李夢(mèng)茜++蔡永振++嚴(yán)茗

摘要：從木論喀斯特森林保護(hù)區(qū)土壤中分離獲得1株對(duì)家蠶敗血病病原具有顯著拮抗作用的菌株，并研究其對(duì)家蠶敗血病的抑菌效果，以期為新型微生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。拮抗菌株的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)敗血菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，抑菌圈直徑平均為22.60 mm，抗菌發(fā)酵液最大稀釋倍數(shù)可達(dá)60倍。根據(jù)菌株的形態(tài)特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析對(duì)其鑒定為Paenibacillus polymyxa，命名為Paenibacillus polymyxa HC2015。

關(guān)鍵詞：家蠶；敗血病；拮抗菌；抑菌作用

中圖分類(lèi)號(hào)： S884.4+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0328-02

細(xì)菌、真菌、病毒分別為家蠶疾病的三大病原。家蠶敗血?。˙acterial septicemia）是很?chē)?yán)重的細(xì)菌病害，目前主要以化學(xué)藥品防治敗血病。大量使用化學(xué)藥品易導(dǎo)致環(huán)境污染并威脅人體健康，因此采用生物制品取代化學(xué)藥品是大勢(shì)所趨。篩選家蠶病原物拮抗菌對(duì)生態(tài)蠶業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

目前，拮抗菌研究的重要性已日益凸出，學(xué)者從土壤、水、植物體內(nèi)篩選分離拮抗菌菌株，并證實(shí)其在生物防治、促進(jìn)生物健康發(fā)育等多個(gè)方面具有利用價(jià)值[1-3]。然而，生物防治主要應(yīng)用于植物病害，關(guān)于動(dòng)物病害防治的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者所在課題組從木論喀斯特森林保護(hù)區(qū)土壤中篩選出1株對(duì)家蠶敗血病病原具有顯著拮抗作用的菌株，且其抑菌譜較廣，對(duì)金黃色葡萄球菌、家蠶病原菌敗血菌、蘇云金芽孢桿菌、黑霉菌、大腸桿菌等多種動(dòng)植物病原菌均有較強(qiáng)的拮抗作用。本試驗(yàn)檢測(cè)了A-02菌株對(duì)家蠶敗血病的拮抗作用，以期為新型蠶桑用微生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

家蠶敗血菌（Bacterial septicemia）由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，家蠶敗血病菌病原拮抗菌菌株從木論喀斯特森林保護(hù)區(qū)土壤中篩選獲得。

1.2菌懸液制備及分離培養(yǎng)

稱(chēng)取土壤10 g，于滅菌研缽中研碎，將100 mL無(wú)菌水加入滅菌研缽，振蕩10～20 min，即為10-1的土壤懸液；靜置 5～10 min，吸取上清液1 mL，依次梯度稀釋?zhuān)謩e配制10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等不同濃度的稀釋液。取0.1 mL懸液均勻涂布于培養(yǎng)皿中，待表面干燥后，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4～5 d，根據(jù)菌落的大小、形狀、邊緣形狀、表面結(jié)構(gòu)、光澤、透明度、顏色等微生物菌落特征挑出單菌落并編號(hào)。

1.3拮抗性能的檢測(cè)

采用平板對(duì)峙法檢測(cè)菌株拮抗，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，于28 ℃下培養(yǎng)45 d。依據(jù)病原菌與拮抗菌之間的距離判斷拮抗作用大小，保留拮抗效果優(yōu)良的菌株。

采用平板擴(kuò)散法檢測(cè)發(fā)酵液活性，利用PDA 液體培養(yǎng)基，于28 ℃下培養(yǎng)16～24 h，記錄發(fā)酵液擴(kuò)散形成抑菌圈的最大稀釋倍數(shù)。篩選拮抗效果和發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株。

1.4菌體形態(tài)特征及生理生化指標(biāo)的測(cè)定

菌體形態(tài)及最適pH值測(cè)定、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)測(cè)試、淀粉水解、V. P試驗(yàn)及葡萄糖、蔗糖、山梨醇、木糖、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)均參照相關(guān)文獻(xiàn)中的方法[4]進(jìn)行。

1.516S rDNA序列測(cè)定及其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

16S rDNA序列PCR測(cè)定以通用的27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3、1492R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′為引物，以提取的總DNA為模板。PCR技術(shù)擴(kuò)增16S rDNA序列的反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增出16S rDNA后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，經(jīng)DNA膠回收試劑盒純化后，直接郵寄至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)分析，并篩選出9株菌株16S rDNA的全序列，采用ClustalW軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的分離篩選

經(jīng)拮抗性能檢測(cè)篩選到1 株對(duì)家蠶病原菌（金黃色葡萄球菌、黑霉菌、大腸桿菌）均有較強(qiáng)拮抗作用的菌株，編號(hào)為 A-02。該菌株對(duì)敗血病菌的抑制效果較強(qiáng)，抑菌圈直徑平均為22.60 mm，抗菌發(fā)酵液最大稀釋倍數(shù)可達(dá)到60倍（圖1）。由表1可知，A-02菌株及其發(fā)酵液對(duì)敗血病菌、蘇云金桿菌的拮抗作用最強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌、黑霉菌、大腸桿菌也有一定拮抗作用；發(fā)酵液稀釋40～60倍時(shí)，對(duì)上述病原菌的拮抗作用仍明顯，可見(jiàn)該菌株的發(fā)酵性能良好。

2.2拮抗菌培養(yǎng)形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果

A-02菌株在PDA培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)的菌落特征為乳白色菌落、有光澤、菌落光滑、半透明。A-02菌株革蘭氏染色為陽(yáng)性；芽孢為橢圓型，菌體形態(tài)為桿狀，芽孢、細(xì)胞壁革蘭氏染色均為陽(yáng)性。

2.3生理生化特征

A-02菌株為好氧菌，可于厭氧條件下生長(zhǎng)。菌體受pH值影響不大，在pH值5～9區(qū)間培養(yǎng)抑菌效果良好（圖2）。不能利用天門(mén)冬素培養(yǎng)基作為氮源，可利用無(wú)機(jī)氮源。A-02 菌株過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)有氣泡產(chǎn)生，為陽(yáng)性；甲基紅試驗(yàn)為黃色，呈陰性反應(yīng)；氧化酶試驗(yàn)為陽(yáng)性；脲酶試驗(yàn)為陰性反應(yīng)；吲哚試驗(yàn)為陰性反應(yīng)；葡萄糖、蔗糖、山梨醇、木糖、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)反應(yīng)為陽(yáng)性；水解淀粉試驗(yàn)為陽(yáng)性反應(yīng)，表明該菌株可分解淀粉；該菌株可使明膠液化；V. P試驗(yàn)呈紅色，為陽(yáng)性反應(yīng)。

2.4系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建與分析

將測(cè)序所得A-02菌株的16S rDNA堿基序列于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST上進(jìn)行比對(duì)，選取9株同源性高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。A-02菌株以100%的同源性屬于Paenibacillus polymyxa。

根據(jù)形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)，鑒定該菌株屬于多黏類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa），依據(jù)系統(tǒng)命名法將其命名為Paenibacillus polymyxa HC2015。

3討論

化學(xué)藥物的過(guò)量使用使病原病害產(chǎn)生惡性抗藥性，破壞生態(tài)環(huán)境，研發(fā)高效、安全的生物藥物是大勢(shì)所趨[5-6]。生物藥物的廣泛利用須滿(mǎn)足遺傳穩(wěn)定性、抗逆性2個(gè)必備條件，而A-02 菌株的遺傳穩(wěn)定性與抗逆性滿(mǎn)足生物藥物的要求。通過(guò)16S rDNA的序列同源性、菌株形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)鑒定該菌株為多黏類(lèi)芽孢桿菌。由于A-02菌株高產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)，是一種較好的拮抗菌，對(duì)動(dòng)植物病原菌具有較強(qiáng)的抑制活性，起到抗病作用。本研究對(duì)于探索家蠶病原物的生物防治方法以及蠶業(yè)發(fā)展具有重要意義。

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