劉宇肖衛(wèi)華羅貝貝，3陳佩杰

1上海體育學(xué)院運(yùn)動科學(xué)學(xué)院（上海200438）2沈陽體育學(xué)院運(yùn)動人體科學(xué)學(xué)院（遼寧沈陽110102）3中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室（上海200433）

急性骨骼肌鈍挫傷修復(fù)過程及MyoD、Myogenin變化的實(shí)驗(yàn)研究

劉宇1，2肖衛(wèi)華1羅貝貝1，3陳佩杰1

1上海體育學(xué)院運(yùn)動科學(xué)學(xué)院（上海200438）2沈陽體育學(xué)院運(yùn)動人體科學(xué)學(xué)院（遼寧沈陽110102）3中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室（上海200433）

目的：觀察小鼠急性骨骼肌鈍挫傷后骨骼肌動態(tài)修復(fù)過程，探討傷后MyoD和Myogenin的作用。方法：以雄性C57BL/6小鼠為研究對象，制作腓腸肌鈍挫傷模型，分為正常對照組和損傷后12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d組。經(jīng)HE染色和Masson三色染色觀察骨骼肌鈍挫傷后再生和纖維化瘢痕愈合過程；經(jīng)免疫蛋白印跡法與免疫組織化學(xué)法檢測MyoD和Myogenin定量與定位表達(dá)變化。結(jié)果：（1）骨骼肌鈍挫傷后3 d首次觀察到新生肌細(xì)胞核，傷后5 d開始出現(xiàn)膠原纖維。（2）MyoD傷后1 d表達(dá)至高峰，隨后下降，傷后14 d再次表達(dá)至第2高峰；MyoD陽性細(xì)胞核由正常肌細(xì)胞邊緣逐漸遷移至受損骨骼肌周圍聚集。（3）Myogenin傷后3 d開始表達(dá)至高峰；Myogenin陽性細(xì)胞核傷后3 d首次出現(xiàn)在新生成肌細(xì)胞核上，傷后5 d在新生肌管中表達(dá)，傷后7 d逐漸遷移至新生肌細(xì)胞邊緣表達(dá)。結(jié)論：骨骼肌急性鈍挫傷后MyoD和Myogenin表達(dá)具有時間規(guī)律性，新生肌纖維和纖維化共同完成骨骼肌鈍挫傷后的愈合過程。

骨骼?。烩g挫傷；MyoD；Myogenin

流行病學(xué)調(diào)查顯示骨骼肌損傷是運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主要病種之一，骨骼肌傷后修復(fù)自然成為研究的熱點(diǎn)問題。骨骼肌損傷后，肌膜破壞和變性，處于安靜狀態(tài)的肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活、增殖和分化，促使肌纖維再生。目前骨骼肌傷后修復(fù)過程的研究主要集中在運(yùn)動性骨骼肌微損傷、撕裂傷、藥物注射彌漫性損傷、凍傷和擠壓綜合征等方面，而對于骨骼肌常見的急性鈍挫傷［1，2］的研究卻較少。骨骼肌再生關(guān)鍵因子——肌衛(wèi)星細(xì)胞，它的活化、增殖和分化主要依靠骨骼肌特異性轉(zhuǎn)錄因子MyoD和Myogenin的調(diào)節(jié)［3］。MyoD和Myogenin是胚胎和新生兒階段骨骼肌形成的重要蛋白因子，并且在肌肉再生過程中也發(fā)揮重要作用［4］。MyoD在活化的肌衛(wèi)星細(xì)胞里表達(dá)［5］，Myogenin在胚胎期與肌纖維的形成有關(guān)，也可能參與成肌細(xì)胞的分化，特別是成肌細(xì)胞融合成肌管的階段［6］。早有報道，MyoD和Myogenin分別參與成肌前體細(xì)胞的增殖和分化［7］。本研究采用骨骼肌急性鈍挫傷模型，通過HE染色和Masson染色從形態(tài)學(xué)角度觀察小鼠骨骼肌鈍挫傷后再生修復(fù)和瘢痕愈合過程；通過免疫蛋白印跡法和免疫組織化學(xué)法分別從時間變化和空間分布角度探討生肌調(diào)節(jié)因子MyoD、Myogenin在骨骼肌急性鈍挫傷后的作用，進(jìn)一步加深對骨骼肌鈍挫傷后動態(tài)修復(fù)過程的理解。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物和分組

8～10周齡健康雄性C57BL/6小鼠56只，體重18. 2～22.9 g，購自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，SYXK（滬）2013-0016。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，每籠8只。飼養(yǎng)環(huán)境為21～25℃，濕度40%～50%，12 h光照︰12 h黑暗，自由飲食。隨機(jī)選取8只作為正常對照組（C組），余下進(jìn)行骨骼肌鈍挫傷處置，分為傷后12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d組。

1.1.2骨骼肌鈍挫傷模型

采用簡便可重復(fù)性的骨骼肌鈍挫傷造模方法［8，9］，略有改動。小鼠行2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，固定于膝關(guān)節(jié)伸直0°，踝關(guān)節(jié)背伸90°位，一質(zhì)量16.8 g、直徑15.9 mm的實(shí)心不銹鋼鋼珠置于一透明管道頂端（高100 cm，內(nèi)徑16.0 mm）釋放后垂直擊中一打擊裝置，打擊裝置底端撞擊小鼠雙側(cè)腓腸肌肌腹中段（打擊面積28.26 mm2），傷后皮膚完整，無脛腓骨骨折，解剖證實(shí)損傷率100%。

1.1.3動物取材與稱重

小鼠麻醉下頸椎脫位致死，迅速取雙側(cè)受損腓腸肌，對照組取相同部位腓腸肌，4℃生理鹽水漂洗，濾紙吸干稱重，其中每組右側(cè)腓腸肌制作石蠟標(biāo)本行組織形態(tài)學(xué)檢測，左側(cè)腓腸肌置于液氮中待行免疫蛋白印跡檢測（n=8）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1體重與肌肉濕重

用肌肉重量/體重來反映肌肉濕重的相對變化。

1.2.2骨骼肌組織HE染色

骨骼肌經(jīng)4%多聚甲醛固定24小時后，石蠟包埋，于腓腸肌肌腹中段處橫切3～4 μm厚的連續(xù)薄片，切片脫蠟復(fù)水，蘇木精染色，1%鹽酸-酒精分化，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。當(dāng)肌細(xì)胞核從中間遷移到肌纖維邊緣時，肌細(xì)胞成熟。將細(xì)胞核位于肌細(xì)胞中央的肌纖維作為新生未成熟的再生肌纖維。在HE染色中，計(jì)算20個隨機(jī)視野（4張片子×5個視野）中再生肌纖維占整個肌纖維的比例。

1.2.3骨骼肌組織Masson染色

切片脫蠟復(fù)水，鐵蘇木素染色，酸性乙醇分化，氨水返藍(lán)，麗春紅品紅染色，乙酸溶液洗，磷鉬酸分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。Masson三色染色后肌纖維呈紅色，膠原纖維成藍(lán)色（苯胺藍(lán)），主要用來區(qū)分肌纖維和膠原纖維，反映骨骼肌纖維化程度。在Masson染色中，計(jì)算20個隨機(jī)視野（4張片子×5個視野）中膠原纖維占整個肌纖維的比例。

1.2.4骨骼肌組織免疫組化實(shí)驗(yàn)

制作常規(guī)石蠟切片脫蠟至水；檸檬酸三鈉緩沖液（pH=6.0），抗原修復(fù)121℃，3 min；3%過氧化氫室溫孵育15 min；血清室溫封閉30 min；分別滴加一抗MyoD（兔抗小鼠1︰50，SAB4501947，Sigma公司）、Myogenin（兔抗小鼠1︰200，ab124800，abcam公司）濕盒4℃孵育過夜；滴加HRP標(biāo)記的二抗（羊抗兔IgG，Jacskon公司）濕盒37℃孵育30 min；DAB室溫顯色；蘇木精復(fù)染；常規(guī)脫水透明封片；PBS代替一抗做陰性對照；Olympus顯微鏡觀察拍照。

1.2.5骨骼肌組織免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

從-80°冰箱中取出組織，切取80 g移入Ep管中，加入預(yù)冷蛋白裂解液，超聲勻漿器低溫勻漿；4℃離心機(jī)12000 rpm離心5 min，取上清液；BCA法測定每個蛋白樣本濃度；SDS-PAGE電泳，5%濃縮膠，80 V恒壓電泳30 min，12%分離膠，120 V恒壓電泳90 min后轉(zhuǎn)至PVDF膜上；將PVDF膜于5%脫脂牛奶（TBST）中室溫封閉1 h；分別加入一抗MyoD（兔抗小鼠1︰200，SC304，Santa Cruz公司）、Myogenin（1︰1000）、GAPDH（兔抗小鼠1︰800，CST公司），4°過夜，TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記二抗（1︰3000，CST公司）室溫孵育1小時，ECL發(fā)光法檢測蛋白條帶，采用Image J分析軟件測定條帶積分光密度值。

1.2.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)處理方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。腓腸肌濕重比、再生肌纖維和膠原纖維占總肌纖維比率采用卡方檢驗(yàn)；MyoD和Myogenin蛋白水平比較采用One-way ANOVA和Tukey事后檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1骨骼肌鈍挫傷后宏觀表現(xiàn)

小鼠鈍挫傷后，損傷部位即刻充血、水腫，麻醉蘇醒后可見傷側(cè)肢體跛行嚴(yán)重。這些病理體征1 d后逐漸恢復(fù)正常。與C組相比，傷后12 h、1 d腓腸肌相對濕重增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05和P＜0.01；圖1）。

圖1　鈍挫傷后腓腸肌相對濕重變化

2.2骨骼肌鈍挫傷后不同時間點(diǎn)HE染色

HE染色結(jié)果顯示，鈍挫傷后12 h，肌外膜完整性破壞、廣泛出血、細(xì)胞間質(zhì)水腫，血管周圍大量炎性細(xì)胞滲出，損傷肌細(xì)胞變圓肥大，嚴(yán)重者可見肌纖維斷裂。傷后1 d，炎性細(xì)胞繼續(xù)滲出并遷移至挫傷部位發(fā)揮吞噬作用。肌細(xì)胞變性、壞死、細(xì)胞核消失，大部分肌細(xì)胞胞漿均質(zhì)化，胞漿伊紅淡染。傷后3 d，挫傷部壞死肌細(xì)胞及組織碎片逐漸被機(jī)體炎性細(xì)胞清除，出現(xiàn)大量新生的大小形態(tài)不一的成肌細(xì)胞，新生細(xì)胞核位于細(xì)胞中央。傷后5 d，成肌細(xì)胞進(jìn)一步增殖分化，肌絲形成，體積逐漸增大，大量成肌細(xì)胞融合形成單核或多核肌小管。傷后7 d至14 d，一方面，在損傷部位，多核肌小管數(shù)量進(jìn)一步增加，體積增大，細(xì)胞核逐漸從細(xì)胞中央遷移至細(xì)胞邊緣，分化為成熟肌細(xì)胞；另一方面，成纖維細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，形成結(jié)締組織，纖維化增加（圖2 A～G）。與傷后3 d相比，傷后5 d、7 d再生肌纖維占總肌纖維的比例均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（53.5%±7.9%、38.7%±6.8%vs.20.3%±3.6%，P＜0. 05；圖2 H）。

圖2　骨骼肌鈍挫傷后HE染色（×400）

2.3骨骼肌鈍挫傷后不同時間點(diǎn)Masson染色

傷后5 d，少量藍(lán)色膠原纖維出現(xiàn)，包繞于新生肌細(xì)胞肌間膜周圍，損傷區(qū)結(jié)締組織面積隨損傷時間推移而逐漸增多，骨骼肌完全斷裂處依靠纖維瘢痕愈合。傷后各時間點(diǎn)膠原纖維占總肌纖維的比例分別為：傷后5 d（1.5±0.9%）、7 d（2.9±1.4%）、14 d（6.4±3. 2%），各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；圖3）。

2.4骨骼肌鈍挫傷后不同時間點(diǎn)MyoD、Myogenin免疫蛋白印跡結(jié)果

MyoD和Myogenin的western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，傷后1 d MyoD蛋白水平升高至峰值（0. 94±0.12 vs.0.61±0.05，P＜0.01），然后開始下降至正常水平，至傷后14 d再次攀升至第2峰值（0.99±0. 11）。傷后12 h至1 d，與對照組比較，Myogenin蛋白水平?jīng)]有變化，傷后3 d，Myogenin蛋白水平迅速增加至峰值（1.04±0.06 vs.0.08±0.03，P＜0.01），傷后5 d，Myogenin蛋白水平開始下降，但仍高于對照組（0.36± 0.1，P＜0.05），至傷后14 d恢復(fù)到正常水平（圖4）。

圖3　骨骼肌鈍挫傷后Masson三色染色結(jié)果（×40）

圖4　骨骼肌鈍挫傷后MyoD、Myogenin蛋白水平動態(tài)變化

2.5骨骼肌鈍挫傷后不同時間點(diǎn)MyoD、Myogenin免疫組織化學(xué)結(jié)果

MyoD和Myogenin免疫反應(yīng)陽性均呈棕黃色，定位表達(dá)于細(xì)胞核。正常對照組，少量MyoD陽性細(xì)胞核位于肌細(xì)胞邊緣（圖5A），傷后12 h，MyoD陽性細(xì)胞核主要在細(xì)胞外基質(zhì)中表達(dá)（圖5B），傷后1 d，大量MyoD陽性細(xì)胞核逐漸遷移、聚集于受損骨骼肌纖維周圍（圖5C），傷后3 d、5 d、7 d僅有散在幾個MyoD陽性細(xì)胞核位于新生肌細(xì)胞周圍，傷后14 d，大量MyoD陽性細(xì)胞核位于肌細(xì)胞邊緣。正常對照組、傷后12 h、1 d和14 d均未觀察到Myogenin的陽性表達(dá)，傷后3 d，出現(xiàn)大量Myogenin陽性細(xì)胞核，表達(dá)于新生成肌細(xì)胞核上（圖6A），傷后5 d，Myogenin陽性細(xì)胞核主要在新生肌管中表達(dá)（圖6B），傷后7 d，逐漸遷移至新生肌細(xì)胞邊緣（圖6C）。

3　討論

3.1骨骼肌鈍挫傷修復(fù)過程的形態(tài)學(xué)特征分析

體育運(yùn)動中最常見的接觸性損傷——鈍挫傷，是在急性、強(qiáng)大壓縮力的作用下發(fā)生的一種非侵入性損傷。本研究所采用的模型能夠高度模擬這種閉合性損傷，可引起受損骨骼肌紅細(xì)胞滲出、水腫、肌纖維斷裂，大量炎性細(xì)胞滲出，肌衛(wèi)星細(xì)胞激活，隨后骨骼肌再生［10］。本實(shí)驗(yàn)以0.19 J的動能打擊小鼠腓腸肌，傷后12 h至1 d可見受損部位腫脹、出血，患肢跛行，傷后3 d癥狀消失，這與腓腸肌相對濕重變化趨勢相一致，與對照組比較，傷后12 h和1 d肌肉濕重分別增加了14.6%和26.9%，損傷3d后腓腸肌相對濕重恢復(fù)正常，提示本研究可誘導(dǎo)小鼠腓腸肌鈍挫傷后再生修復(fù)模型。急性骨骼肌傷后修復(fù)是一個非完整性的功能修復(fù)，可分為三個階段：損傷期、修復(fù)期和塑形期［11，12］，三個過程緊密相連并有重疊時相［13］。本研究HE染色顯示，傷后1 d損傷期內(nèi)，骨骼肌超微結(jié)構(gòu)和周圍血管廣泛破壞，導(dǎo)致肌肉內(nèi)血腫形成，激發(fā)機(jī)體自身免疫機(jī)制，釋放炎性細(xì)胞吞噬壞死肌纖維，隨后進(jìn)入傷后修復(fù)期。傷后3 d，開始出現(xiàn)大量新生成肌細(xì)胞，修復(fù)程度取決于肌肉前體細(xì)胞的激活、增殖以及分化形成多核的肌纖維，至傷后14 d，逐漸融合形成多核肌小管，最終轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒旒〖?xì)胞，然而，在骨骼肌再生修復(fù)過程中也伴隨著纖維化的形成［14］。Masson三色染色觀察到，在骨骼肌進(jìn)行再生的同時，藍(lán)染的膠原纖維從傷后5 d開始出現(xiàn)，并包繞在新生成肌細(xì)胞周圍，至傷后14 d達(dá)到峰值，此時，新生肌纖維和纖維結(jié)締組織形成微型肌—腱聯(lián)合［15，16］。以上結(jié)果提示，再生肌纖維和瘢痕結(jié)締組織二者共同完成骨骼肌鈍挫傷后的組織塑形過程，而究竟哪種修復(fù)手段占優(yōu)勢，這可能與骨骼肌損傷類型及其周圍神經(jīng)血管的損傷程度有關(guān)［17］。

圖5　骨骼肌鈍挫傷后MyoD免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×400）

圖6　骨骼肌鈍挫傷后Myogenin免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×400）

3.2骨骼肌鈍挫傷修復(fù)過程中MyoD、Myogenin的時空變化

本研究通過檢測肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的標(biāo)記物MyoD和Myogenin的分布和時間變化來研究骨骼肌急性鈍挫傷后組織修復(fù)過程的時空特點(diǎn)。MyoD可以促使靜止的肌衛(wèi)星細(xì)胞活化，快速進(jìn)入細(xì)胞周期“S”期，而MyoD基因敲除小鼠生肌前體細(xì)胞增殖能力減弱，肌肉再生不完全［18］。Myogenin在骨骼肌傷后修復(fù)尤其是最終肌細(xì)胞新生過程中起著至關(guān)重要的作用。有研究指出，損傷后，機(jī)體能夠快速誘導(dǎo)受損肌肉MyoD mRNA表達(dá)并上調(diào)其蛋白水平，即肌肉前體細(xì)胞開始表達(dá)MyoD［19］。在本研究中，鈍挫傷后12 h，MyoD蛋白水平未見明顯增加，傷后1 d迅速增至第1個峰值，然后開始迅速下降，至傷后5 d逐漸恢復(fù)至正常水平。有研究顯示，大負(fù)荷力竭運(yùn)動、離心運(yùn)動后，MyoD水平也出現(xiàn)相似的表達(dá)趨勢，但是峰值出現(xiàn)的時間不同，這可能與損傷部位、損傷類型和損傷程度不同有關(guān)［20，21］。有報道顯示處于激活增殖狀態(tài)的肌衛(wèi)星細(xì)胞從細(xì)胞周期撤退是其分化為成肌細(xì)胞的必經(jīng)步驟，Zammit等的研究顯示隨著細(xì)胞周期的結(jié)束MyoD表達(dá)也消失［22］。本研究結(jié)果提示，MyoD蛋白表達(dá)開始下降時，傷后骨骼肌便由損傷階段進(jìn)入修復(fù)階段，肌衛(wèi)星細(xì)胞從增殖狀態(tài)開始轉(zhuǎn)變?yōu)榉只癄顟B(tài)，準(zhǔn)備形成成肌細(xì)胞。其可能機(jī)制是，傷后3d，血管內(nèi)皮細(xì)胞或者單核巨噬細(xì)胞分泌大量一氧化氮，抑制MyoD表達(dá)，促進(jìn)Myogenin表達(dá)［23］。

傷后12 h，MyoD蛋白水平雖然未有變化，但是免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，傷后12 h，MyoD由正常肌細(xì)胞邊緣逐漸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外基質(zhì)中陽性表達(dá)，傷后1 d，MyoD陽性細(xì)胞核圍繞受損骨骼肌細(xì)胞高度表達(dá)，提示肌衛(wèi)星細(xì)胞在受損肌纖維殘留的基板處開始增殖，與Srikuea等的觀測結(jié)果相一致［24］。再者，本研究中MyoD蛋白水平在傷后14 d又迅速升高至最大值，呈現(xiàn)“雙峰”特征。MyoD蛋白水平迅速降低而又反彈升高的現(xiàn)象有過相關(guān)報道［25］。至于MyoD在再增加階段的作用，有學(xué)者指出MyoD水平的上調(diào)發(fā)生在失神經(jīng)肌肉［26］和完好的老年肌組織［27］。Launay研究顯示，失神經(jīng)支配的肌肉組織中MyoD蛋白水平在傷后8 d再一次升高，表明此階段MyoD可能在神經(jīng)肌肉接點(diǎn)形成中發(fā)揮作用［28］。MyoD在骨骼肌恢復(fù)后期階段的確切作用還不得而知，在本研究中，骨骼肌傷后再生后期階段MyoD蛋白水平降低后再升高是否也參與神經(jīng)肌肉接點(diǎn)處運(yùn)動神經(jīng)纖維的功能恢復(fù)，還有待本課題組的后續(xù)研究。

有報道顯示Myogenin參與肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化，尤其是成肌細(xì)胞融合形成肌管的過程［29］。體外研究顯示當(dāng)Myogenin轉(zhuǎn)錄到達(dá)峰值時，肌管形成，出現(xiàn)肌球蛋白，隨后，Myogenin開始迅速下降。本研究中，WB結(jié)果顯示Myogenin蛋白表達(dá)的時間變化為，傷后12 h、1 d，Myogenin蛋白水平未有明顯變化，傷后3 d到達(dá)峰值，隨后逐漸下降至正常水平，并且Myogenin峰值出現(xiàn)時間與MyoD蛋白水平迅速下降時間相吻合，再一次證明肌衛(wèi)星細(xì)胞由增殖階段進(jìn)入分化階段。Myogenin蛋白水平迅速增多可能與巨噬細(xì)胞功能有關(guān)，研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞可促進(jìn)肌肉前體細(xì)胞“逃離”細(xì)胞凋亡，協(xié)助肌衛(wèi)星細(xì)胞促進(jìn)肌肉成長，并且通過與粘附分子結(jié)合更大程度上促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化［30］。

另外，免疫組織化學(xué)染色觀察發(fā)現(xiàn)，傷后3 d，大量Myogenin陽性細(xì)胞核與新生成肌細(xì)胞核共表達(dá)，并且首次觀測到含有兩個或兩個以上細(xì)胞核的再生肌細(xì)胞（肌管），傷后5 d，肌管開始廣泛形成，同時，Myogenin轉(zhuǎn)移至肌管中表達(dá)，隨損傷時間的增加逐漸遷移到新生肌細(xì)胞邊緣，至傷后14 d，Myogenin恢復(fù)至正常水平，檢測不到，說明肌衛(wèi)星細(xì)胞分化完全，重新回復(fù)到靜息狀態(tài)，完成骨骼肌再生塑形過程。

4　結(jié)論

急性骨骼肌鈍挫傷后，新生肌纖維和纖維化瘢痕愈合共同完成修復(fù)過程。MyoD和Myogenin作為肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的標(biāo)志物，二者參與挫傷后的修復(fù)過程，具有一定時空特點(diǎn)。MyoD在骨骼肌鈍挫傷后再生后期階段的確切作用，還有待進(jìn)一步研究。

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The Role of MyoD and Myogenin in the Healing Process of Acute Skeletal Muscle Contusion

Liu Yu1，2，Xiao Weihua1，Luo Beibei1，3，Chen Peijie1
1 College of Exercise and Sports Science，Shanghai University of Sport，Shanghai，China 200438 2 College of Exercise and Sport Science，Shenyang Sport University，Liaoning，China 110102 3 Department of cell biology，Second Military Medical University，Shanghai，China 200433 Corresponding Author：Chen Peijie，Email：chenpeijie@sus.edu.cn

Objective To observe the repairing process of skeletal muscles after acute contusion and the role of MyoD and myogenin during the process.Methods Acute contusion of gastrocnemius was established in 48 C57BL/6 mice（contusion group）.Another 8 C57BL/6 mice were served as control group.Every 8 of the mice in contusion group were respectively sampled 12 hours，1 day，3 days，5 days，7 days and 14 days after the contusion.H.E.staining and Masson trichrome staining were used to observe the muscular regeneration and fibrosis formation process.Western Blotting and immunohistochemistry were applied to detect the changes in the level and expression of MyoD and myogenin.Results（1）Newly born myoblasts appeared 3 days and collagenous fibers appeared 5 days after the contusion.（2）The peak expression of MyoD was observed 1 day and 14 days after the contusion.MyoD-positive myonuclei expressed along the margin of the normal muscle cells，and gradually migrated into the injured fibers.（3）The peak expression of myogenin appeared 3 days after the contusion.Conclusions There is chronological expression of MyoD and myogenin after the acute contusion of skeletal muscles.Newly born centrally nucleated fibers and fibrosis are both involved in the skeletal muscle regeneration after contusion.

skeletal muscle，contusion，MyoD，myogenin

2015.07.01

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31271273，31300975）；遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2014465，L2014469）；上海體育學(xué)院研究生教育創(chuàng)新項(xiàng)目（yjscx2015009）

陳佩杰，Email：chenpeijie@sus.edu.cn