馬　軍，滕　應(yīng)，陸引罡，甘信宏，任文杰，馬文亭

(1.貴州大學(xué)　農(nóng)學(xué)院，貴州　貴陽　550025；2.中國科學(xué)院　南京土壤研究所　土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇　南京　210008；3.銅仁學(xué)院　材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州　銅仁　554300)

?

四通道色譜分離儀凈化/氣相色譜-質(zhì)譜法測定煙葉中的多環(huán)芳烴

馬軍1,2,3，滕應(yīng)2，陸引罡1*，甘信宏2，任文杰2，馬文亭2

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽550025；2.中國科學(xué)院南京土壤研究所土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210008；3.銅仁學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州銅仁554300)

建立了同時檢測新鮮煙葉中16種多環(huán)芳烴(PAHs)的四通道色譜分離儀凈化/氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析方法。樣品經(jīng)二氯甲烷索氏提取，四通道色譜分離儀凈化，GC-MS選擇離子監(jiān)測模式(SIM)測定和外標(biāo)法定量，重點(diǎn)考察了新鮮煙葉提取液的分離凈化條件。結(jié)果表明：16種PAHs類化合物在10～1 000 μg/kg范圍內(nèi)定量離子的峰面積與質(zhì)量濃度呈較好的線性關(guān)系(r>0.99)。儀器檢出限(LOD)為0.35～1.75 μg/kg，方法檢出限(MDLs)為1.01～2.87 μg/kg。在10,50，200 μg/kg 3個濃度水平下的加標(biāo)回收率為81.0%～107.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)為2.7%～8.0%。該方法簡便、快捷、可操作性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣，適合于煙草等作物中PAHs類化合物的分析檢測。

四通道色譜分離儀；氣相色譜-質(zhì)譜；多環(huán)芳烴；凈化；煙葉

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)可直接或通過降雨、降雪和降塵進(jìn)入土壤，土壤承擔(dān)了90%以上多環(huán)芳烴的環(huán)境負(fù)荷，使之成為多環(huán)芳烴的儲藏庫和中轉(zhuǎn)站[1]，最終影響農(nóng)作物生長，導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降[2]。而煙草是一種廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物，是我國農(nóng)民的重要收入來源。同時，煙葉在種植和烘烤加工過程中可能會形成多環(huán)芳烴類等持久性有機(jī)污染物，這些污染物又直接或間接的被煙葉吸收或積累，最終威脅人體健康。因此有必要建立能夠快速準(zhǔn)確檢測煙葉中多環(huán)芳烴類污染殘留的方法。

多環(huán)芳烴的提取凈化及測定方法很多，提取方法有超聲提取[3]和索氏提取[4]，測定方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[5-8]和液相色譜法[9-10]。凈化方法有濃硫酸磺化法[11]、硅膠層析柱凈化法[12-13]、SPE柱凈化法[14-18]、C18分散固相萃取法[19]、凝膠滲透色譜法[20]和中空纖維液相微萃取法等[21]，其中濃硫酸磺化和硅膠層析柱凈化法步驟繁瑣，溶劑用量大且耗時耗力，溶劑暴露易給實(shí)驗(yàn)人員帶來健康風(fēng)險[19]；SPE萃取小柱和C18分散固相萃取柱為一次性小柱，成本較高，也存在洗脫過程中溶劑暴露等問題；凝膠滲透色譜法和中空纖維液相微萃取的凈化效果明顯，但操作步驟較復(fù)雜，易增加實(shí)驗(yàn)誤差，影響測定結(jié)果準(zhǔn)確性，且實(shí)驗(yàn)用材料和設(shè)備均較昂貴。

針對上述凈化過程中存在的問題，本文選用李清波等[22-23]自主研制的四通道色譜分離儀對煙葉提取液進(jìn)行分離凈化。該儀器采用程序控制的全密閉式工作環(huán)境，通過建立不同待測物的洗脫曲線，精確吸取溶劑并完成自動洗脫凈化，從而減少溶劑揮發(fā)與暴露，降低偶然誤差，實(shí)現(xiàn)待測物凈化過程的標(biāo)準(zhǔn)化控制。本研究建立了四通道色譜分離/氣相色譜-質(zhì)譜測定煙葉中16種被美國環(huán)保署列為優(yōu)先控制的PAHs的方法。該方法操作簡單、靈敏可靠，可滿足煙葉等作物中PAHs類化合物的檢測與分析要求。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

CHRO-400四通道色譜分離儀(賽次科技(大連)有限公司)；SC-3610低速離心機(jī)(安徽 USTC Zonkia科技儀器有限公司)；XW-80A渦旋震蕩器(海門市其林貝爾有限公司)；KQ-6OODB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)(FreeZone 2.5 Liter Freeze Dry Systems，Labconco Corp.USA)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；Rotavapor R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BüCHI Labortechnik AG,Switzerland)；超純水儀(Milli-Q Academic，美國Millipore公司)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890A 5975C，美國Agilent公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制將含有16種PAHs的濃度為100 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)母液用正己烷配制成10 mg/kg儲備液，于4 ℃冰箱中保存。使用前配制成所需濃度的系列工作液。

1.2.2樣品分析提取取新鮮煙葉置于冷凍干燥機(jī)中冷凍96 h后，用研缽研磨并過60目不銹鋼篩，保存于棕色玻璃瓶中。稱取1.000 0 g煙葉樣品用濾紙包裹后于索氏提取管中，向茄型瓶中加入二氯甲烷溶液70 mL，于恒溫水浴鍋中(53 ℃)索氏提取24 h后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(370 Pa，90 r/min，38 ℃)濃縮至干，用環(huán)己烷定容至2 mL待凈化。

1.2.3提取液凈化如圖1所示，儀器背面有2個2 L棕色溶劑瓶盛裝洗脫劑，玻璃色譜柱(長22.7 cm，直徑10 mm，底部小孔直徑5 mm)通過色譜柱安裝口與導(dǎo)液管和收集瓶相連。工作過程密閉，機(jī)械控制，通過控制屏設(shè)定不同污染物洗脫曲線的壓力和溶劑體積，可同時凈化4個樣品。色譜柱的裝填順序由下至上分別為篩板、5 g填料、2 g酸性硅膠(硅膠∶濃硫酸=2∶1，質(zhì)量比)、1 g無水硫酸鈉。儀器工作正壓和負(fù)壓分別設(shè)置為165 kPa和70 kPa，時間設(shè)置為25 s/次，用正己烷活化、平衡色譜柱4次(2 mL/次)。吸取0.5 mL提取液轉(zhuǎn)移至色譜分離柱中，壓強(qiáng)不變，時間設(shè)置為40 s/次，以正己烷-丙酮(4∶1)混合液洗脫6次(2 mL/次)。用帶刻度的尾形瓶收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(270 Pa，90 r/min，40 ℃)濃縮至少于1 mL，用正己烷定容至1 mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜后裝入棕色進(jìn)樣瓶，并保存于4 ℃冰箱中待測。

1.2.4GC-MS工作條件色譜條件：DB-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；氦氣(純度>99.999%)；流速為1 mL/min。升溫程序：柱室初始溫度為50 ℃，保持1 min，以25 ℃/min升至200 ℃，以8 ℃/min升至280 ℃，以1 ℃/min升至283 ℃，以2 ℃/min升至290 ℃，保持5 min。CTC自動以非脈沖不分流的方式進(jìn)樣1.00 μL，進(jìn)樣口溫度保持250 ℃，選擇SIM模式進(jìn)行外標(biāo)法定量分析，程序后運(yùn)行溫度設(shè)定為295 ℃。質(zhì)譜條件：電子能量為70 eV；電子轟擊(EI)離子源；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度260 ℃；質(zhì)量掃描范圍(m/z)為60～640 amu。

2　結(jié)果與討論

2.1提取劑的選擇

比較了正己烷、二氯甲烷和丙酮作為提取劑的提取效果。結(jié)果顯示，以丙酮作提取劑時，回收率為75.3%～90.6%，但提取液有大量色素影響測定；以正己烷作提取劑時，提取液色素少，但提取效率低，回收率為63.5%～ 82.1%。而以二氯甲烷作提取劑時，提取效率高，回收率為82.7%～104.8%，且提取液色素少，后續(xù)的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮耗時短。因此實(shí)驗(yàn)選擇二氯甲烷作提取劑，能有效提取出煙葉中的PAHs類化合物。

2.2凈化方法及色譜柱填料的優(yōu)選

比較了層析柱(規(guī)格為：25 cm×10 mm；層析柱和四通道色譜柱中填料的裝填保持一致)與四通道色譜分離儀對16種PAHs加標(biāo)樣品的洗脫凈化效果(表1)，洗脫劑均為正己烷-丙酮(4∶1)。結(jié)果表明：相比層析柱法，四通道色譜分離儀的洗脫回收率高，精密度好，溶劑用量少，耗時短。

表1　層析柱和四通道色譜分離儀凈化方法比較(n=6)Table 1　Comparison of two purification methods(n=6)

實(shí)驗(yàn)還比較了3種填料類型對煙葉中16種PAHs回收率的影響情況。填料類型Ⅰ：酸性硅膠/色譜柱填料/無水硫酸鈉(質(zhì)量比2∶5∶1)；填料類型Ⅱ：酸性硅膠/硅膠/無水硫酸鈉(質(zhì)量比2∶5∶1)；填料類型Ⅲ：酸性硅膠/無水硫酸鈉(質(zhì)量比2∶6)。結(jié)果表明：選擇填料類型Ⅰ時，回收率為87.3%～103.4%，能滿足凈化要求。

采用四通道色譜分離儀凈化后煙葉樣品的色譜圖見圖2，從圖中可觀察到樣品的雜質(zhì)峰較未凈化樣品顯著減少，有利于準(zhǔn)確定量。

2.3洗脫條件的選擇

比較了正己烷、丙酮、正己烷-丙酮(4∶1) 3種洗脫劑的洗脫凈化效果，結(jié)果表明以正己烷-丙酮(4∶1)作洗脫液時，其回收率為94.4%～106.3%，洗脫效率高，雜質(zhì)少，效果最佳。因此選擇正己烷-丙酮(4∶1)為洗脫劑。

在上述優(yōu)化條件下，采用“1.2.4”GC-MS分析程序?qū)?biāo)準(zhǔn)溶液及某煙葉樣品進(jìn)行分離，各目標(biāo)化合物能夠得到有效分離(見圖3)。

圖316種PAHs標(biāo)準(zhǔn)液(A)及煙葉樣品(B)的色譜圖(1 mg/kg)
Fig.3Chromatograms of 16 kinds of PAHs(1 mg/kg) standard(A) and an tobacc sample(B) 1.Nap,2.Any,3.Ane,4.Flu,5.Phe,6.Ant,7.Fla,8.Pyr,9.Chr,10.BaA,11.BbF,12.BkF, 13.BaP,14.IP,15.DBA,16.BghiP

2.4線性范圍與檢出限

在優(yōu)化條件下，選擇目標(biāo)化合物定量離子的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x,μg/kg)為橫坐標(biāo)，擬合16種PAHs的線性回歸方程(表2)。結(jié)果顯示，16種PAHs的線性范圍均為10～1 000 μg/kg，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.99，表明各化合物具有良好的線性關(guān)系。按3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算儀器的檢出限(LOD)，得LOD為0.35～1.75 μg/kg。按照樣品分析方法，準(zhǔn)確吸取100 μL 1 000 μg/kg的16種PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)液加入樣品中，重復(fù)實(shí)驗(yàn)7次，計(jì)算方法檢出限MDLs(MDLs=S×t(n-1,0.99),式中S為標(biāo)準(zhǔn)偏差，t(n-1,0.99)=3.143表示自由度為n-1、置信度為99%時的t值[25-26])。結(jié)果表明，16種PAHs的MDLs為1.01～2.87 μg/kg，方法的靈敏度能夠滿足煙葉中PAHs的分析要求。

表2　16種PAHs的線性范圍、保留時間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)與檢出限Table 2　Linear ranges,retention times,regression equations,coefficient correlations(r),limits of detection(LODs) and method detection limits(MDLs) of 16 PAHs

x:mass concentration of PAHs,μg/kg;y:peak area of PAHs

2.5精密度與準(zhǔn)確度

按照本方法對煙葉樣品進(jìn)行10,50，200 μg/kg 3個水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每一濃度水平重復(fù)6次。結(jié)果表明，煙葉樣品中16種PAHs的回收率為81.0%～107.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.7%～8.0%(見表3)，方法的精密度與準(zhǔn)確度能夠滿足煙葉樣品中PAHs的分析測定要求。

表3　煙葉樣品中16種PAHs的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3　Spiked recoveries and relative standard deviations(RSDs) of 16 PAHs in tobacco samples

2.6實(shí)際樣品分析

采用本方法測定了采自貴州的10個新鮮煙葉樣品，測定結(jié)果見表4。樣品中16種PAHs 的總含量為130.01～840.40 μg/kg，其中苯并[a]芘的含量最高，為74.47～243.44 μg/kg。

表4煙葉中16種PAHs的含量

Table 416 PAHs contents in tobacco leafw/(μg·kg-1)

*no detected

3　結(jié)　論

本文建立了四通道色譜分離/氣相色譜-質(zhì)譜測定煙葉中多環(huán)芳烴的新方法。與傳統(tǒng)的硅膠柱層析凈化法相比，四通道色譜分離儀凈化法具有洗脫率高、溶劑用量少、耗時短、精密度好等優(yōu)點(diǎn)。該方法簡便、快捷、靈敏度高，適合于煙草等作物中PAHs化合物的分析測定。

[1]Peng H,Wang W S.Environ.Monit.Chin.(彭華，王維思．中國環(huán)境監(jiān)測),2009,25(2):61-62,68.

[2]Wang H C,Hu L L,Li M,Chen W F,Wang Y,Zhou J J.Chin.J.PlantEcol.(王海翠，胡林林，李敏，陳為峰，王瑩，周佳佳.植物生態(tài)學(xué)報),2013,37(12):1123-1131.

[3]Sun R X,Ke C L,Lin Q,Shi F Q.J.Instrum.Anal.(孫閏霞，柯常亮，林欽，石鳳瓊．分析測試學(xué)報),2013,32(1):57-63.

[4]Bi H L,Zhang H Y,Sun C X,Rao Y,Su L K.J.Instrum.Anal.(畢鴻亮，張浩原，孫翠香，饒勇，蘇流坤．分析測試學(xué)報),2007,26(4):530-532.

[5]Buczyńska A J,Geypensa B,Grieken R V,Wael K D.Microchem.J.,2015,119(3):83-92.

[6]Sánchez N E,Jesús S,Callejas A,ngela M,Bilbao R,María U A.Fuel,2013,107(5):246-253.

[7]Dong J,Li F,Xie K.J.Hazard.Mater.,2012,243(12):80-85.

[8]Céline L,Maurice M,Stéphane L C.Talanta,2015,131(1):386-394.

[9]Wang H J,Liu L,Liu Z H,Wu J W,Li Y,Yang Z J,Chen X Y,Chen Q Y,Li B,Yu S Y.Phys.Test.Chem.Anal.:Chem.Anal.(王宏菊，劉麗，劉志紅，吳景武，李英，楊左軍，陳向陽，陳麒宇，李彬，余淑媛．理化檢驗(yàn)：化學(xué)分冊),2009,45(5):546-548,551.

[10]Zheng X Y,He L J,Zhang K G,Jiang X M,Xiang G Q,Liu J P.J.Instrum.Anal.(鄭小焱，何麗君，張凱歌，江秀明，向國強(qiáng)，劉建平．分析測試學(xué)報),2014,33(5):566-571.

[11]Cui Y H,Ju T Z,Cao J,Tao P.J.Agro-Environ.Sci.(崔艷紅，巨天珍，曹軍，陶澎．農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報),2003,22(3):364-367.

[12]Tang L L,Tang X Y,Zhu Y G,Zheng M H,Miao Q L.Environ.Int.,2005,31(6):822-828.

[13]Ma L L,Chu S G,Wang X T,Cheng H X,Liu X F,Xu X B.Chemosphere,2005,58(10):1355-1363.

[14]Cao X L,Yang X Q,Liu S H.Chin.J.HealthLab.Technol.(曹小麗，楊曉倩，劉素華．中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志),2013,23(12):2580-2582,2629.

[15]Zhang X,Liu X W,Luo M,Wang L,Li H,Wang D,Xu Y P.Environ.Chem.(張茜，劉瀟威，羅銘，王璐，李紅，王迪，徐亞平．環(huán)境化學(xué)),2011,30(4):771-777.

[16]Xu P J,Zhang T,Ren Y,Qi L,Yang W L,Huang Y R.J.Instrum.Anal.(許鵬軍，張烴，任玥，齊麗，楊文龍，黃業(yè)茹．分析測試學(xué)報),2012,31(9):1126-1131.

[17]Li Z,Chen L,Gao H W,Yuan Y,Zhao J F.Environ.Chem.(李竺，陳玲，郜洪文，袁園，趙建夫．環(huán)境化學(xué)),2006,25(4):503-507.

[18]Siemers A K,M?nz J S,Palm W U,Ruck W K.Chemosphere,2015,122(3):105-114.

[19]Wang L,Jin F,Li M J,Liu M,Jiao B N,Shao H,Jin M J,Wang J.Chin.J.Anal.Chem.(王麗，金芬，李敏潔，劉明，焦必寧，邵華，金茂俊，王靜．分析化學(xué)),2013,41(6):869-875.

[20]Wang J H,Guo C,Pang G F,Zhang Y B.J.Instrum.Anal.(王建華,郭翠,龐國芳,張藝兵.分析測試學(xué)報),2009,28(3):267-271.

[21]Ratola N,Alves A,Kalogerakis N,Psillakis E.Anal.Chim.Acta,2008,618:70-78.

[22]Li Q B,Luo Y M.ChinaPatent(李清波，駱永明．中國專利),200420054236.5.[2006-08-16].

[23]Li Q B,Luo Y M,Liu W X.ChinaPatent(李清波，駱永明，劉五星．中國專利),201110308122.3.[2012-06-20].

[24]Ma J,Teng Y,Lu Y G,Ren W J,Ma W T.Chin.J.Anal.Lab.(馬軍，滕應(yīng)，陸引罡，任文杰，馬文亭．分析試驗(yàn)室),2016,35(2):171-175.

[25]Huang Y J,Chen Y S,Luo Y M,Zhang H B,Song J.Environ.Chem.(黃玉娟，陳永山，駱永明，章海波，宋靜．環(huán)境化學(xué)),2013,32(4):658-665.

[26]Ma J,Teng Y,Ma W T,Lu Y G.Phys.Test.Chem.Anal.:Chem.Anal.(馬軍，滕應(yīng)，馬文亭，陸引罡.理化檢驗(yàn)：化學(xué)分冊)，2016,52(4):392-396.

Determination of 16 Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Tobacco(NicotianaTabacum L.) by Four-channel Chromatograph Purification Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometry

MA Jun1,2,3,TENG Ying2,LU Yin-gang1*,GAN Xin-hong2,REN Wen-jie2,MA Wen-ting2

(1.College of Agriculture,Guizhou University,Guiyang550025,China;2.Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation,Institute of Soil Science,Chinese Academy of Sciences,Nanjing210008,China；3.Collge of Materials and Chemistry,Tongren University,Tongren554300，China)

A method for the simultaneous determination of 16 polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs) in tobacco by four-channel chromatograph purification coupled with gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) was developed.The tobacco samples were extracted by the method of soxhlet extraction with dichloromethane,and the extract was cleaned with four-channel purification chromatograph.The eluent were determined by GC-MS in SIM mode,and quantitated by a method of external standard.The procedure of separation and purification for fresh tobacco extraction was optimized.The results indicated the calibration curves of 16 PAHs had good linear relationships in the range of 10-1 000 μg/kg(r>0.99).The detection of limits(LODs) and method detection limits(MDLs) were 0.35-1.75 μg/kg and 1.01-2.87 μg/kg,respectively.The recoveries at three spiked concentration levels were in the range of 81.0%-107.8%with relative standard deviations(RSD,n=6) of 2.7%-8.0%.The method is suitable for the determination of PAHs in tobacco or other crops with easy operation,rapidness,high repeatability and strong practicability.

four-channel purification chromatograph;gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs);purification;tobacco

2015-11-09；

2016-03-30

環(huán)保公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201109018)

陸引罡，博士，教授，研究方向：植物生理與遺傳，Tel：13809418667，E-mail:agr.yglu@gzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.007

O657.63;O625.15

A

1004-4957(2016)08-0968-06