孫亞玲 陳立 劉冰江 繆軍 孔素萍 高莉敏 曹辰興 吳雄 楊妍妍 霍雨猛

摘要：蔥屬蔬菜作物（洋蔥、大蔥、大蒜和韭菜等）各組織部位富含多糖等次生代謝物質(zhì)，嚴(yán)重影響了RNA的提取質(zhì)量。本研究以洋蔥葉片為樣本，對多種RNA提取方法進(jìn)行了比較分析，獲得了一套適合蔥屬蔬菜作物RNA提取的系統(tǒng)方法。該方法將CTAB-GT連用、蛋白酶K替代DEPC和冰浴電泳檢測相結(jié)合，其所提取的RNA樣本產(chǎn)量約為152.35 μg/gFW，RNA完整性RIN值約為7.5，條帶清晰，無多糖、蛋白質(zhì)和DNA殘留，28S約為18S兩倍，提取過程安全無強(qiáng)致癌物質(zhì)DEPC，可滿足下游RNA分子實驗的要求。且該方法適合于大蔥、洋蔥、大蒜和韭菜不同組織部位樣本RNA的提取。

關(guān)鍵詞：蔥屬蔬菜；RNA提??；多糖；CTAB-GT

中圖分類號：S633+Q781文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）09-0006-05

AbstractAllium vegetables （including Allium cepa， Allium fistulosum L. var. giganteum Makion， Allium sativum and Allium tuberosum Rottl. ex Spreng） are rich in polysaccharides and other secondary metabolites， which seriously affect the quality of extracted RNA. In this study， we compared and analyzed a variety of RNA extraction methods using onion leaves as samples， and obtained a set of method for RNA extraction from Allium vegetables. This method was comprised of CTAB-GT， Proteinase K instead of DEPC and ice bath gel electrophoresis. The yield of RNA samples was about 152.35 μg/gFW， the RNA integrity （RIN value） was about 7.5， the bands of gel electrophoresis were clear without contaminations of polysaccharides， protein and DNA residues， the ratio of 28S/18S was about 2 and the extraction process was safe without strong carcinogen of DEPC. The RNA quality was suitable for downstream molecular experiments. Besides， this method could be applied to the extractions of different tissues of welsh onion， onion， garlic and Chinese chives.

KeywordsAllium vegetables； RNA extraction； Polysaccharides； CTAB-GT

洋蔥、大蔥、大蒜和韭菜在APGⅢ分類系統(tǒng)中均為天門冬目石蒜科蔥亞科蔥屬蔬菜作物，廣泛種植于世界各地。它們不僅是人們餐桌上必備的香辛和調(diào)味蔬菜，而且具有重要的醫(yī)療保健價值。洋蔥、大蔥和大蒜耐儲運，是我國重要的出口創(chuàng)匯蔬菜，而韭菜是人們逢年過節(jié)的傳統(tǒng)蔬菜[1]。

分類學(xué)上的一致性，使得它們都具有巨大的基因組[2]，各組織部位都含有豐富的多糖物質(zhì)[3]。多糖的理化性質(zhì)與RNA極為相似，在沉淀RNA時，多糖也會隨之沉淀，嚴(yán)重影響了RNA的提取質(zhì)量。而多糖去除不凈將嚴(yán)重影響RNA高通量測序分析、Northern雜交分析、RT-PCR、cDNA文庫構(gòu)建等下游的分子生物學(xué)操作[4]。傳統(tǒng)提取RNA的方法有熱酚法[5，6]、異硫氰酸胍法[7]、CTAB法[8，9]、SDS法[10，11]等，這些方法均具有各自的優(yōu)缺點，單一的方法無法滿足蔥屬蔬菜作物高質(zhì)量RNA提取的需求。DEPC作為RNase清除劑廣泛應(yīng)用于RNA提取過程中，但其本身是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)，存在嚴(yán)重的安全隱患[12]。此外，DNA殘留也是蔥屬蔬菜作物高質(zhì)量RNA提取的難點。

針對上述問題，本研究將經(jīng)典的CTAB法和異硫氰酸胍（GT）法有機(jī)結(jié)合起來，利用CTAB法去除多糖、酸性GT試劑（主要包含異硫氰酸胍）去除DNA污染以及低濃度的蛋白酶K（1 μg/mL）作為RNase清除劑替代強(qiáng)致癌物質(zhì)DEPC[12]，對蔥屬蔬菜作物進(jìn)行RNA提取，以期獲得高質(zhì)量的RNA樣本。

1材料與方法

1.1試驗材料

洋蔥、大蔥、大蒜和韭菜的葉片、鱗莖和花蕾，均取自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉試驗基地，液氮速凍后-80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑

蛋白酶K購置于寶生物工程（大連）有限公司，提取用生化試劑購置于生工生物工程（上海）股份有限公司，RT-PCR相關(guān)試劑購置于北京全式金生物技術(shù)有限公司。主要試劑配制方法：（1）RNA處理水：50 μL蛋白酶K（20 mg/mL）溶于1 L超純水中，至終濃度為1 μg/mL；（2）LiCl溶液（8 mol/L）：17 g LiCl溶于50 mL RNA處理水；（3）CTAB提取液：0.25 mol/L Tris-HCl （pH 8.0），0.05 mol/L EDTA （pH 8.0），2.5 mol/L NaCl，2%CTAB，3%PVP-40，使用時加入巰基乙醇至終濃度為0.2%；（4）GT變性液：稱取0.7764 g檸檬酸鈉，溶解于50 mL水中（此時pH約為9.5左右），用鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.0，鹽酸用量約為35 μL，加入0.528 g十二烷基肌氨酸鈉，高溫滅菌后加入異硫氰酸胍50 g，巰基乙醇0.2 mL，8-羥基喹啉0.1 g，定容至100 mL。

1.3提取方法

1.3.1改良CTAB法[8，9]（1）取供試組織材料液氮研磨并將粉末轉(zhuǎn)移到CTAB裂解液（w∶v為1∶5）中，用時提前加入β-巰基乙醇至0.2%，渦旋混勻60 s，65℃水浴5～10 min，每隔2 min混勻一次，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），靜置2～5 min；（2）12 000 r/min 4℃離心10 min，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中，加入1/3體積8 mol/L LiCl，-20℃沉淀至少30 min；（3）12 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，RNA沉于管底；（4）75%乙醇渦旋洗滌，12 000 r/min 4℃離心5 min，重復(fù)（4）后，室溫干燥5 min，用高溫處理的蛋白酶K水溶解。

1.3.2改良GT法[7]（1）取供試組織材料液氮研磨并將粉末轉(zhuǎn)移到GT 變性液（w∶v為1∶5）中，用時提前加入β-巰基乙醇至0.2%，渦旋混勻60 s，室溫放置5～10 min，加入1/10體積的2 mol/L醋酸鈉（pH=4.0）劇烈混勻，加入與裂解液等體積的水飽和酚劇烈混勻，靜置2～5 min，加入1/5體積氯仿∶異戊醇（24∶1）劇烈混勻，靜置2～5 min；（2）12 000 r/min 4℃離心10 min，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中，加入等體積的異丙醇，靜置5～10 min；以下同1.3.1中的（3）和（4）。

1.3.3GT-CTAB連用法將1.3.2改良GT法（3）中獲得的RNA沉淀，用75%乙醇洗滌一次，加入CTAB裂解液約600 μL于65℃水浴溶解，再下同1.3.1。

1.3.4CTAB-GT連用法將1.3.1改良CTAB法（3）中獲得的RNA沉淀，用75%乙醇洗滌一次，加入GT裂解液約600 μL于室溫溶解，再下同1.3.2。

1.4檢測方法

瓊脂糖凝膠電泳檢測，將電泳槽置于含冰水混合物的容器中，進(jìn)行普通TBE瓊脂糖凝膠電泳，電壓20 V/cm，電泳25 min，EB染色，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照。采用安捷倫2100芯片生物分析儀檢測RNA完整性、OD值及濃度。

2結(jié)果與分析

2.1四種提取方法對洋蔥葉片總RNA提取質(zhì)量的影響

由圖1可以看出，四種方法均能夠提出洋蔥葉片的總RNA，GT和CTAB法點樣孔中存在大量的多糖或蛋白質(zhì)雜質(zhì)，特別是GT法中點樣孔更亮，而且所提取的樣本粘稠，推測為多糖；CTAB法中雖然LiCl能選擇性地沉淀RNA，然而樣本中仍然存在大量的DNA殘留，這也是許多文獻(xiàn)中報道的LiCl沉淀RNA后必須用DNase處理樣本的原因[8]。為了驗證LiCl對DNA也具有沉淀效果，我們將一份DNA溶液平均分成兩份（各300 μL），其中一份用經(jīng)典的異丙醇沉淀法沉淀DNA，另一份用1/3體積即100 μL 8 mol/L的LiCl進(jìn)行沉淀，結(jié)果（圖2）表明，異丙醇和LiCl均能有效地沉淀DNA，異丙醇沉淀DNA的效率大于LiCl。

GT-CTAB和CTAB-GT法連用時獲得了高質(zhì)量RNA樣本，然而在進(jìn)行實際操作時，GT法獲得的沉淀由于含有大量的多糖、蛋白質(zhì)以及其他次生代謝產(chǎn)物很難溶解，而CTAB法獲得的沉淀卻極易溶解，因此，后續(xù)試驗采用了CTAB-GT法。由圖1還可以看出，GT法中5S rRNA的亮度顯著高于LiCl沉淀的其他樣本，這也表明LiCl對低分子量RNA的沉淀效率明顯低于高分子量樣本。

由表1可以看出，四種方法提取的RNA樣本，其RIN（RNA Integrity Number）值均大于7.0，28S/18S均不小于1.4，基本達(dá)到了后續(xù)試驗（特別是高通量測序）的要求。前兩種方法28S/18S值較低的原因可能是蛋白質(zhì)去除不徹底導(dǎo)致其干擾了測定結(jié)果或者部分RNA樣本發(fā)生了降解。從OD260/OD280和OD260/OD230比值可以得出，GT法所獲得的RNA中存在大量的多糖干擾，而CTAB法獲得的RNA存在蛋白質(zhì)或者鹽離子污染。從濃度和產(chǎn)率來分析，GT法最高，之后依次是CTAB、CTAB-GT和GT-CTAB，在后兩種方法中產(chǎn)率的差異可能是GT法中沉淀產(chǎn)物很難溶解造成的。從樣品狀態(tài)可以看出，GT和CTAB法提取的RNA均為粘稠狀態(tài)。而圖1中的CTAB法提取的RNA，存在大量的DNA污染，因此GT和CTAB法單獨使用所獲得的RNA均不適合后續(xù)高質(zhì)量RNA需求的分子實驗操作（如高通量測序建庫），故選擇CTAB-GT法作為后續(xù)的試驗方法。

為了驗證四種方法所獲得的RNA能否用于RT-PCR試驗，我們分別將其反轉(zhuǎn)錄后利用洋蔥TUB引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（29個循環(huán)）。圖3表明，GT、CTAB、GT-CTAB和CTAB-GT四種方法用于RT-PCR試驗均可獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，但CTAB和GT-CTAB法以LiCl作為沉淀劑導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物急劇降低，而將RNA樣本用75%乙醇洗滌3次后，擴(kuò)增效果恢復(fù)到與其他方法無可見差異狀態(tài)，由此可以看出，LiCl干擾了反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，降低了反轉(zhuǎn)錄效率。因此，在利用LiCl作為最終沉淀劑獲取RNA時必須對樣本進(jìn)行多次洗滌，以盡可能降低其對后續(xù)分子生物學(xué)實驗的影響。

2.3CTAB-GT連用法在蔥屬主要蔬菜作物不同組織部位RNA提取中的應(yīng)用評估

為了驗證CTAB-GT連用法對蔥屬主要蔬菜作物RNA樣本提取的適用性，我們分別提取了洋蔥、大蔥、韭菜和大蒜樣本的花蕾、莖（或假莖）和葉片的總RNA。由圖4可以看出，點樣孔清晰，表明無蛋白或多糖殘留；DNA帶不可見，表明幾乎無DNA殘留；28S和18S清晰，且28S的亮度約為18S的兩倍，表明RNA樣本完整。因此，該方法可以用于多個蔥屬蔬菜作物不同部位RNA樣本的提取試驗，特別是該方法對樣本取量無限制，既可以對少量或微量樣本提取，進(jìn)行普通的RT-PCR試驗，也可以對大量的樣本提取，進(jìn)行高通量測序及雜交分析等。

a：3討論與結(jié)論

采用改良的CTAB-GT連用、蛋白酶K替代DEPC和冰浴電泳檢測方法，解決了蔥屬蔬菜作物RNA提取過程中多糖干擾的難題。該方法所提取的RNA樣本產(chǎn)量高，條帶清晰，RNA完整度高，無多糖、蛋白質(zhì)和DNA殘留，28S約為18S兩倍，可滿足下游RNA分子實驗（特別是高通量測序建庫）的要求，且該方法適合于大蔥、洋蔥、大蒜和韭菜不同組織部位樣本RNA的提取。

該方法首先采用改良CTAB法進(jìn)行RNA的粗提，去除多糖殘留，然后利用改良GT法對樣本進(jìn)行純化，去除蛋白質(zhì)和DNA殘留。CTAB法中的LiCl雖然可選擇性沉淀RNA，但試驗結(jié)果表明LiCl同樣可以沉淀DNA和部分蛋白質(zhì)，而酸酚可以有效地去除蛋白質(zhì)并使DNA溶解于有機(jī)相從而獲得高質(zhì)量的RNA。蛋白酶K（1 μg/mL）的使用更是取代了強(qiáng)致癌物質(zhì)DEPC，降低了對于實驗人員的安全隱患[12]，且未發(fā)現(xiàn)對RNA后續(xù)試驗的不利影響。在試驗過程中應(yīng)特別注意由于PVP與苯酚會產(chǎn)生結(jié)晶[7]，因此CTAB法中不能使用苯酚抽提，而GT法中不能使用PVP。

參考文獻(xiàn)：

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