吳姬娜，劉石磊,2*，楊　旸,2，梁龍輝，劉景全,2

(1.防化研究院分析測試中心　北京　102205；2.國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　北京　102205)

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3,4-二巰基甲苯衍生化法結(jié)合SPME/GC-MS技術(shù)分析尿樣中超痕量氯乙烯基胂酸

吳姬娜1，劉石磊1,2*，楊旸1,2，梁龍輝1，劉景全1,2

(1.防化研究院分析測試中心北京102205；2.國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京102205)

選取氯乙烯基胂酸(CVAOA)為生物標(biāo)志物，建立了路易氏劑染毒尿樣中超痕量CVAOA的分析方法。采用正交試驗(yàn)，優(yōu)化了CVAOA的巰基化衍生方法，選取3,4-二巰基甲苯(DMT)作為衍生試劑，CVAOA與DMT的用量摩爾比為1∶1 000，常溫衍生5 min，可達(dá)到最高的衍生效率；之后在優(yōu)化的頂空-固相微萃取(HS-SPME)條件下富集純化衍生產(chǎn)物CVAOA-DMT；使用氣相色譜-質(zhì)譜/選擇離子監(jiān)測模式(GC-MS/SIM)進(jìn)行定性定量分析。該方法在50.0 pg/mL～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性(r2=0.998 5)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于10%，檢出限可達(dá)7.6 pg/mL，定量下限為23 pg/mL。對低、中、高3種濃度的路易氏劑染毒尿樣進(jìn)行檢測，回收率為97.6%～105%，RSD為4.4%～7.1%。該方法分析靈敏度高，具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和普及性，可被廣泛推廣和使用。

氯乙烯基胂酸；路易氏劑；尿樣；超痕量；固相微萃取(SPME)；氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)

路易氏劑是一種強(qiáng)糜爛性毒劑[1]。二戰(zhàn)期間，日本曾在中國境內(nèi)使用大量的化學(xué)彈藥，其中不乏含有路易氏劑的毒氣彈[2]。在1997年生效的《禁止化學(xué)武器公約》中，路易氏劑被列為附表1中的有毒化學(xué)品，成為國際禁止化學(xué)武器組織(OPCW)核查的重要監(jiān)控對象。因此，對于路易氏劑的相關(guān)研究一直在持續(xù)進(jìn)行，涉及染毒洗消、涉毒防護(hù)、毒劑銷毀、毒理機(jī)制研究和臨床解毒等各方面，而其分析方法作為一種重要技術(shù)支撐也備受重視。經(jīng)過相關(guān)研究的開展，環(huán)境樣品中路易氏劑的分析檢測方法已逐步建立，而近年來，對生物樣品基質(zhì)的分析逐漸成為研究焦點(diǎn)[3-9]。隨著對生物醫(yī)學(xué)樣品分析方法研究的不斷深入，各國實(shí)驗(yàn)室逐步建立了血樣、尿樣等生物樣品中有機(jī)磷毒劑、硫芥類毒劑的分析方法，OPCW已進(jìn)行5次生物醫(yī)學(xué)樣品演練，逐步在各成員國實(shí)驗(yàn)室中建立了該兩類毒劑的染毒溯源性分析方法[10]，而對路易氏劑染毒生物醫(yī)學(xué)樣品的分析工作尚未全面開展。

路易氏劑(L1)的As-Cl鍵性質(zhì)十分活潑，遇水可發(fā)生水解反應(yīng)(圖1)，生成氯乙烯基亞胂酸(CVAA)，產(chǎn)物可繼續(xù)發(fā)生氧化反應(yīng)，生成氯乙烯基胂酸(CVAOA)，三者均可與巰基化衍生試劑反應(yīng)并生成相同的衍生產(chǎn)物[11]。但在染毒生物樣品中，游離的路易氏劑含量很低，而CVAA可被氧化，相對而言，CVAOA性質(zhì)更穩(wěn)定，且仍具有指證染毒特異性，不存在于未染毒樣品中，成為路易氏劑染毒溯源性檢測的重要生物標(biāo)志物。

目前，染毒生物樣品中路易氏劑及其相關(guān)化合物的分析方法主要有巰基化試劑衍生、氣相色譜(GC)或氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)檢測法[3-4,6-7]。本文通過對衍生方法和富集純化技術(shù)的優(yōu)化，選擇3,4-二巰基甲苯(DMT)作為衍生試劑，頂空-固相微萃取(HS-SPME)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)檢測，建立了特異性強(qiáng)、靈敏度高、適用性好的人尿樣中超痕量CVAOA的分析檢測方法。該方法可將文獻(xiàn)方法[4]的靈敏度提高近1個數(shù)量級，且無需復(fù)雜的自動化SPME-GC-MS裝置，具有更好的普及性。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與器材

氯乙烯基胂酸(CVAOA)、路易氏劑1(L1)(純度大于90%，防化研究院提供)；苯基氧化砷(PAO，純度大于97%，TCI公司)；1,3-二巰基丙烷(PDT，純度大于97%)、1,2-二巰基乙烷(EDT，純度大于95%,J&K公司)；2,3-二巰基丙醇(BAL，純度大于97%，Alfa Aesar公司)；3,4-二巰基甲苯(DMT,純度大于90%，Sigma公司)；N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA，純度大于98%，Acros公司)；乙酸乙酯(純度大于99.9%)，丙酮(純度大于99.5%)，甲醇(純度大于99.9%,J&K公司)；無水硫酸鈉、鹽酸(國產(chǎn)分析純)；蒸餾水(屈臣氏)；尿樣由實(shí)驗(yàn)室健康志愿者提供。

Thermo TRACE GC ULTRA氣相色譜儀-Thermo DSQ Ⅱ質(zhì)譜系統(tǒng)；國產(chǎn)水系過濾器(25 mm，0.45 μm，100/pk)；ODS-C18固相萃取柱(500 mg/3 mL,Agilent公司)；聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB，65 μm)、聚二甲基硅氧烷(PDMS，100 μm)均為Supelco公司產(chǎn)品。

1.2安全措施

路易氏劑是強(qiáng)糜爛性毒劑，使用時要避免毒劑原體的接觸性或吸入性中毒。實(shí)驗(yàn)過程中，由佩戴防護(hù)服的專業(yè)人員在通風(fēng)櫥中進(jìn)行操作。使用后，含有路易氏劑的所有溶液以及器具必須用適當(dāng)濃度的堿溶液進(jìn)行徹底清洗消毒。

1.3巰基化衍生與樣品制備

1.3.1試劑配制及尿樣預(yù)處理將PDT,EDT,BAL,DMT配制成1.00 mmol/mL的丙酮溶液；將CVAOA配制成1.00 mg/mL的水溶液；將L1,PAO配制成1.00 mg/mL的丙酮溶液。所配制溶液均于4 ℃保存?zhèn)溆?，使用時逐級稀釋至所需濃度。

取新鮮采集尿樣，過水系過濾器，濾液置于50 mL錐形瓶中，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2巰基化衍生內(nèi)標(biāo)溶液：將1.00 mg/mL PAO丙酮溶液逐級稀釋至10.0 μg/mL，加入DMT丙酮溶液(摩爾比PAO∶DMT=1∶1 000)，室溫衍生5 min，得10.0 μg/mL 的PAO-DMT丙酮溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取加標(biāo)尿樣1.00 mL，加鹽酸調(diào)至pH 1.0后，加入DMT(摩爾比CVAOA∶DMT=1∶1 000)，振蕩，室溫衍生5 min；加5.00 μL 10.0 μg/mL的PAO-DMT丙酮溶液，混勻。

1.3.3富集純化液相萃?。喝?.00 mL衍生尿樣，加入3×250 μL乙酸乙酯，振蕩萃取10 min，合并乙酸乙酯層，使用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥；向萃取液中加入10.0 μL BSTFA，混勻，室溫放置10 min；使用柔和的氮?dú)饬鳚饪s萃取液至100 μL，取1.00 μL進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

固相萃?。喝?.00 mL衍生尿樣，上載到C18固相萃取柱(依次用3.00 mL甲醇、3.00 mL水活化)，然后使用3.00 mL乙酸乙酯洗脫，向洗脫液中加入無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，使用柔和的氮?dú)饬鳚饪s洗脫液至100 μL，取1.00 μL進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

固相微萃?。喝?.00 mL衍生尿樣置于樣品瓶中，金屬浴加熱至90 ℃，使用PDMS纖維，頂空萃取90 min后，置于GC氣化室中250 ℃解吸1 min，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

1.4GC-MS-SIM儀器分析

Agilent DB-17MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；升溫程序：150 ℃保持2 min，以10 ℃/min升至280 ℃(5 min)；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1.00 μL；載氣：高純氦氣，流速1.0 mL/min。離子源溫度：250 ℃；EI電子轟擊能量：70 eV；溶劑延遲：6 min；選擇離子監(jiān)測(SIM)方法：m/z=229,290(CVAOA-DMT衍生物)，m/z=229,306(PAO-DMT衍生物)；駐留時間：100 ms。

1.5定量工作曲線的繪制

向尿樣中添加適量CVAOA水溶液，配制9個濃度的加標(biāo)尿樣基質(zhì)(20.0 pg/mL，50.0 pg/mL，0.100 ng/mL，0.200 ng/mL，0.500 ng/mL,5.00 ng/mL，50.0 ng/mL，500 ng/mL,5.00 μg/mL)；加入鹽酸調(diào)至pH 1.0，加入3,4-二巰基甲苯(摩爾比CVAOA∶DMT=1∶1 000)，振蕩，室溫衍生5 min；加入5.00 μL 10.0 μg/mL PAO-DMT丙酮溶液，混勻；進(jìn)行SPME-GC-MS(SIM)分析。每個濃度的樣品重復(fù)測定3次，以目標(biāo)物(CVAOA-DMT)與內(nèi)標(biāo)物(PAO-DMT)的色譜峰面積平均比值為縱坐標(biāo)，以添加CVAOA濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6路易氏劑染毒樣品的分析

使用適量L1丙酮溶液將尿樣染毒至所需濃度，37 ℃孵育2 h。樣品制備及儀器分析方法與CVAOA加標(biāo)尿樣相同。

2　結(jié)果與討論

2.1衍生方法的優(yōu)化

L1及其水解與氧化產(chǎn)物CVAA、CVAOA由于活性、揮發(fā)性等原因，不宜直接進(jìn)行氣相色譜分析，通常將其進(jìn)行巰基化衍生，以改善目標(biāo)化合物的色譜特征[12]。常用的衍生試劑包括單巰基和二巰基化合物兩類，其中二巰基衍生試劑可將L1及其水解、氧化、加合等代謝產(chǎn)物衍生為同一種產(chǎn)物，具有更高的靈敏度[4,7]。鑒于本文是針對尿樣中超痕量代謝標(biāo)志物進(jìn)行分析，對靈敏度要求更高，因此選擇4種二巰基衍生試劑(DMT,EDT,PDT,BAL)對目標(biāo)物進(jìn)行衍生。使用正交試驗(yàn)法分別考察了衍生試劑種類與用量、衍生時間、衍生溫度4個因素的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：4種二巰基衍生試劑的衍生效率依次為DMT>EDT>PDT>BAL，與常用的PDT[4,7]、BAL[3,6]相比，DMT衍生效率最高，靈敏度更好；在衍生試劑用量方面，通常使用過量巰基化試劑進(jìn)行衍生，本實(shí)驗(yàn)對此進(jìn)行了量化研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)目標(biāo)物與衍生試劑的摩爾比為1∶1 000時，衍生效果最佳；在衍生時間和溫度方面，由于延長衍生時間以及提高衍生溫度并不能有效改善衍生效果，故最終選擇的衍生條件為常溫下衍生5 min。

2.2內(nèi)標(biāo)物的選擇與鑒定

L1及CVAA、CVAOA經(jīng)DMT衍生后可得到相同的環(huán)狀衍生產(chǎn)物(圖2A)，分子離子峰及主要碎片離子歸屬(m/z)：290(M+·)，229(M+·-·C2H2Cl)，121(C7H5S)+，107(AsS)+。

以該衍生產(chǎn)物(CVAOA-DMT)為分析目標(biāo)物，選擇與之結(jié)構(gòu)及性質(zhì)相似的PAO-DMT作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，內(nèi)標(biāo)物的GC-MS(EI)全掃質(zhì)譜結(jié)果見圖2B。分子離子峰及主要碎片離子歸屬(m/z)：306(M+·)，229(M+·-·C6H5)，121(C7H5S)+，107(AsS)+。

可見，CVAOA-DMT與PAO-DMT的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相近，可發(fā)生相似的質(zhì)譜裂解，證明PAO-DMT適合作為CVAOA-DMT定量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。圖2A中碎片m/z229(C7H5S2As)+，121(C7H5S)+,107(AsS)+具有較高的強(qiáng)度，其中m/z229碎片的相對強(qiáng)度最高，特異性好，適宜作為GC-MS(SIM)的監(jiān)測離子。此外，實(shí)驗(yàn)對比發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以m/z229,290為GC-MS(SIM)監(jiān)測離子時，目標(biāo)物CVAOA-DMT具有最佳的檢測靈敏度，樣品背景干擾小，故最終確定目標(biāo)物GC-MS(SIM)方法的監(jiān)測離子為m/z229,290。同理，選擇m/z229,306作為PAO-DMT的GC-MS(SIM)監(jiān)測離子。

2.3萃取方法的優(yōu)化

2.3.1萃取方法的比較使用10.0 ng/mL加標(biāo)尿樣，比較了液相萃取、固相萃取、固相微萃取3種萃取方法的富集、純化效果。結(jié)果顯示，SPME方法不僅可更加有效去除雜質(zhì)干擾，凈化基質(zhì)背景，分析靈敏度也明顯優(yōu)于其他兩種方法，此外，SPME方法具有無需有機(jī)溶劑、操作簡便以及基質(zhì)消耗和損失小等優(yōu)勢[13]。故實(shí)驗(yàn)最終選擇SPME方法進(jìn)行萃取。

2.3.2SPME方法的優(yōu)化在萃取纖維方面，由于聚丙烯酸酯纖維(PA)較聚二甲基硅氧烷纖維(PDMS)更易被破壞，同時PA在使用過程中會產(chǎn)生干擾物共萃取現(xiàn)象，故PA的應(yīng)用性能不及PDMS[14]，在路易氏劑染毒樣品的研究中，不同實(shí)驗(yàn)室的工作也陸續(xù)印證了這一結(jié)論。文獻(xiàn)[15-17]對使用的萃取纖維進(jìn)行了對比優(yōu)化，證明PDMS具有更好的萃取效率，雜質(zhì)少且重復(fù)性好，更適宜進(jìn)行生物樣品分析。因此，本實(shí)驗(yàn)在已有研究基礎(chǔ)上，選擇對PDMS以及與其涂層相近的聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB)兩種纖維進(jìn)行比對研究，結(jié)果表明兩種纖維萃取時雜質(zhì)干擾情況相近，而PDMS較PDMS-DVB具有更高的萃取效率，故最終選擇萃取纖維為PDMS。

在萃取方式的選擇上，相比于浸入萃取法，頂空萃取法的萃取雜質(zhì)少，更適宜處理油脂、血液、尿樣等復(fù)雜樣品[18]，故文獻(xiàn)中均使用頂空-固相微萃取法分析染毒生物樣品[4,7]。本實(shí)驗(yàn)對頂空和浸入兩種萃取方式的富集純化效果進(jìn)行了比對，結(jié)果表明浸入法在萃取過程中會產(chǎn)生更多的雜質(zhì)干擾，純化效果遜于頂空法，且在目標(biāo)物富集效果方面也無明顯改善，而頂空法在相近萃取效率的前提下，具有更加潔凈的背景，故最終確定使用頂空方式進(jìn)行萃取。

在萃取時間和溫度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著萃取溫度的提高和萃取時間的延長，目標(biāo)物峰面積逐漸增加，在5～120 min萃取時間范圍內(nèi)未出現(xiàn)吸附平衡。由于SPME方法的重復(fù)性不及其他萃取方法，因此未達(dá)吸附平衡時進(jìn)行定量分析會造成方法的精密度不佳。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中需要考慮兩方面影響因素，既要使萃取盡可能接近吸附平衡，提高方法的精密度，又要注意分析時間不能過長?；诖?，本實(shí)驗(yàn)最終選擇在90 ℃萃取90 min。結(jié)果表明：該條件下，萃取雖未完全達(dá)到吸附平衡，但定量分析時的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，可滿足生物樣品中超痕量分析檢測的要求。

在解吸條件優(yōu)化中，改變解吸溫度(250～270 ℃)對解吸效果無顯著影響，解吸時間為1 min時即可實(shí)現(xiàn)完全解吸，即使對最高濃度(5.00 μg/mL)的樣品進(jìn)行分析，也未檢測到目標(biāo)物殘留，因此最終選擇在250 ℃解吸1 min。

2.4GC-MS/SIM定量檢測方法的建立

對3個批次9個濃度的CVAOA加標(biāo)尿樣基質(zhì)(20.0 pg/mL，50.0 pg/mL，0.100 ng/m，0.200 ng/mL，0.500 ng/mL，5.00 ng/mL，50.0 ng/mL，500 ng/mL,5.00 μg/mL)進(jìn)行SPME/GC-MS(SIM)分析。結(jié)果表明，本方法在50.0 pg/mL～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性，回歸方程為y=0.121 9x+0.285 7，r2=0.998 5(其中y為目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積平均比值，x為CVAOA的加標(biāo)濃度，ng/mL)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.4%～9.9%。對于20.0 pg/mL加標(biāo)尿樣，可使用所建方法進(jìn)行分析，色譜峰信噪比S/N>3，證明本方法對樣品中超痕量目標(biāo)物的分析結(jié)果良好，滿足痕量分析的要求。

2.5方法學(xué)評價

2.5.1檢出限與定量下限采用標(biāo)準(zhǔn)偏差法[19]，計(jì)算檢出限(LOD)與定量下限(LOQ)：LOD=3.3×SD/S,LOQ=10×SD/S；其中，SD為接近定量下限濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差；S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

本文對50.0 pg/mL加標(biāo)尿樣重復(fù)測定5次，計(jì)算得到CVAOA-DMT與PAO-DMT的色譜峰面積比值的SD=0.000 28，S=0.121 9，根據(jù)公式計(jì)算得到LOD和LOQ分別為7.6，23 pg/mL。

2.5.2準(zhǔn)確度與精密度在空白尿樣中分別添加0.025 0，2.50，250 ng/mL的CVAOA，使用所建立的方法進(jìn)行檢測，3種加標(biāo)濃度下的回收率分別為110%，101%，98.0%，RSD分別為6.3%，4.6%，8.6%。方法的準(zhǔn)確度及精密度可滿足CVAOA的檢測要求。

2.6路易氏劑染毒尿樣的分析

配制0.025，2.50,250 ng/mL 3種濃度的路易氏劑染毒尿樣，使用本方法進(jìn)行分析，每個濃度重復(fù)測定3次，得到平均回收率分別為105%，97.6%，101%，RSD分別為7.1%，4.4%，5.3%?？瞻啄驑蛹?.025 ng/mL濃度加標(biāo)尿樣的色譜圖見圖3，空白樣品中在目標(biāo)化合物±0.1 min位置未出現(xiàn)干擾峰，證明方法具有較好的特異性。通過對路易氏劑染毒樣品的分析，表明本方法的分析靈敏度高，準(zhǔn)確度與精密度良好，同時具有較好的特異性，可用于實(shí)際染毒樣品的分析檢測。

圖3路易氏劑染毒尿樣的氣相色譜圖
Fig.3GC chromatograms of lewisite exposed urine samples A.blank urine sample；B.urine sample spiked with 0.025 ng/mL L1

3　結(jié)　論

本文建立了尿樣中超痕量氯乙烯基胂酸(CVAOA)檢測的GC-MS/SIM分析方法，對衍生、富集純化方法以及主要分析參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，取得了良好的檢測靈敏度，方法檢出限可達(dá)7.6 pg/mL，RSD小于10%。通過提高衍生效率，改善了富集和純化效果，本方法在缺少自動化SPME/GC-MS設(shè)備的前提下，通過使用固相微萃取手柄進(jìn)行手動操作，實(shí)現(xiàn)了尿樣中超痕量CVAOA的靈敏檢測，并將現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的分析靈敏度提高了近1個數(shù)量級。該方法靈敏度和選擇性高，無需特殊的儀器裝置，操作簡單，可被廣泛推廣和使用。此外，該方法還可應(yīng)用于痕量染毒的水樣、固體等環(huán)境樣品的檢測，為化學(xué)事故救援、反恐化學(xué)檢測提供了有效手段。

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Determination of Ultra-trace 2-Chlorovinylarsonic Acid in Urine by SPME/GC-MS after Derivatization with 3,4-Dimercaptotoluene

WU Ji-na1,LIU Shi-lei1,2*,YANG Yang1,2,LIANG Long-hui1,LIU Jing-quan1,2

(1.Research Institute of Chemical Defence,Beijing102205，China；2.State Key Laboratory of NBC Protection for Civilian,Beijing102205，China)

Selecting 2-chlorovinylarsonic acid(CVAOA) as the biomarker,a determination method of ultra-trace CVAOA in human urine specific to lewisite exposure was developed.The conditions for derivatization were optimized by orthogonal experiments,and the results were as follows:thiolation by a 1∶1 000 mole ratio of CVAOA to 3,4-dimercaptotoluene(DMT) for 5 min at room temperature.Enrichment and purification of the derivative product(CVAOA-DMT) based on the optimum headspace-solid phase microextraction(HS-SPME) conditions,and then analysis of the derivative by gas chromatography-mass spectrometry in selective ion monitoring(GC-MS-SIM).The linear calibration range was from 50.0 pg/mL to 500 ng/mL(r2=0.998 5),and the relative standard deviations(RSDs) were less than 10%.The limit of detection was 7.6 pg/mL and the limit of quantitation was 23 pg/mL.The recoveries of lewisite exposed urine samples at the low,middle and high concentration levels ranged from 97.6% to 105% with the RSDs of 4.4%-7.1%.The method exhibited a satisfactory universality with its high sensitivity,precision and accuracy,and could be applied in different laboratories.

2-chlorovinylarsonic acid;lewisite;urine;ultra-trace；solid phase microextraction(SPME);gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)

2016-01-07；

2016-03-24

劉石磊，博士，研究員，研究方向：軍事分析化學(xué)，Tel:010-69760259，E-mail:liushilei402@263.net

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.012

O657.63;O611.63

A

1004-4957(2016)08-0999-06