play an important role in gliomas.

KCTD10； glioma； expression KCTD10（potassium channel tetramerisation domaincontaining 10）基因?qū)儆赑DIP1基因家族，它是腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白，參與DNA損傷修復(fù)途徑［1］。研究發(fā)現(xiàn)，KCTD10 蛋白在E12.5 d的小鼠胚胎背根神經(jīng)節(jié)及神經(jīng)管神經(jīng)上皮中有明顯表達(dá)，表明KCTD10在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中可能發(fā)揮某種作用［2］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，KCTD10在上皮型腦膜瘤中高表達(dá)，提示其可能參與上皮型腦膜瘤的發(fā)生、發(fā)展［3］。本研究擬運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法，檢測正常腦組織標(biāo)本及神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中KCTD10表達(dá)水平的差異，初步探討KCTD10在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。

R749.45

A

1673-016X（2016）01-0006-03

2015-10-25

國家大學(xué)生創(chuàng)新性試驗(yàn)計(jì)劃資助項(xiàng)目（No.20130542012）#為并列第一作者

王光偉，E-mail：wanggwwmq323@163.com