王代鋼 楊金宏 黎歡吉

摘要：應(yīng)用BmNPV直接PCR診斷技術(shù)研究家蠶幼蟲后期微量感染BmNPV后蛹體內(nèi)BmNPV垂直傳播侵染模式。結(jié)果表明：蛹體內(nèi)BmNPV侵染模式為感染致死與感染非致死兩種受害狀態(tài)相混模式。感染致死受害狀態(tài)具有典型病癥表現(xiàn)，與幼蟲感染模式相同，未構(gòu)成BmNPV病害垂直傳播途徑。感染非致死受害狀態(tài)無典型病癥表現(xiàn)，蛹體外觀與正常健康蛹體相同，能繼續(xù)發(fā)育羽化成蟲產(chǎn)卵，成為BmNPV病害垂直傳播的隱疑途徑，對蠶種安全構(gòu)成潛在危害。

關(guān)鍵詞：家蠶；血液型膿??；核型多角體病毒（NPV）；蛹體；垂直傳播途徑

中圖分類號：S884.5+1文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）09-0119-05

AbstractThe vertical transmission infection mode of BmNPV in Bombyx mori pupa after micro-infection of BmNPV at late larval stage was researched using direct PCR diagnostic technique. The results showed that the infection mode of BmNPV in pupa was the mixed mode of two damage states of lethal infection and non-lethal infection. The lethal infection damage state showed typical symptoms same as larvae infection mode， which did not form the vertical transmission channel of BmNPV disease. While the non-lethal infection damage state showed no typical symptoms. The pupa had normal appearance same as healthy pupa， which could continue to eclosion and oviposition. This channel was the doubtful vertical transmission channel of BmNPV disease， and it owned potential harm to the security of silkworm eggs.

KeywordsBombyx mori； Nuclear polyhedrosis； Nuclear polyhedral virus； Pupa； Vertical transmission channel

家蠶是具有重要經(jīng)濟價值的鱗翅目昆蟲，中國蠶絲業(yè)是最具特色的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，蠶繭生絲產(chǎn)量已占世界總產(chǎn)量80%左右。家蠶血液型膿病是制約蠶桑生產(chǎn)的重大病害，占家蠶病害損失量七成以上，其病原是家蠶核型多角體病毒（BmNPV），它能夠在家蠶幼蟲期和蛹期發(fā)生危害，嚴(yán)重時成毀滅性流行危害。家蠶血液型膿病流行危害目前還沒有理想的化學(xué)藥物防治技術(shù)，只能實施養(yǎng)蠶環(huán)境消毒和淘汰典型病癥蠶等技術(shù)措施來盡量減少病害損失[1]。

依據(jù)家蠶組織病理學(xué)方法，只有在幼蟲或蛹體的血液里觀察到有BmNPV多角體存在時才能確診為家蠶血液型膿病，目前尚未在家蠶成蟲或卵內(nèi)發(fā)現(xiàn)有BmNPV多角體。有研究認(rèn)為BmNPV只存在環(huán)境污染食下侵染的水平傳播侵染模式，不存在個體生殖的垂直傳播侵染模式[2]，并將BmNPV基因序列分析結(jié)果、抗BmNPV遺傳規(guī)律和控制環(huán)境污染食下侵染傳播途徑作為防控技術(shù)研發(fā)的依據(jù)[3，4]，在BmNPV早期診斷技術(shù)和抗BmNPV蠶品種選育上做了大量的防控家蠶血液型膿病實用技術(shù)研究[5，6]。針對家蠶血液型膿病是否存在通過個體生殖途徑的垂直傳播侵染模式，本研究應(yīng)用了BmNPV直接PCR診斷技術(shù)，開展家蠶幼蟲后期微量感染BmNPV后蛹體內(nèi)BmNPV垂直傳播侵染模式研究，證實家蠶幼蟲后期微量感染對形成BmNPV病害垂直傳播途徑具有關(guān)鍵作用，為阻斷BmNPV垂直傳播途徑、防控家蠶血液型膿病流行危害提供技術(shù)研發(fā)理論支持。

1材料與方法

1.1攻毒液制備

取本實驗室保存的BmNPV（AK株）多角體稀釋液2.5×1010個/mL添食4齡起蠶，復(fù)壯增殖BmNPV多角體。于5齡起蠶后收集典型BmNPV病癥蠶，剪去病蠶尾角采集血液樣品。用CHCl3分解血液樣品中的脂肪球等血細(xì)胞，無菌水反復(fù)差速離心去除雜質(zhì)，獲BmNPV多角體母液置于4℃保存待用。

攻毒試驗當(dāng)日將BmNPV多角體母液放入25～27℃水浴30 min，無菌水離心去除雜質(zhì)2次，配制成2.5×1010、2.5×109、2.4×108、2.3×107、2.5×106、2.4×105個/mL等多種BmNPV多角體濃度的攻毒液。

1.2幼蟲微量攻毒

將家蠶原種871（中系）和872（日系）正常飼養(yǎng)至5齡后期，選體健無病材料蠶幼蟲，分別添食6種濃度的BmNPV多角體攻毒液，設(shè)添食無菌水對照（清水CK）和無任何添食對照（空白CK）。2個原種共設(shè)16個試驗處理，每處理100頭幼蟲，重復(fù)3次。為避免在病毒檢測時形成試驗高峰，2個原種的幼蟲微量攻毒試驗錯時2 d進行。

在幼蟲臨上蔟前最后一次給桑時，取1 mL攻毒液均勻涂抹于新鮮成熟桑葉表面，室溫晾干，切細(xì)絲添食，幼蟲食下攻毒桑葉后不再給桑，2～4 h后正常上蔟結(jié)繭。

1.3蛹體感染調(diào)查

上蔟3 d后采削繭取出蠶蛹平攤置23～25℃中，逐日調(diào)查各試驗處理的蠶蛹死亡數(shù)，對死蛹鏡檢BmNPV多角體并確診。上蔟15 d后抽取存活蠶蛹樣品用直接PCR法檢測存活蛹體內(nèi)BmNPV感染狀態(tài)。當(dāng)試驗處理存活蛹合并數(shù)不足100頭時抽取1/2存活蛹進行感染檢測；當(dāng)存活蛹合并數(shù)多于100頭時抽取50頭存活蛹檢測；存活蛹合并數(shù)多于250頭時抽取60頭存活蛹檢測。未被抽取的存活蛹用于后續(xù)成蟲感染試驗。

1.4直接PCR檢測法

BmNPV多角體蛋白基因（polyhedron，polh）為桿狀病毒所特有，polh基因序列長為738 bp，編碼246個氨基酸，預(yù)測分子量為28.85 kD。比較分析發(fā)現(xiàn)，polh基因序列與家蠶基因組序列同源性低，有較高的特異性，能夠在有家蠶基因組存在的情況下進行polh基因的特異性擴增，可以用家蠶組織樣品直接PCR法檢測BmNPV。設(shè)計引物序列polh f：5′-ATGCCGAATTATTCATACACCCC-3′；polh r：5′-TAATACGCCGGACCAGTGAACAG-3′。

用75%乙醇擦拭蛹體體表，以防體表污染影響試驗。從蛹體背部刺取10 μL蛹體血液到1.5 mL離心管中，加入0.5 mL 75%乙醇渦旋1 min，再10 000 r/min離心1 min，倒去上清液，空氣中干燥5 min去除乙醇?xì)埩?，再加?0 μL TE充分溶解。

PCR反應(yīng)體系為25 μL，含KCl 50 mmol/L，Tris（pH 8.3） 10 mmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTPs 200 μmol /L（每種），擴增引物0.4 μmol/L（每種），Taq DNA polymerase 1 U，A 0.1 μg/μL，DNA 模版2 μL，ddH2O（pH 7.0）補充至總體積25 μL。該反應(yīng)體系與常規(guī)PCR反應(yīng)體系相比，其中加入了抗PCR反應(yīng)抑制物BSA。擴增程序為95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；55℃退火45 s；72℃延伸55 s，30個循環(huán)后72℃終延伸10 min。擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，1%溴化乙錠染色，紫外燈照射觀察，Marker為TAKARA的DL2000。

2結(jié)果與分析

2.1蛹期BmNPV感染致死結(jié)果

在幼蟲5齡臨上蔟時攻毒微量BmNPV多角體依然可致蛹體感染BmNPV病害致死，感染致死數(shù)量與攻毒BmNPV多角體量相關(guān)。攻毒量為2.5×1010個/mL時，蛹體15 d死亡率可達87.83%，屬重度感染致死狀態(tài)；攻毒量為2.4×105個/mL時，蛹體15 d死亡率僅為2.17%，與正常飼養(yǎng)條件下自然感染致死狀態(tài)相當(dāng)（表1）。

家蠶對BmNPV侵染表現(xiàn)為敏感受害結(jié)果，即使在幼蟲后期微量感染BmNPV對蛹體的侵害后果同樣嚴(yán)重。在不同攻毒濃度間和不同原蠶品系間形成的蛹期受害模式雖有差異，但共同特征明顯，與幼蟲期受害模式特征截然不同。

2.3.1不同攻毒濃度間的受害模式蛹體在微量感染BmNPV后，不同攻毒濃度處理都能致蛹體死亡，在蛹期6～8 d形成蛹體死亡高峰期，90%～98%蛹體死亡發(fā)生在蛹期5～10 d內(nèi)，蛹體連續(xù)死亡集中在蛹期14 d前，到蛹期15 d后各處理均未發(fā)生蛹體連續(xù)死亡，出現(xiàn)了受害死亡中止現(xiàn)象。這與幼蟲期受害模式不同，幼蟲受BmNPV侵染后連續(xù)死亡現(xiàn)象在攻毒15 d后依然持續(xù)發(fā)生，直至所有受害幼蟲全部死亡為止，沒有出現(xiàn)受害死亡中止現(xiàn)象。

2.3.2不同原蠶品系間的受害模式試驗用中系原蠶871與日系原蠶872是生產(chǎn)一代雜交種的對交種，在飼養(yǎng)條件基本相同下，中系與日系原蠶的受害模式雖有差異，但共同特征也很明顯。

原蠶871在幼蟲臨上蔟時攻毒BmNPV多角體后，在蛹期6～7 d出現(xiàn)蛹體死亡高峰期。攻毒濃度較高處理的蛹體連續(xù)死亡集中在蛹期5～10 d內(nèi)，到蛹期13 d后出現(xiàn)受害死亡中止現(xiàn)象。攻毒濃度較低或自然感染處理的蛹體連續(xù)死亡集中在蛹期5～8 d內(nèi)，到蛹期10 d后同樣出現(xiàn)受害死亡中止現(xiàn)象。

原蠶872的蛹體死亡高峰期出現(xiàn)在蛹期7～8 d時。攻毒濃度較高處理的蛹體連續(xù)死亡同樣集中在蛹期5～10 d內(nèi)，直到蛹期15 d后才出現(xiàn)受害死亡中止現(xiàn)象。而攻毒濃度較低或自然感染處理的蛹體連續(xù)死亡也集中在蛹期5～8 d內(nèi)，到蛹期11 d后出現(xiàn)受害死亡中止現(xiàn)象。

不同家蠶原蠶品系蛹體在連續(xù)死亡和受害死亡中止現(xiàn)象發(fā)生時間上表現(xiàn)略有不同。兩者比較，原蠶中系的蛹體連續(xù)死亡發(fā)生時間較原蠶日系更為集中，受害死亡中止現(xiàn)象也較為提早發(fā)生。

3討論與結(jié)論

3.1感染致死與非致死兩種受害狀態(tài)相混的侵染模式

在家蠶幼蟲5齡臨上蔟時微量感染BmNPV后，蛹體組織器官因變態(tài)而發(fā)生劇變，改變了BmNPV復(fù)制增殖和形成多角體的環(huán)境條件，部分蛹體內(nèi)的病毒多角體數(shù)量未達到致死水平，蛹體外觀也無BmNPV病害典型癥狀表現(xiàn)，呈現(xiàn)出感染致死與感染非致死兩種受害狀態(tài)相混的侵染模式。感染致死狀態(tài)的蛹體在蛹期5～8 d內(nèi)大量死亡，10～13 d內(nèi)全部致死，感染非致死狀態(tài)的蛹體能夠繼續(xù)發(fā)育羽化成蟲，完成個體生命周期，造成蛹體BmNPV病害痊愈的假象。

家蠶幼蟲感染BmNPV后通常表現(xiàn)出感染致死典型病癥一種侵染模式，即使在幼蟲5齡臨上蔟時感染大量BmNPV后，蛹體侵染模式也與幼蟲相同。感染非致死無典型病癥侵染模式只有用PCR檢驗法才能被發(fā)現(xiàn)。如果僅以感染致死典型病癥作為蛹體BmNPV病害確診標(biāo)準(zhǔn)，就會忽視感染非致死無典型病癥侵染模式，致使BmNPV在家蠶蛹體內(nèi)存留潛伏，進而放任感染非致死無典型病癥，蛹體進入到羽化成蟲產(chǎn)卵環(huán)節(jié)，可使一代雜交普通種成為BmNPV病害初傳染源。

3.2微量感染模式是BmNPV病害垂直傳播的關(guān)鍵因素

在家蠶幼蟲5齡臨上蔟時微量感染BmNPV不能致所有受害蛹體死亡，感染非致死無典型病癥的蛹體外觀上與正常健康蛹體相同，還能繼續(xù)發(fā)育羽化成蟲產(chǎn)卵，但其蛹體內(nèi)BmNPV感染率在54.17%以上，構(gòu)成了BmNPV病害垂直傳播的隱疑途徑。所以，微量感染模式所產(chǎn)生的感染非致死無典型病癥蛹體是構(gòu)成BmNPV病害垂直傳播途徑的關(guān)鍵因素。

家蠶幼蟲微量感染BmNPV的幾率很小，感染致死典型病癥侵染模式就成為了確診BmNPV病害發(fā)生的標(biāo)準(zhǔn)。由微量感染模式引起的蛹體受害死亡中止現(xiàn)象和感染非致死無典型病癥現(xiàn)象很容易被誤認(rèn)為是BmNPV病害痊愈的結(jié)果，誤將15 d存活蛹認(rèn)作健康蛹體而通過調(diào)查評鑒環(huán)節(jié)。在抗BmNPV蠶品種選育中感染非致死無典型病癥侵染模式，將會混淆基因抗性滅活作用和個體耐受作用，可致抗BmNPV蠶品種始終攜帶BmNPV，危害蠶品種安全；如果在種繭育中不加以識別和及時淘汰感染非致死無典型病癥蛹體，會將含有BmNPV的一代雜交普通種發(fā)放到農(nóng)村，對農(nóng)村小蠶共育和絲蠶繭育安全產(chǎn)生嚴(yán)重危害。參考文獻：

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