張瑤琴,艾連峰,王曼曼,王學(xué)生*,劉　珊,侯　寧

(1.華北理工大學(xué)　公共衛(wèi)生學(xué)院，河北　唐山　063000；2.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局,河北　石家莊　050000)

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氧化石墨烯色譜固定相的制備及其在食品中三聚氰胺分析中的應(yīng)用

張瑤琴1,艾連峰2,王曼曼1,王學(xué)生1*,劉珊1,侯寧1

(1.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北唐山063000；2.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局,河北石家莊050000)

以N,N-二環(huán)己基碳二亞胺為偶聯(lián)劑，利用氧化石墨烯表面的羧基與氨基化硅球表面的氨基反應(yīng)合成了一種氧化石墨烯鍵合硅球色譜固定相，通過掃描電鏡和拉曼光譜對(duì)其進(jìn)行表征，并考察了極性小分子在柱上的色譜行為。與氨基化硅球固定相相比，在相同的色譜條件下，三聚氰胺、雙氰胺等氨基化合物的保留因子明顯提高，且該固定相在親水模式下對(duì)氨基化合物具有良好的保留性能，將其作為分析柱用于雞蛋和牛奶中三聚氰胺的分析。該方法在0.2～50 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 9，定量下限為0.87 mg/kg。在1，2，10 mg/kg加標(biāo)水平下的回收率為84.7%～93.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%～6.3%。關(guān)鍵詞：氧化石墨烯；固定相；三聚氰胺；牛奶；雞蛋；高效液相色譜(HPLC)

石墨烯(Graphene)是由碳原子緊密堆積成單層二維蜂窩狀晶格結(jié)構(gòu)的一種碳質(zhì)新材料，因具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)而受到廣泛關(guān)注[1]。氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)是石墨烯的重要衍生物，由于其在單層碳原子構(gòu)成的二維空間無(wú)限延伸的表面含有大量可修飾的基團(tuán)(如羥基、羧基、環(huán)氧基、羰基等)，因此可在水和多種有機(jī)溶劑中較好地分散，親水性佳，生物兼容性好[2]。另外，氧化石墨烯具有較大的比表面積(石墨烯單片層表面積的理論計(jì)算值為2 630 m2/g)、高熱穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性，因此有望成為一種理想的分離材料[3-5]。

目前，石墨烯材料已成功用于毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管電色譜、氣相色譜以及液相色譜固定相的合成[6-9]。2012年，Wang等[10]在毛細(xì)管中通過酸引發(fā)作用合成一種新型的GO摻雜聚合物毛細(xì)管色譜柱，并成功用于苯系物和多環(huán)芳烴的分離；Chen課題組[11]以3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷為偶聯(lián)劑將GO修飾到毛細(xì)管柱的內(nèi)壁上，并用于甲苯、乙苯和萘等有機(jī)物的分離分析；2013年，Zhang等[12]以N-羥基琥珀酰亞胺/N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS/EDC)為偶聯(lián)劑將GO鍵合到氨基硅膠表面得到一種新型液相色譜固定相，通過與C18柱對(duì)比，發(fā)現(xiàn)該固定相對(duì)于中性化合物和非極性化合物具有良好的分離性能；Liang等[13]通過層層自組裝法將GO鍵合到氨基化硅球表面，在反相色譜模式下，將得到的固定相用于苯胺、苯酚、多環(huán)芳烴和不同取代基的苯混合物的分離分析。目前，GO修飾的液相色譜固定相主要作為反相色譜模式分離目標(biāo)物；且GO修飾的氣相色譜固定相和液相色譜固定相多用于具有π-π共軛結(jié)構(gòu)的苯系物和多環(huán)芳烴類等中性或弱極性物質(zhì)的分離，而用于極性化合物的分析較少，特別是用于實(shí)際樣品中極性小分子分析的研究未見報(bào)道。極性物質(zhì)由于自身的性質(zhì)，在傳統(tǒng)C18色譜柱上保留較弱或難以保留。因此，常用的色譜固定相為正相或親水固定相。如三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)的小分子極性化合物，采用C18柱分析時(shí)需加入辛烷磺酸鈉等離子對(duì)試劑來實(shí)現(xiàn)三聚氰胺的保留，但會(huì)造成色譜系統(tǒng)的平衡時(shí)間長(zhǎng)，且會(huì)降低色譜柱的使用壽命。因此，目前三聚氰胺的色譜分離多采用親水型色譜柱(HILIC柱)[14-15]。

本研究以N,N-二環(huán)己基碳二亞胺為偶聯(lián)劑，通過GO表面的羧基與氨基化硅球表面的氨基反應(yīng)，將GO鍵合到氨基化硅球表面得到GO@SiO2固定相?？疾炝巳矍璋?、4-氨基安替比林、三聚氰酸等極性化合物在GO@SiO2固定相的色譜行為。GO@SiO2固定相對(duì)三聚氰胺、4-氨基安替比林等極性化合物在親水模式下具有良好的保留性能?；谠摴潭ㄏ鄬?duì)極性分子的保留特點(diǎn)，將其用于三聚氰胺的分離分析，并通過優(yōu)化色譜條件建立了該固定相分析檢測(cè)雞蛋和牛奶中三聚氰胺的新方法。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Waters UPLC-H-class超高效液相色譜儀(UPLC，美國(guó)Waters公司)；LC-2010高效液相色譜儀(日本島津公司)；MS-H-S10 10通道標(biāo)準(zhǔn)加熱磁力攪拌器(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；VORTEX GENIE旋渦混合器(美國(guó)Scientific Industries公司)；固相萃取裝置(美國(guó)Agilent Technologies公司)；TRABOVAP 氮?dú)獯蹈裳b置(美國(guó)Caliper Life Sciences公司)；Milli-Q純化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；S-4800型掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；DXR激光拉曼光譜儀(美國(guó)Thermo公司)。

除特別說明外，所用試劑均為分析純。氨基化硅球(5 μm，天津博瑞鍵合有限公司)；氧化石墨烯(GO，中國(guó)科學(xué)院山西煤炭化學(xué)研究所)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)；N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，北京百靈威科技有限公司)；醋酸銨(NH4OAc，北京迪馬科技)；氨水(石家莊試劑廠)；色譜純甲醇和乙腈購(gòu)自Fisher Scientific(赫爾，比利時(shí))。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：水楊酸(美國(guó)Sigma公司)，雙氰胺(DICY，美國(guó)Agela公司)，三聚氰酸(CYA)、三聚氰胺(MEL)、克倫特羅、4-氨基安替比林(AA)、4-甲氨基安替比林(MAA)(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司)。

1.2GO@SiO2固定相的制備與表征

以DCC為偶聯(lián)劑，通過GO表面的羧基與氨基化硅球表面的氨基反應(yīng)合成GO@SiO2填料(圖1)[16-17]：將75 mg GO分散至75 mL DMF溶液中，超聲30 min得到GO分散液。加入75 mg DCC和0.6 g氨基化硅球，并于50 ℃下攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后以8 000 r/min離心10 min，并用水和甲醇多次洗滌以除去未反應(yīng)的GO和雜質(zhì)，80 ℃烘干。將得到的GO@SiO2填料進(jìn)行掃描電鏡和拉曼光譜表征。利用濕法裝柱，將空白氨基化硅球填料和合成的GO@SiO2填料裝入不銹鋼柱管(100 mm ×2.1 mm i.d.)得到色譜分析柱。

實(shí)驗(yàn)考察了GO用量(7.5，37.5，75，150 mg)和包覆次數(shù)(1次、2次)對(duì)GO@SiO2填料性能的影響。以三聚氰胺、雙氰胺、克倫特羅、4-氨基安替比林、4-甲氨基安替比林、水楊酸和三聚氰酸作為目標(biāo)物，對(duì)GO@SiO2色譜柱的色譜行為進(jìn)行考察，通過保留因子(k)評(píng)價(jià)色譜性能。

1.3基于構(gòu)筑的GO@SiO2分析柱分析測(cè)定牛奶及雞蛋中三聚氰胺

1.3.1樣品處理牛奶：取2.0 g牛奶于50 mL離心管中，加入14 mL乙腈和6 mL 10 g/L三氯乙酸溶液，搖勻，超聲20 min，振蕩提取10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液置于另一干凈離心管中。

雞蛋：取雞蛋1枚，將蛋液攪勻，稱取5.0 g于50 mL離心管中，加入23 mL乙腈-三氯乙酸混合溶液(體積比7∶3)和2 mL 22 g/L的乙酸鉛溶液，搖勻，超聲20 min，振蕩提取10 min，10 000 r/min離心10 min，取10 mL上清液，待凈化。

凈化：按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[18]利用混合型陽(yáng)離子固相萃取柱(PXC)對(duì)提取液進(jìn)行凈化，得到的洗脫液用50 ℃氮?dú)獯蹈桑尤? mL乙腈定容，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.3.2液相色譜條件色譜柱為合成的GO@SiO2分析柱(100 mm×2.1 mm)；流動(dòng)相為乙腈-10 mmol/L乙酸銨緩沖溶液(體積比80∶20)；流速為0.3 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；進(jìn)樣量為5 μL。

回收率與精密度：在牛奶、雞蛋的陰性樣品中分別添加三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成1.0,2.0，10.0 mg/kg 3個(gè)水平的加標(biāo)樣品，按照前處理步驟進(jìn)行提取和凈化，平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和精密度。

2　結(jié)果與討論

2.1GO@SiO2固定相的制備與表征

2.1.1GO用量固定DMF的用量為75 mL，GO與DCC的質(zhì)量比為1∶1，選擇GO的用量分別為7.5，37.5，75，150 mg進(jìn)行填料的合成。通過目標(biāo)物三聚氰胺在色譜柱上的峰形和保留因子k評(píng)價(jià)不同條件所得色譜柱的性能。結(jié)果顯示，隨著GO用量的增大，GO@SiO2色譜柱對(duì)三聚氰胺的保留增強(qiáng)，k值增大；但當(dāng)GO用量為150 mg時(shí)，在實(shí)驗(yàn)條件下峰形展寬且拖尾嚴(yán)重，因此選擇GO用量為75 mg。

2.1.2GO包覆次數(shù)選擇GO用量為75 mg，固定反應(yīng)條件，分別包覆1次和2次。相比于GO包覆1次的GO@SiO2色譜柱，包覆2次時(shí)，三聚氰胺的保留時(shí)間增長(zhǎng)，k值明顯增大。但過多的GO使三聚氰胺的色譜峰展寬且拖尾嚴(yán)重，因此實(shí)驗(yàn)選擇GO包覆1次的GO@SiO2色譜柱。

2.1.3GO@SiO2的表征通過掃描電鏡對(duì)氨基化硅球和GO@SiO2的表面形貌進(jìn)行分析。如圖2所示，氨基化硅球的表面粗糙，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)方法反應(yīng)后得到的GO@SiO2可以明顯看出其表面的GO褶皺結(jié)構(gòu)，說明GO成功鍵合到氨基化硅球的表面。氨基化硅球和GO@SiO2的拉曼光譜見圖3，與氨基化硅球相比，GO@SiO2在1 350 cm-1和1 580 cm-1處有明顯的特征峰，分別為D帶和G帶，進(jìn)一步說明GO已成功鍵合到氨基化硅球的表面。

圖2氨基化硅球(A)和GO@SiO2(B)的掃描電鏡圖
Fig.2SEM images of NH2-SiO2(A) and GO@SiO2(B)

2.1.4GO@SiO2色譜柱對(duì)極性目標(biāo)物的色譜性能考察將氨基化硅球色譜柱和GO@SiO2色譜柱分別接入高效液相色譜儀，選擇極性氨基化合物(三聚氰胺、雙氰胺、克倫特羅、4-氨基安替比林以及4-甲氨基安替比林)、酸性化合物(水楊酸和三聚氰酸)作為目標(biāo)物，進(jìn)行色譜行為的考察，通過保留因子k評(píng)價(jià)色譜性能。如表1所示，與氨基化硅球色譜柱相比，由于GO的引入，上述兩類目標(biāo)物在保留行為上產(chǎn)生了較大變化。在相同色譜條件下，酸性目標(biāo)物三聚氰酸和水楊酸在氨基硅球色譜柱的k高于GO@SiO2色譜柱；極性氨基化合物在GO@SiO2色譜柱上的k均高于氨基化硅球色譜柱。結(jié)果表明，該填料具有一定的親水性，在親水模式下，對(duì)所考察的帶有氨基的極性小分子具有較好的保留行為。這可能是由于GO@SiO2表面帶有未被GO包覆的氨基硅球上的氨基、硅羥基，GO表面的羧基、羥基以及非極性作用的碳鏈、石墨碳片層等基團(tuán)，這些基團(tuán)使得該填料具有親水色譜模式的氫鍵作用、偶極作用和靜電作用等多種次級(jí)效應(yīng)。

表1　不同物質(zhì)在氨基化硅球色譜柱和GO@SiO2色譜柱上色譜行為的比較Table 1　Comparison of chromatographic behavior of different substances in the NH2-SiO2 column and GO@SiO2 column

(續(xù)表1)

2.2基于GO@SiO2柱測(cè)定牛奶、雞蛋中的三聚氰胺

2.2.1流動(dòng)相的選擇固定有機(jī)溶劑與水相的體積比為8∶2，考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液以及乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)三聚氰胺分離分析的影響。結(jié)果顯示，以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-10 mmol/L乙酸銨緩沖溶液(含0.1%甲酸)作為流動(dòng)相時(shí)，峰展寬嚴(yán)重。而以乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)，峰形尖銳，響應(yīng)值較高，因此選擇乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液為最佳流動(dòng)相。

2.2.2流動(dòng)相配比的選擇考察了不同配比的乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液流動(dòng)相條件下，三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間和峰形。結(jié)果表明，隨著流動(dòng)相中乙腈含量的增加，三聚氰胺的保留時(shí)間增長(zhǎng)，但峰展寬、拖尾嚴(yán)重，峰形變差。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-10 mmol/L乙酸銨的比例為80∶20。

2.2.3線性范圍用乙腈將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋成0.2，0.5，1，2，5，10，20，50 μg/mL的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以三聚氰胺的濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/mL)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)作圖，得回歸方程為Y=532.33X-66.06，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 9，說明三聚氰胺在0.2～50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.2.4回收率與精密度取空白牛奶、雞蛋樣品，在選定的色譜條件下進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)水平分別為1，2，10 mg/kg，按照樣品處理方法進(jìn)行提取凈化，每個(gè)水平平行測(cè)定6次。得牛奶樣品的加標(biāo)回收率為84.7%～90.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.1%～6.0%；雞蛋樣品的加標(biāo)回收率為89.2%～93.9%，RSD為4.1%～6.3%。圖4為牛奶、雞蛋的空白和加標(biāo)樣品的色譜圖。

圖4牛奶(A,B)和雞蛋(C,D)的空白樣品及加標(biāo)后的色譜圖
Fig.4Chromatograms of blank and fortified milk(A,B)and egg(C,D)samples A,C：blank samples；B,D：fortified samples

2.2.5檢出限與定量下限在優(yōu)化條件下，以基線噪聲3倍峰面積(S/N=3)對(duì)應(yīng)的三聚氰胺濃度計(jì)算得到檢出限為0.25 mg/kg，以基線噪聲10倍峰面積(S/N=10)對(duì)應(yīng)的三聚氰胺濃度得定量下限為0.87 mg/kg，能夠達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22388-2008基于液相色譜對(duì)乳制品中三聚氰胺定量下限為2 mg/kg的分析要求。

3　結(jié)　論

本文合成了GO@SiO2固定相，并考察了極性化合物在該柱上的色譜行為，結(jié)果表明GO表面的含氧基團(tuán)對(duì)氨基化合物具有良好的保留作用。將GO@SiO2固定相作為液相色譜固定相用于牛奶和雞蛋中三聚氰胺的分析，能夠滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)三聚氰胺的測(cè)定要求。該GO@SiO2色譜填料的制備，擴(kuò)充了氧化石墨烯固定相的應(yīng)用范圍，同時(shí)也是商業(yè)化親水柱的又一補(bǔ)充，GO@SiO2色譜柱具有成本低、色譜行為佳、實(shí)用價(jià)值高的特點(diǎn)。

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Fabrication of Graphene Oxide@SiO2as Stationary Phase and Its Application in Determination of Melamine in Food Samples

ZHANG Yao-qin1,AI Lian-feng2,WANG Man-man1,WANG Xue-sheng1*，LIU Shan1，HOU Ning1

(1.School of Public Health,North China University of Science and Technology,Tangshan063000,China；2.Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantion Bureau,Shijiazhuang050000,China )

Graphene oxide(GO) has received great interest for its unique properties and potential applications in separation.Here,(GO)@SiO2composites-based stationary phase for high performance liquid chromatography(HPLC) were fabricated by covalently bonding GO onto aminosilica microspheres using N,N-dicyclohexylcarbodiimide as coupling agent.The reaction was achieved via coupling the amino groups of aminosilica and the carboxyl groups of GO.The prepared GO@SiO2was characterized by scanning electron microscopy and Raman spectroscopy.GO@SiO2composites were developed as stationary phase,and the chromatographic properties of bare SiO2and GO@SiO2were investigated by a series of polar compounds including melamine,cyanuric acid,clenbuterol,4-aminoantipyrine and 4-methylaminoantipyrine.Under the same conditions,GO@SiO2column obtained a better separation for polar analytes in hydrophilic mode and the column was used as an analytical column for the determination of melamine in egg and milk samples.The proposed method was linear over the range of 0.2-50.0 μg/mL with a correlation coefficient(r) of 0.999 9.The limit of quantitation for melamine was 0.87 mg/kg.The recoveries of melamine at three spiked levels of 1,2,10 mg/kg ranged from 84.7% to 93.9% with relative standard deviations (RSDs) of 4.1%-6.3%.

graphene oxide(GO);stationary phase;melamine;milk;egg;high performance liquid chomatography(HPLC)

2016-02-05；

2016-03-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21305028)；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(B2013209238，H2016209018)；河北省教育廳自然科學(xué)項(xiàng)目(Q2012155)；國(guó)家質(zhì)檢總局項(xiàng)目(2013IK154，2014IK092)

王學(xué)生，碩士，教授，研究方向：衛(wèi)生化學(xué)，Tel:0315-2592086，E-mail:xswang64@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.009

O657.72；O623.732

A

1004-4957(2016)08-0981-06