劉建新，丁華僑，田丹青，王煒勇，劉慧春

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擎天鳳梨苞片葉綠素代謝關(guān)鍵基因的分離及褪綠的分子機(jī)理

劉建新，丁華僑，田丹青，王煒勇，劉慧春

（浙江省蕭山棉麻研究所，杭州 311202）

【目的】擎天鳳梨是一種新潮花卉，其苞片在成花變色過(guò)程中常常伴隨著綠色的逐漸消退。分離葉綠素生物合成與降解途徑的關(guān)鍵基因，探索在苞片變色過(guò)程中葉綠素代謝的分子基礎(chǔ)和機(jī)理，有助于解析呈色苞片中綠色退化的原因?！痉椒ā客ㄟ^(guò)cDNA文庫(kù)構(gòu)建及EST批量測(cè)序獲得葉綠素合成關(guān)鍵酶：谷氨酰tRNA合成酶基因（glutamyl-tRNA synthetase，）和尿卟啉原-Ⅲ合酶基因（uroporphyrinogen-Ⅲsynthase，）；通過(guò)同源克隆技術(shù)獲得葉綠素降解關(guān)鍵酶：脫鎂葉綠素酶（pheophytin pheophorbide hydrolase/pheophytinase，）基因；通過(guò)采用透光系數(shù)法測(cè)量葉綠素含量、HPLC法測(cè)定類(lèi)黃酮含量以及采用實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定葉綠素代謝關(guān)鍵基因的基因表達(dá)模式，探索呈色苞片中綠色部分消失的分子機(jī)理?！窘Y(jié)果】獲得的（GenBank：KP144289），序列長(zhǎng)為1 140 bp，編譯171AA的蛋白氨基酸序列，并存在GlnRS-cataytic core和Nt-trans superfamily保守區(qū)；獲得的（GenBank：KP144288）cDNA序列長(zhǎng)為613 bp，編譯188AA的蛋白氨基酸序列，并存在HemD和HemD Superfamily保守區(qū)；獲得的（GenBank：KP723523）cDNA序列長(zhǎng)為266 bp，編譯88AA的蛋白氨基酸序列，并存在Abhydrolase-6保守區(qū)。通過(guò)對(duì)不同變色階段苞片的葉綠素、類(lèi)黃酮含量測(cè)定以及葉綠素代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平分析，可知苞片變色過(guò)程伴隨著葉綠素含量的顯著降低和類(lèi)黃酮含量的明顯增加，同時(shí)葉綠素合成相關(guān)的和表達(dá)水平也明顯降低，而葉綠素降解關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平在苞片變色初期顯著上升，在變色完成后則降低到接近綠葉狀態(tài)的最低水平。而作為對(duì)照材料的綠葉，其葉綠素含量是最高的，而類(lèi)黃酮含量是最低的，同時(shí)葉綠素的合成相關(guān)酶基因表達(dá)量最高，而降解相關(guān)酶基因表達(dá)量最低，這與彩葉植物中葉綠素和類(lèi)黃酮色素的表現(xiàn)較為一致?！窘Y(jié)論】獲得了擎天鳳梨的葉綠素合成相關(guān)酶基因和以及降解關(guān)鍵酶基因。由于葉綠素合成量減少，降解量顯著增加引起葉綠素含量的降低，從而影響苞片變色過(guò)程中綠色的消退，并伴隨類(lèi)黃酮含量的增加。在葉綠素的降解過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。

擎天鳳梨；葉綠素；谷氨酰tRNA合成酶基因；尿卟啉原-Ⅲ合酶基因；脫鎂葉綠素酶

0 引言

【研究意義】擎天鳳梨（）是一種新潮花卉，屬于鳳梨科（Bromeliaceae Juss.）植物。原產(chǎn)于美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)，多年生常綠草本，其主要觀賞部位是呈色苞片[1]。擎天鳳梨主流品種‘Ostara’的呈色苞片為紅色，苞片紅色的形成常常伴隨著綠色部分的消退，最終紅色部分向苞片尖端擴(kuò)散而導(dǎo)致整個(gè)苞片全部呈現(xiàn)出紅色（圖1）。研究呈色苞片中綠色物質(zhì)的消退原因?qū)μ剿魅~綠素在變色苞片中合成和降解的代謝機(jī)制以及觀賞鳳梨的催花研究有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】作為一種變態(tài)葉的苞片，一般認(rèn)為其呈色物質(zhì)與彩葉植物葉片色素的形成類(lèi)似。與成色相關(guān)的色素包括葉綠素、類(lèi)黃酮、類(lèi)胡蘿卜素、水溶性生物堿及其衍生物等[2-4]，并受葉片的PH值以及光溫等環(huán)境因子的影響[5]。Kate等[6]對(duì)擎天鳳梨在高強(qiáng)度光照下葉綠體發(fā)生適應(yīng)性變化進(jìn)行了研究。通過(guò)對(duì)一些彩色植物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)葉色的呈色程度常常是由花青素苷/葉綠素的比值決定[7-9]。Nakayama等[10]對(duì)姜荷花與苞片顏色形成相關(guān)的錦葵花素3-蕓香糖苷（Malvidin 3-rutinoside）進(jìn)行了研究。王長(zhǎng)泉等[11]進(jìn)行了一品紅苞片花色素的分離。GTS和UROS都是葉綠素合成途徑中起關(guān)鍵性作用的酶。脫鎂葉綠素酶（pheophytin pheophorbide hydrolase/pheophytinase，PPH）是一個(gè)最新發(fā)現(xiàn)的葉綠素降解代謝關(guān)鍵酶[12-14]，普遍存在于高等植物基因組，目前已在擬南芥（AT5G13800）、黃瓜[15]、花椰菜、西蘭花（OL386）、大白菜（AC189212.2）等植物中被克隆獲得?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人對(duì)擎天鳳梨葉綠素合成與降解的研究主要集中在各類(lèi)彩葉植物上，是從生理生化層面對(duì)葉色的成因以及影響因素進(jìn)行研究，但關(guān)于苞片顏色的研究很少。UROS編碼基因在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物（主要是人類(lèi)和小鼠）中研究較為清楚[16]，而在植物中研究較少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)分離擎天鳳梨葉綠素生物合成和降解途徑的關(guān)鍵基因，研究其表達(dá)模式，探索呈色苞片中綠色消退的分子機(jī)理，為研究觀苞類(lèi)植物的苞片色素變化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

擎天鳳梨主流品種‘Ostara’的開(kāi)花早期植株（圖1-A）來(lái)源于浙江省蕭山棉麻研究所（即浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究開(kāi)發(fā)中心）的鳳梨種質(zhì)資源圃。由于苞片是一種來(lái)源于葉片的變態(tài)器官，因而取用綠色葉片作為試驗(yàn)的基礎(chǔ)對(duì)照材料。由鳳梨觀賞部位中心開(kāi)始計(jì)算，由內(nèi)而外選取第三輪苞片作為試驗(yàn)對(duì)象，此輪苞片形狀較完整，變色效果最好。根據(jù)不同的變色階段，分別選取綠色階段、半紅階段以及全紅階段作為檢測(cè)苞片變色動(dòng)態(tài)的試驗(yàn)材料（圖1-B），重復(fù)3次。試驗(yàn)于2015年和2016年在浙江省蕭山棉麻研究所實(shí)驗(yàn)室實(shí)施完成。

A：取樣部位；B：取樣的具體材料；1：綠色苞片；2：半紅苞片；3：全紅苞片

1.2 葉綠素及類(lèi)黃酮色素含量的測(cè)定

采用SPAD-502葉綠素測(cè)定儀（Konica，日本）對(duì)擎天鳳梨‘Ostara’開(kāi)花植株的綠色、半紅以及全紅苞片（圖1-B）進(jìn)行葉綠素含量的測(cè)定，同時(shí)測(cè)量綠色葉片部分以作為對(duì)照。每個(gè)材料隨機(jī)取5個(gè)點(diǎn)測(cè)定（排除邊緣、色斑等異常之處），取平均值，然后重復(fù)平行取樣檢測(cè)2次，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

采用HPLC法，以兒茶酚（catechin）作為標(biāo)準(zhǔn)參照，對(duì)類(lèi)黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。使用儀器為waters二元泵1525，自動(dòng)進(jìn)樣器2707，PAD檢測(cè)器2998，溫控箱1500，檢測(cè)柱Sun FireTM C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相組成：A-0.1%三氟乙酸（水相）和B-乙腈。梯度洗脫程序如下：0—3 min，5%B；3—20 min，5%—25%B；20—42 min，25%—95%B；42—45 min，95%B；45—50 min，95%—5%B；50—60 min，5%B。流速為1.0 mL·min-1，注入樣品體積為20 μL。

1.3 葉綠素合成相關(guān)酶基因和的分離

以劉建新等[17]構(gòu)建的擎天鳳梨屬栽培品種‘Ostara’早期花器官cDNA 全長(zhǎng)文庫(kù)以及隨機(jī)挑取2 004個(gè)單克隆測(cè)序信息為基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)多序列比對(duì)篩選，獲得2條與葉綠素合成相關(guān)的基因片段，一條是來(lái)源于谷氨酰tRNA合成酶（glutamyl-tRNA synthetase）編碼基因的cDNA序列片段（單克隆ppfca0_001562.z1.scf）；另一條是來(lái)源于尿卟啉原-Ⅲ合酶（uroporphyrinogen-Ⅲ synthase）編碼基因的cDNA序列片段（單克隆ppfca0_002194.z1.scf），并進(jìn)行重測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 葉綠解降解基因的分離

參考王偉等[15]在黃瓜中克隆的過(guò)程設(shè)計(jì)引物：PPH-F：5′-CATCGAACAGGTCATTGGTG-3′和PPH-R：5′-ACTTTCGGGGTCGCTTATTT-3′。以紅色苞片為材料提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板。按2×Taq PCR MasterMix（Tiangen，KT201）方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)?5℃ 3 min；95℃ 30 s，48℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 15 min。產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，再進(jìn)行TA克隆測(cè)序。

1.5 開(kāi)花期葉綠素合成、降解代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析

以分離得到的葉綠素合成關(guān)鍵基因和及降解關(guān)鍵基因的表達(dá)變化來(lái)代表葉綠素合成和降解的代謝變化。以綠葉作為對(duì)照，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目標(biāo)基因在不同變色階段中（綠色、半紅和全紅）的變化趨勢(shì)，以確定相關(guān)代謝途徑的變化情況以看家基因?yàn)閮?nèi)參[18]，設(shè)計(jì)引物（表1）。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)中各基因的引物序列

對(duì)各組織材料提取總RNA。并檢測(cè)其濃度、純度及完整性。使用TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物按梯度稀釋作為模板再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制作、、及的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)（表2）。

表2 定量PCR循環(huán)程序

1.6 數(shù)據(jù)分析

相關(guān)數(shù)據(jù)以Excel 2007軟件分析并生成圖片?；虮磉_(dá)分析以作為內(nèi)參進(jìn)行校正并獲得目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 不同變色時(shí)期苞片葉綠素及類(lèi)黃酮色素含量的比較

采用SPAD-502葉綠素測(cè)定儀對(duì)綠色、半紅、全紅苞片以及綠色葉片的葉綠素含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖2-A所示，在苞片變色過(guò)程中，綠色苞片的葉綠素含量最高，其次是半紅苞片，最后是紅色苞片。而作為對(duì)照的綠葉，其葉綠素含量比綠色苞片更高。以兒茶酚（catechin）作為對(duì)照，采用HPLC法檢測(cè)類(lèi)黃酮含量（圖2-B），紅色苞片中類(lèi)黃酮最高，其次是半紅苞片，再者是綠色苞片，而綠葉中類(lèi)黃酮含量最少。

圖2 不同變色階段中的葉綠素及類(lèi)黃酮含量變化

2.2 葉綠素合成關(guān)鍵基因和的分離

根據(jù)獲得的2 004個(gè)單克隆測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行多序列比對(duì)篩選，有一條cDNA序列片段（單克隆ppfca0_001562.z1.scf）來(lái)源于谷氨酰tRNA合成酶編碼基因。經(jīng)重測(cè)序確定該序列全長(zhǎng)1 140 bp，可編碼171個(gè)氨基酸序列，GenBank登錄號(hào)為KP144289。將獲得的cDNA序列進(jìn)行核苷酸同源性（BLAST N）比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與玉米（）、蓖麻（）、可可樹(shù)（）、擬南芥（）等植物有較高同源性。其中與玉米的|XM_008660333.1|和|NM_001153978.1|同源性最高，為82%。將編碼的171個(gè)蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行氨基酸序列同源性（BLASTP）比對(duì)，結(jié)果表明，與甘蔗（）、玉米（）、蓖麻（）、可可樹(shù)（）、粗山羊草（）、擬南芥（）的谷氨酰tRNA合成酶的蛋白氨基酸有較高的同源性，其中與甘蔗的|AGT17076.1|同源性最高，為86%，其次為玉米的XP_008658555.1、AFW89634.1和NP_001147450.1，同源性為83%。同時(shí)該蛋白氨基酸序列存在GlnRS-cataytic core和Nt-trans superfamily保守區(qū)[19-22]（圖3）。GlnRS-core是Glutaminyl-tRNA synthetase（GlnRS）的催化核心區(qū)，吸附Gln到合適的tRNA。Nt-trans superfamily是核苷酸轉(zhuǎn)移酶超家族，有一個(gè)保守的雙核苷酸結(jié)合域，該超家族包括Ⅰ類(lèi)氨基酰-tRNA合成酶、泛酸合成酶、ATP硫酸化酶和胞苷酰轉(zhuǎn)移酶。

圖3 GTS推定氨基酸的保守區(qū)

另一條cDNA序列片段（單克隆ppfca0_002194. z1.scf）是來(lái)源于尿卟啉原-Ⅲ合酶的編碼基因。經(jīng)重測(cè)序確定該序列長(zhǎng)613 bp，可編碼188個(gè)氨基酸序列，GenBank登錄號(hào)為KP144288。將獲得的cDNA序列進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與海棗（）、油棕（）、大麥（）、小麥（）、二穗短柄草（）、中國(guó)蓮（）、小米（）、短花藥野生稻（）、玉米（）等有較高的同源性。其中與海棗的XM_008796935.1、XM_ 008796934.1、XM_008796933.1和XM_008796932.1一致性最高，為76%。將編碼的188個(gè)氨基酸序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)，結(jié)果表明，與海棗的XP_008795157.1、XP_008795156.1、XP_008795155.1和XP_008795154.1的一致性最高，為68%。同時(shí)該蛋白氨基酸序列存在HemD和HemD Superfamily保守區(qū)[19-22]（圖4），HemD結(jié)構(gòu)域是所有已知UROS特有的一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，與UROS的催化活性相關(guān)。

圖4 UROS推定氨基酸的保守區(qū)

2.3 葉綠解降解基因的分離

以來(lái)源于紅色苞片的合成cDNA作為模板，以PPH-F和PPH-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖5），發(fā)現(xiàn)250、300、450和650 bp 4條帶，對(duì)預(yù)期的250 bp片段進(jìn)行回收，測(cè)序，獲得266 bp的cDNA序列（GenBank登錄號(hào)為KP723523），該序列編碼88個(gè)氨基酸序列。通過(guò)BLASTN比對(duì)，與油棕（）、海棗（）、小果野蕉（）、葡萄（）、荷花高的（）、二穗短柄草（）、大麥（）等有較高同源性。其中，與油棕的XM_010923945.1一致性最高，為83%。將編碼的88AA氨基酸序列進(jìn)行BLASTP比對(duì)，與黃瓜（）、油棕（）、海棗（）、梅花（）、二穗短柄草（）、甜瓜（）等的脫鎂葉綠素酶的氨基酸序列有較高同源性。其中與油棕的XP_010931560.1同源性最高，為89%；其次為黃瓜的|BAH84863.1|，為85%。此外，該蛋白氨基酸序列存在Abhydrolase-6保守區(qū)[19-22]（圖6）。

圖5 PPH的PCR擴(kuò)增電泳圖

圖6 PPH推定氨基酸的保守區(qū)

2.4 苞片變色過(guò)程中葉綠素合成關(guān)鍵基因、和降解關(guān)鍵基因的表達(dá)分析

通過(guò)對(duì)和在苞片變色3個(gè)階段（綠色、半紅及全紅）及綠葉中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)分析（圖7和圖8）。葉綠素合成關(guān)鍵酶基因和的表達(dá)量在苞片的不同變色階段都表現(xiàn)為綠色苞片＞半紅苞片＞全紅苞片。而作為對(duì)照的綠色葉片，和的表達(dá)量超過(guò)所有的苞片組織。葉綠素降解關(guān)鍵酶基因，在半紅苞片部分含量最高，其次是綠苞，再者為全紅苞片，而綠葉和紅色苞片中的表達(dá)量大致相近，處于最低水平。

圖7 葉綠素合成關(guān)鍵酶基因GTS和UROS的表達(dá)分析

圖8 葉綠素降解關(guān)鍵酶基因PPH的表達(dá)分析

3 討論

高等植物的綠色來(lái)源于葉綠素，其生物合成降解途徑如圖9[13,28-30]所示。GTS和UROS均是葉綠素合成途徑中的關(guān)鍵酶。BLAST比對(duì)可知，獲得的擎天鳳梨與其他植物存在同源性，尤其是單子葉植物，其中與海棗同源性最高，核苷酸及氨基酸同源性分別為76%和68%。與動(dòng)物及微生物之間無(wú)同源性，但都存在共同的Hem D結(jié)構(gòu)域。Hem D結(jié)構(gòu)域是所有已知的特有的一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，與的催化活性相關(guān)。這與曹鳳[16]的研究結(jié)論“該基因種間差異較大，保守性相對(duì)比較低”基本一致。脫鎂葉綠素酶（PPH）是最新發(fā)現(xiàn)的葉綠素降解代謝關(guān)鍵酶[9-11]，可以專一地裂解脫鎂葉綠素a的植醇，促使脫鎂葉綠素a脫去植醇而變成脫鎂葉綠酸a[23-25]。同源基因普遍存在于高等植物基因組中，但有關(guān)該基因的研究非常之少，目前，國(guó)內(nèi)僅在黃瓜[17]及小麥[26]中有相關(guān)報(bào)道，本研究獲得的片段存在Abhydrolase-6保守區(qū)（pfam12697），它是一個(gè)Alpha/beta水解酶折疊，這與前人的研究類(lèi)似，所有的PPH蛋白質(zhì)都存在這一特征[17]，具有高度的保守性。此外前人在花椰菜表達(dá)中的研究表明，乙烯處理能促進(jìn)表達(dá)，加快植物的衰老[27]。生產(chǎn)上擎天鳳梨的催花常常需要采用乙烯來(lái)處理植株，處理過(guò)的植株然后進(jìn)入開(kāi)花階段，其本質(zhì)也是步入成熟衰老階段。本研究也表明，擎天鳳梨的開(kāi)花階段即伴隨著苞片綠色的消退和紅色的形成，的表達(dá)量也越來(lái)越大，推動(dòng)植株向成熟方向前進(jìn)。

A：葉綠素合成示意圖[28]；B：葉綠素降解示意圖[28-30]

在苞片變色過(guò)程中，綠色苞片中的葉綠素含量最高，其次是半紅苞片，全紅苞片的葉綠素含量最少，幾乎消失不見(jiàn)。而類(lèi)黃酮色素的含量剛好與之相反，表明苞片變色過(guò)程中綠色的消退伴隨著葉綠素含量的降低以及類(lèi)黃酮色素含量的增加。根據(jù)前人在各類(lèi)彩葉植物上獲得的結(jié)論：葉色的呈色程度常常是由花青素苷/葉綠素的比值決定的[3-5]，通過(guò)將本研究獲得的類(lèi)黃酮色素與葉綠素的相對(duì)比值進(jìn)行計(jì)算，綠苞為4.53；半紅苞為18.53；全紅苞為235.79。綠葉的類(lèi)黃酮色素與葉綠素的相對(duì)比值為1.29，與綠苞較為接近。隨著比值越來(lái)越大，綠色逐漸退去，紅色卻越來(lái)越濃，葉綠素和類(lèi)黃酮色素之間呈現(xiàn)了此消彼長(zhǎng)的現(xiàn)象，這與前人在彩葉植物中獲得的結(jié)論相一致。類(lèi)黃酮色素含量的增加起到了掩蓋葉綠素的作用，但葉綠素自身含量的降低應(yīng)是苞片綠色退去的根本原因。

為明確葉綠素含量降低的原因，文中對(duì)葉綠素的合成及降解相關(guān)基因進(jìn)行了分析，葉綠素合成途徑中的和都表現(xiàn)出了相同的趨勢(shì)，即綠苞中含量最高，半紅苞片次之，紅色苞片最少。而葉綠素降解的關(guān)鍵基因在綠色苞片和半紅苞片中的含量很高，其中在半紅苞片是最高的，最低的是紅色苞片，而綠葉和紅色苞片含量大致相近。綠色苞片和半紅苞片中表達(dá)量顯著增加說(shuō)明苞片在呈色過(guò)程中，對(duì)于葉綠素的降解起了非常重要的作用。紅色苞片中含量很低，說(shuō)明此時(shí)葉綠素的降解已基本完成，無(wú)需大量表達(dá)。綠葉中含量很低，而此時(shí)葉中的葉綠素含量最高，說(shuō)明此時(shí)葉片需要大量的葉綠素進(jìn)行光合作用來(lái)維持植物的生長(zhǎng)，如果大量表達(dá)則會(huì)通過(guò)降解葉綠素而對(duì)植物的正常生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生破壞。因此，從綠色苞片再到全紅苞片的褪綠變紅過(guò)程中，葉綠素的含量逐漸降低的原因可能是伴隨著葉綠素的合成水平的逐漸降低，葉綠素的降解反應(yīng)顯著加強(qiáng)引起的，在此過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。而在已經(jīng)變色的紅色苞片中，葉綠素的降解反應(yīng)達(dá)到接近綠葉狀態(tài)的最低水平。

4 結(jié)論

獲得了擎天鳳梨的葉綠素合成相關(guān)酶基因和以及降解關(guān)鍵酶基因的cDNA序列。苞片變色過(guò)程中綠色的消退的關(guān)鍵在于葉綠素含量的降低，并同時(shí)伴隨類(lèi)黃酮含量的增加；而葉綠素含量的降低是由于葉綠素合成量減少，葉綠素的降解量顯著增加引起的。在葉綠素的降解過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Isolation of Chlorophyll Metabolism Key Genes and Molecular Mechanism of Green Fade in Guzmania Bracts Discoloration Process

LIU Jian-xin, DING Hua-qiao, TIAN Dan-qing, WANG Wei-yong, LIU Hui-chun

(Xiaoshan Cotton and Bast Fiber Crops Research Institute of Zhejiang Province, Hangzhou 311202)

【Objective】Guzmania is a trendy flower. Its flower formation and bracts discoloration process are often accompanied by green fade. To analyze the reason which bract’s green fade, it is necessary to isolate key genes and explore molecular mechanism of chlorophyll biosynthesis and degradation metabolism in the process of bracts discoloration. 【Method】By cDNA library construction and EST sequencing batch, two key enzyme genes in chlorophyll biosynthesis pathway, including glutamyl-tRNA synthetase () and Uroporphyrinogen-Ⅲ synthase (), were obtained. By homology cloning technology, a key enzyme gene in chlorophyll degradation pathway, pheophytin pheophorbide hydrolase gene (), was obtained. Through measuring chlorophyll content using light transmittance measurement method,flavonoid content using HPLC method and analyzing gene expression pattern of key genes in chlorophyll metabolism using real-time quantitative PCR method, the molecular mechanism which green fade in discoloration bracts was studied. 【Result】obtained has 1 140 bp (GenBank: KP144289) in cDNA sequence, which compiles a 171 amino acid protein sequence, and has GlnRS-cataytic core and Nt-trans superfamily conservative regions;obtained has 613 bp (GenBank: KP144288) in cDNA sequence, which compiles a 188 amino acid protein sequence, and has HemD and HemD Superfamily conservative regions;obtained has 266 bp (GenBank: KP723523) in cDNA sequence, which compiles a 88 amino acid protein sequence, and has Abhydrolase-6 conservative region. Through measuring chlorophyll,flavonoid content and studying the expression level of key genes in chlorophyll metabolism, it could know that bract discoloration process accompanied by significant reduction of chlorophyll content and significant increase of flavonoid content. Furthermore, the expression level of chlorophyll biosynthesis key enzyme’s encoding genes,and, were also decreased obviously. As for the chlorophyll degradation key enzyme’s encoding gene,, its expression level increased significantly at the beginning of bracts discoloration, then reduced to close to the lowest level, which in accord with green leaves, after finishing of discoloration. As for the control material, green leaf had the highest chlorophyll content and the lowest flavonoid content. Furthermore, the expression amount of chlorophyll biosynthesis related genes were the highest, while that of degrade related genes was the lowest. This was consistent with colorful plants in chlorophyll and flavonoid pigment change trend. 【Conclusion】We obtained biosynthesis key enzymes genes,,, and degradation key enzyme gene,, in chlorophyll metabolism pathway from Guzmania. The reason that bracts’ green fade was due to reduction of chlorophyll content, and accompanied by increase of flavonoid content. The reduction of chlorophyll content was due to chlorophyll’s biosynthesis reduced and degradation increased significantly.played a key role in chlorophyll degradation process. The results will provide a basis for researching pigment change of view bract plants.

; chlorophyll; glutamyl-tRNA synthetase; uroporphyrinogen-III synthase; pheophytin pheophorbide hydrolase/pheophytinase

2015-11-16；接受日期：2016-04-21

浙江省自然科學(xué)基金（LQ13C150002）、浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃（2012C22085）

劉建新，Tel：0571-83713882；E-mail：liujianxin2000@aliyun.com。通信作者田丹青，E-mail：tdq0123@163.com