楊歡，丁月珠，段天璇，扶宇，王雄飛，王昭懿，袁瑞娟

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102

柱前衍生HPLC-UV法測定人工牛黃中豬去氧膽酸含量

楊歡，丁月珠，段天璇，扶宇，王雄飛，王昭懿，袁瑞娟

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102

目的建立柱前衍生HPLC-UV法測定人工牛黃中豬去氧膽酸含量的方法。方法以2-萘基溴甲基酮為衍生試劑、三乙胺為催化劑、60 ℃水浴條件下對豬去氧膽酸進(jìn)行衍生，采用HPLC-UV法測定人工牛黃中豬去氧膽酸含量。結(jié)果當(dāng)衍生試劑與豬去氧膽酸的摩爾比＞20∶1，催化劑與豬去氧膽酸的摩爾比＞15∶1，在60 ℃水浴條件下反應(yīng)50 min時(shí)，衍生反應(yīng)完全。豬去氧膽酸在0.1～2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 7），平均回收率為97.85%（RSD=1.6%）。人工牛黃樣品中豬去氧膽酸的含量為4.12%。結(jié)論本方法靈敏度高、準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定性和重復(fù)性好，可用于測定人工牛黃中豬去氧膽酸的含量。

人工牛黃；豬去氧膽酸；柱前衍生；高效液相色譜法；紫外檢測

人工牛黃由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、?；撬帷⒛懠t素、膽固醇、微量元素等加工制成，是天然牛黃的代用品之一［1］，其在中藥制劑中的使用可有效緩解天然牛黃資源短缺。豬去氧膽酸為人工牛黃的特征成分之一，測定其含量可在一定程度上控制人工牛黃的質(zhì)量，同時(shí)豬去氧膽酸也是區(qū)別人工牛黃和天然牛黃的指標(biāo)性成分。由于豬去氧膽酸為末端吸收，無法采用高效液相紫外檢測器進(jìn)行檢測。目前多采用高效液相蒸發(fā)光散射檢測法［2-3］和薄層掃描法［4］測定其含量，但靈敏度較低。雖然采用質(zhì)譜法測定有非常高的靈敏度，但存在儀器價(jià)格昂貴、重復(fù)性差等缺點(diǎn)。采用柱前衍生HPLC-UV法可以提高靈敏度，同時(shí)普適性強(qiáng)。故本試驗(yàn)采用柱前衍生后高效液相紫外檢測器檢測，對人工牛黃中豬去氧膽酸的含量進(jìn)行測定。

1　儀器與試藥

島津高效液相色譜儀（LC-20AT），DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南予華儀器有限公司），電子天平（CPA225D，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），KQ-300B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），MTN-2800D型氮?dú)獯蹈蓛x（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）

豬去氧膽酸對照品（純度98%，成都曼斯特生物科技有限公司，中國科學(xué)院成都生物研究所，批號(hào)MUST-15032804），人工牛黃（產(chǎn)地安徽，批號(hào)20110116，購自北京同仁堂），三乙胺（純度為99.0%，天津市福晨化學(xué)試劑廠），2-萘基溴甲基酮（純度98%，上海晶純生化科技股份有限公司），水為去離子水，甲醇、乙腈均為色譜純。其他試劑均為分析純。

2　方法

2.1色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-1%磷酸（83∶17，V∶V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：238 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液精密稱取豬去氧膽酸對照品1 mg置1mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋定容至刻度。

2.2.2人工牛黃提取液精密稱取人工牛黃 20 mg 于10 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，稱定質(zhì)量，超聲30 min（功率300 W，工作頻率40 kHz），冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，即得。

2.2.3衍生試劑溶液精密稱取 2-萘基溴甲基酮63.5 mg于25 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

2.2.4催化劑溶液取三乙胺35.5 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

2.3衍生化反應(yīng)

取人工牛黃提取液，定容于1 mL容量瓶中，氮?dú)獯蹈?。加入催化劑溶?0.1 mL、衍生試劑溶液0.75 mL，用甲醇定容至刻度，60 ℃水浴反應(yīng)50 min后冷卻到室溫，加甲醇至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1專屬性試驗(yàn)取催化劑溶液0.1 mL、衍生試劑溶液0.75 mL于1 mL容量瓶中后用甲醇定容到刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件記錄色譜圖與人工牛黃衍生化反應(yīng)后的色譜圖進(jìn)行對比，見圖1、圖2。衍生試劑及催化劑對衍生產(chǎn)物無干擾，專屬性良好。

圖1　衍生試劑與催化劑HPLC圖

圖2　人工牛黃經(jīng)衍生后的HPLC圖

2.4.2線性關(guān)系考察分別取豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.005、0.01、0.02、0.05、0.07、0.1 mL于1 mL容量瓶中。按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行衍生化反應(yīng)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定反應(yīng)產(chǎn)物峰面積。以峰面積對豬去氧膽酸質(zhì)量作圖，結(jié)果豬去氧膽酸在0.1～2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=1.0×108X-9551 9，r=0.999 7。

2.4.3精密度試驗(yàn)將人工牛黃提取液按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行衍生化反應(yīng)后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，RSD=2.7%。

2.4.4重復(fù)性試驗(yàn)按照人工牛黃提取液的提取方法制備6份提取液，按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行衍生化反應(yīng)。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積，RSD=2.3%。

2.4.5穩(wěn)定性試驗(yàn)將人工牛黃提取液分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)行HPLC測定，記錄產(chǎn)物峰面積，RSD=2.4%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6加樣回收率試驗(yàn)精密稱取人工牛黃約10 mg，按人工牛黃提取液的方法提取6份提取液，取提取液定容于 1mL容量瓶中，氮?dú)獯蹈?。分別加入豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液33、33、41、41、49、49 μL后按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行衍生化反應(yīng)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1　豬去氧膽酸加樣回收率試驗(yàn)

2.5樣品含量測定

取人工牛黃樣品，按上述提取方法和衍生條件反應(yīng)后，測定豬去氧膽酸衍生產(chǎn)物峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算豬去氧膽酸含量，結(jié)果表明樣品中豬去氧膽酸的含量為4.12%。

3　討論

3.1衍生反應(yīng)條件的確定

3.1.1衍生時(shí)間取豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL于1 mL容量瓶中，加催化劑溶液0.1 mL、衍生試劑溶液0.5 mL，用甲醇定容至刻度，平行操作7份，分別于60 ℃水浴中反應(yīng)10、20、30、40、50、60、70 min后冷卻到室溫，加甲醇至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積，結(jié)果見圖3。反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積隨反應(yīng)時(shí)間而增大，反應(yīng)50 min時(shí)達(dá)到最大。

圖3　豬去氧膽酸衍生產(chǎn)物峰面積與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系

3.1.2催化劑用量取豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL 于1 mL容量瓶中，加入衍生試劑溶液0.5 mL后分別加入2～30倍反應(yīng)物摩爾量的催化劑溶液，用甲醇定容至刻度，60 ℃水浴反應(yīng)50 min后冷卻到室溫，加甲醇至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積，結(jié)果見圖4。反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積隨加入催化劑溶液的增大而增大，當(dāng)催化劑的摩爾量為反應(yīng)物的10倍后反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積沒有明顯增加。

圖4　豬去氧膽酸衍生產(chǎn)物峰面積與催化劑用量的關(guān)系

3.1.3衍生試劑用量取豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL 于1 mL容量瓶中，加催化劑溶液0.05 mL后分別加入2～100倍反應(yīng)物摩爾量的衍生試劑溶液，用甲醇定容至刻度，60 ℃水浴反應(yīng)50 min后冷卻到室溫，加甲醇至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積，結(jié)果見圖5。反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積隨加入衍生試劑溶液的增大而增大，當(dāng)催化劑的摩爾量為反應(yīng)物的20倍后反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積沒有明顯增加。

圖5　豬去氧膽酸衍生反應(yīng)產(chǎn)物與衍生試劑用量的關(guān)系

3.2高效液相色譜條件確定

衍生化反應(yīng)后，將衍生產(chǎn)物在200～400 nm波長范圍內(nèi)紫外掃描，其最大吸收波長為238 nm，故選擇238 nm作為檢測波長。采用甲醇和1%磷酸溶液為流動(dòng)相，衍生產(chǎn)物的峰形較好。同時(shí)，流動(dòng)相的用量比為甲醇-1%磷酸（83∶17，V∶V）、流速為1.0 mL/min時(shí)，可以使衍生產(chǎn)物與雜質(zhì)峰獲得最佳分離。

4　小結(jié)

采用本法測定人工牛黃中豬去氧膽酸含量的結(jié)果與其他方法［4-5］相差不大。與其他文獻(xiàn)報(bào)道的衍生方法［6-7］相比，本法以價(jià)格低廉的溴乙?；噭檠苌噭⑷野窞榇呋瘎?，提供堿性環(huán)境，降低了衍生反應(yīng)的成本。本試驗(yàn)考察了衍生試劑用量、催化劑用量、反應(yīng)時(shí)間對衍生產(chǎn)物的影響，確定了衍生反應(yīng)進(jìn)行完全所需的條件。整個(gè)衍生反應(yīng)可在1 h內(nèi)完成，利用HPLC-UV法對其進(jìn)行分離，可在15 min內(nèi)完成；方法學(xué)考察結(jié)果顯示本法穩(wěn)定可靠，可作為人工牛黃中豬去氧膽酸的含量測定的方法。本研究可為其他甾體類等無紫外吸收物質(zhì)的分析提供依據(jù)，是一種靈敏度高、價(jià)格低廉、重復(fù)性好、快速簡便的分析方法。

［1］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：5-8.

［2］ 唐元軍.HPLC-ELSD法同時(shí)測定豬膽粉中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21（6）：651-653.

［3］ 熊靖.人工牛黃甲硝唑膠囊中主要膽汁酸類成分的 HPLC-ELSD法測定研究［J］.藥物分析雜志，2015，35（6）：1067-1071.

［4］ 葉蓓蓓.薄層掃描法同時(shí)測定人工牛黃中膽酸及豬去氧膽酸的含量［J］.藥物分析雜志，2010，30（4）：706-709.

［5］ 馮芳.反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法同時(shí)測定人工牛黃中多組分含量［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000，35（3）：216-219.

［6］ 暴梅佳.柱前衍生化高效液相色譜法測定清開消炎片中豬去氧膽酸的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21（2）：186-188.

［7］ 倪坤儀.反相高效液相色譜法測定牛黃類中成藥中膽汁酸的含量［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1994，29（8）：629-633.

Content Determination of Hyodeoxycholic Acid in Artificial Calculus Bovis by Pre-Column Derivatization HPLC-UV Method

YANG Huan， DING Yue-zhu， DUAN Tian-xuan， FU Yu， WANG Xiong-fei，WANG Zhao-yi， YUAN Rui-juan
（School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102， China）

Objective To establish a pre-column derivation HPLC-UV method for the content determination of hyodeoxycholic acid in artificial calculus bovis. Methods The hyodeoxycholic acid was derived by 2-bromo-2’-acetonaphthoneat using triethylamine as the catalyst in 60 ℃ water bath. After that， a HPLC-UV method was established to determine the content of hyodeoxycholic acid in artificial calculus bovis. Results When the derivatising time at 60 ℃ water bath was 50 min， the radio of the molar amount of derived reagents and hyodeoxycholic was over 20∶1 and the radio of catalyst and hyodeoxycholic was over 15∶1； the reaction was completed. The calibration curve was linear within the range of 0.1-2 μg for hyodeoxycholic acid （r=0.999 7）， and the average recovery was 97.85% （RSD=1.6%）. In this sample， the content of hyodeoxycholic is 4.12%. Conclusion The method is with high sensitivity， highly reproducible， reliable and accurate for the content determination of hyodeoxycholic acid in artificial calculus bovis.

artificial calculus bovis； hyodeoxycholic acid； pre-column derivation； HPLC； UV

R284.1

A

1005-5304（2016）10-0092-03

2015-11-07；編輯：陳靜）

國家自然科學(xué)基金（81403071）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410026033）；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題項(xiàng)目（2013-ZDXKKF-20、2013-YXJXTD-15）

袁瑞娟，E-mail：rjyuance@126.com

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.021