孟凡東，李妍，吳迪，蔣濤，王揚，隋承光，姜又紅

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所二室，沈陽 110001）

·論著·

Wnt/β-catenin信號通路中Wnt基因對腎癌細胞的生物學影響

孟凡東，李妍，吳迪，蔣濤，王揚，隋承光，姜又紅

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所二室，沈陽 110001）

目的探討Wnt基因對腎透明細胞癌Caki-2細胞的生物學影響。方法細胞分3組：Caki-2組（空白對照）、shRNA+ Wnt+Caki-2組（慢病毒沉默Caki-2細胞中的Wnt基因）、空載體組（實驗對照），CCK-8法觀察不同時間各組細胞的增殖情況；透射電鏡觀察沉默Wnt基因對Caki-2細胞凋亡的影響；Transwell小室方法檢測各組細胞侵襲能力的變化；實時PCR觀察Wnt/ β-catenin信號通路中下游基因的變化和凋亡相關基因的變化。結果shRNA+Wnt+Caki-2組出現(xiàn)了細胞增殖抑制，其增殖能力與其他2組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。shRNA+Wnt+Caki-2組表現(xiàn)出明顯的細胞凋亡變化，出現(xiàn)凋亡小體。侵襲實驗顯示，shRNA+Wnt+Caki-2組遷出的細胞數明顯低于其他2組（P＜0.05）；shRNA+Wnt+Caki-2組中Wnt mRNA、β-catenin mRNA 和Bcl-2mRNA的表達水平均低于其他2組（P＜0.05）。結論慢病毒沉默Wnt基因，影響了腎透明細胞癌Caki-2細胞的增殖，促進了細胞的凋亡，抑制了Caki-2細胞的侵襲。

腎癌；Wnt；β-catenin；Bcl-2

腎細胞癌是腎臟最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，占腎臟原發(fā)性惡性腫瘤的90%，居我國泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的第二位。目前，根治性腎切除是治療腎細胞癌的最有效手段，但行腎切除術的患者有40%最終復發(fā)。因此，尋找有效的治療藥物成為首要的難題。Wnt/β-catenin信號通路因其作用的廣泛性，成為近年來的研究熱點。Wnt/β-catenin信號與多種疾病密切相關，疾病的發(fā)生往往與細胞的死亡方式有著密不可分的關系，細胞死亡方式的不同對疾病也有不同的影響。本研究擬利用RNA干擾技術，探討Wnt信號通路在腎細胞癌增殖及凋亡中的作用。

1　材料與方法

1.1細胞系

腎癌Caki-2細胞購自昆明細胞庫。

1.2主要試劑

McCoy’s 5A培養(yǎng)基（美國HyClone公司），胎牛血清、胰酶（美國GIBCO公司），CCK-8試劑盒（中國凱基公司），實時PCR試劑盒（日本Takara公司），Matrigel（美國BD公司），抗體Bcl-2、β-catenin和HRP標記羊抗鼠IgG（美國Sigma公司），慢病毒構建針對Wnt設計的shRNA載體由上?；鶢栴D公司合成。

1.3細胞培養(yǎng)和分組

Caki-2細胞用含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，放置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，倒置顯微鏡下觀察，3～4 d換液1次，待細胞長至75%左右密度時，用胰酶消化，按1∶3進行傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，部分-80℃保存，以備用。細胞分3組：Caki-2組，培養(yǎng)的Caki-2細胞中不加處理因素，作為空白對照；shRNA+Wnt+Caki-2組，用構建的慢病毒載體轉染Caki-2細胞沉默細胞中的Wnt基因，為實驗組；空載體組，用空的慢病毒載體轉染Caki-2細胞，作為實驗對照。

1.4細胞增殖

細胞培養(yǎng)至75%左右密度時，用胰酶進行消化，細胞計數，按每孔1×104/mL接種于96孔板中。每組細胞設置3個復孔。培養(yǎng)12、24、48 h后，每孔加10 μL CCK-8試劑，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，2 h后酶標儀測定450 nm波長的光度值。

1.5細胞凋亡

電鏡觀察細胞的凋亡情況，取對數生長期的細胞按4×105/mL接種于6孔板中，48 h后胰酶消化細胞，1 000 r/min、4℃離心8 min，冷Palade緩沖液洗滌3次，將細胞懸浮于1%的鋨酸中，4℃固定1 h，Palade緩沖液洗滌3次，將細胞懸浮于1%的鋨酸中，固定1 h。用丙酮梯度脫水，再將細胞置于丙酮/包埋劑（1∶1）中置換30 min。包埋劑浸潤2 h后，將細胞進行包埋、切片、醋酸鈾及枸櫞酸鉛染色。電鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。

1.6細胞侵襲

取對數生長期的各組細胞，用無血清培養(yǎng)基將細胞按密度為每孔2×105/mL接種于Transwell小室的上室，下面的小室中加入500 μL 20%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中，24 h后取出Transwell小室，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色15 min，顯微鏡觀察，計數細胞。

1.7相關基因的表達

收集對數生長期的不同組細胞，依據PCR試劑盒的說明書進行總RNA的提取，測其濃度，保證OD260/280比值在1.8～2.0之間才可以進行后續(xù)實驗。由大連生工生物工程公司進行引物的設計和合成。Wnt：F，5′-GGTTCCATCGAATCCTGCA-3′，R，5′-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3′；Bcl-2：F，5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′，R，5′-TGCATAT TTGTTTGGGGCAGG-3′；β-catenin：F，5′-AAAGCGG CTGTTAGTCACTGG-3′，R，5′-GACTTGGGAGGT ATCCACATCC-3′；GAPDH：F，5′-TGTTGCCATCAA TGACCCCTT-3′，R，5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。總反應體系及條件：50 μL，95℃預變性5 min，90℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)。將目的基因值與參照基因值進行比值計算，得到Wnt mRNA、Bcl-2 mRNA、β-catenin mRNA的相對含量。

1.8統(tǒng)計學方法

2　結果

2.1沉默Wnt基因對腎癌Caki-2細胞增殖的影響

為觀察Wnt基因對Caki-2細胞增殖的影響，采用CCK-8法觀察各組細胞的增殖能力。結果顯示，作用48 h后，shRNA+Wnt+Caki-2組細胞增殖能力（0.390 0±0.005 5）明顯受到抑制，與Caki-2組（0.730 0± 0.004 7）和空載體組（0.670 0±0.006 4）相比，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖1。

2.2沉默Wnt基因對腎癌Caki-2細胞凋亡的影響

透射電鏡觀察沉默Wnt基因后各組Caki-2細胞的凋亡情況。在電鏡下可以觀察到，凋亡細胞的細胞質出現(xiàn)濃縮，內質網與細胞膜融合形成空泡，線粒體的體積增大，細胞核變小，染色質高度濃縮并凝結成塊，可觀察到凋亡小體的出現(xiàn)，shRNA+Wnt+ Caki-2組細胞出現(xiàn)的凋亡小體更加明顯。見圖2。

2.3沉默Wnt基因對腎癌Caki-2細胞侵襲的影響

利用Transwell小室方法驗證沉默Wnt基因對Caki-2細胞侵襲能力的影響，結果顯示：shRNA+ Wnt+Caki-2組細胞（29±8）與Caki-2組細胞（53±6）和空載體組細胞（49±8）的侵襲能力相比，穿過Transwell小室膜的細胞數明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖1　CCK-8法檢測各組Caki-2細胞增殖能力的變化Fig.1　The cell proliferation of Caki-2 cells in each group detected by CCK-8

圖2　電鏡觀察各組Caki-2細胞的凋亡情況Fig.2　The Caki-2 cell apop tosis in each groups observed under electron m icroscope

2.4沉默Wnt基因對相對基因表達的影響

實時熒光定量PCR法檢測沉默Wnt基因后各組Caki-2細胞中相關基因表達的情況。實驗結果顯示，shRNA+Wnt+Caki-2組與其他2組相比，Wnt mRNA和β-catenin mRNA的表達水平明顯減低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。shRNA+Wnt+Caki-2 組Bcl-2mRNA的水平低于其他2組（P＜0.05），但Caki-2組和空載體組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見圖4。

圖3　各組Caki-2細胞侵襲穿膜情況Fig.3　The Caki-2 cell invasion assay and staining of the transmembrane ce lls of each groups

3　討論

Wnt蛋白是一類富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，脊椎動物中已發(fā)現(xiàn)至少19種，在細胞分泌液中可以檢測到一些含有糖基化N末端的Wnt蛋白，提示Wnt蛋白的分泌在細胞內受到高度的調控。Wnt信號通路是一條在進化上相對保守的信號途徑，它有著廣泛的生物學效應，對個體發(fā)育、細胞分化、凋亡和壞死等有著重要影響，對生命體大多數生物學現(xiàn)象都有調控作用。有文獻［1］指出，某些細胞中Wnt/β-catenin信號通路可促進細胞的凋亡，在大多數良性黑色素痣中發(fā)現(xiàn)存在β-catenin，一旦βcatenin的含量下降，將會導致良性黑痣向惡性黑色素瘤發(fā)展。腫瘤的發(fā)生發(fā)展常與細胞異常生長密切相關，并伴隨癌基因的激活、抑癌基因的失活、細胞周期調控紊亂和表觀遺傳學改變等多方面機制的改變［2］。

圖4　沉默W nt基因對Caki-2細胞基因表達的影響Fig.4　The influence of Wnt gene silencing on gene expression in Caki-2 cells

腎細胞癌中85%為透明細胞癌，其他類型比較少見，因此本研究選用Caki-2細胞作為實驗細胞。本研究通過慢病毒沉默Wnt基因的表達，觀察了Caki-2細胞的增殖、凋亡的變化。研究結果顯示，沉默Wnt基因組的細胞增殖率明顯下降。對Wnt信號通路中Wnt蛋白這一非常重要的啟動因子進行抗原抗體反應，從而抑制Wnt蛋白與胞膜受體結合，引起了細胞增殖的改變。

也有研究［3］認為，細胞在缺氧復氧處理過程中激活Wnt/β-catenin信號能顯著增加caspase-3的活性，即促進了細胞的凋亡。為了觀察Wnt基因對腎癌Caki-2細胞凋亡的影響，本研究應用透射電鏡觀察了沉默Wnt基因后各組細胞凋亡的變化，shRNA+ Wnt+Caki-2組細胞的細胞質出現(xiàn)明顯的濃縮，內質網與細胞膜融合形成空泡，線粒體的體積增大，細胞核變小，染色質高度濃縮并凝結成塊，可觀察到凋亡小體的出現(xiàn)。

Bcl-2是細胞凋亡重要的調控基因。本研究又通過實時PCR法檢測了Bcl-2mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)沉默Wnt基因的腎癌細胞組Bcl-2mRNA的表達水平明顯降低。有研究［4～6］顯示，腫瘤組織中Bcl-2的過表達與乳腺癌、腸癌和肺癌的預后呈正相關，但本研究的結果與其存在一定的差異，有可能是腫瘤組織類型不同，或是腫瘤組織和腫瘤細胞系中Bcl-2的表達也會存在差異。β-catenin是細胞質中一種重要的多功能蛋白，具有介導細胞黏附及參與Wnt信號傳導的雙重功能［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，shRNA+Wnt+ Caki-2組β-catenin mRNA的表達量也高于其他2組。β-catenin由胞質向胞核的轉位被認為是該信號通路被激活后行使功能的標志［8］。當Wnt/β-catenin信號傳導通路活化異常時，下游靶基因的異常表達使細胞增殖增快，引起蛋白質異常表達，導致細胞癌變加速［9］。

腫瘤的浸潤與轉移是一個多步驟的復雜過程，涉及細胞從原發(fā)灶脫落浸潤穿透基底膜降解細胞外基質和遠處轉移。本研究證實，Wnt/β-catenin信號通路在腎癌細胞的增殖及凋亡中發(fā)揮重要作用，為了進一步研究該信號通路的作用，采用Transwell小室方法觀察了沉默Wnt基因后，各組細胞侵襲能力的變化。研究結果顯示，沉默Wnt組的Caki-2細胞表現(xiàn)出明顯的侵襲能力受到抑制。

腫瘤中異常Wnt信號轉導的研究還處于探索階段，有許多問題尚不清楚。本研究通過干擾Wnt/βcatenin信號通路中的Wnt蛋白，觀察了腎癌Caki-2細胞的變化，發(fā)現(xiàn)沉默Wnt基因后細胞增殖受到抑制，促進了細胞的凋亡，侵襲能力也受到限制。腎癌的發(fā)生發(fā)展是由多因素導致、多基因參與、多步驟形成的復雜病理生理過程。選擇合適的藥物和有效的治療手段對于腎癌患者至關重要。綜上所述，本研究為腎癌的藥物研發(fā)及治療靶點提供了一定的理論依據。

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（編輯陳姜）

BiologicalEffectsof Wnt inW nt/β-catenin Signaling Pathway on Kidney Cancer Cell

MENG Fan-dong，LI Yan，WU Di，JIANG Tao，WANG Yang，SUI Cheng-guang，JIANG You-hong
（Second Laboratory of Tumor Research Institute，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the biological effects of Wnt gene in kidney cancer Caki-2 cells.M ethodsThe Wnt gene was silenced in kidney cancer Caki-2 cells by lentivirus vector.The cell proliferate ability of cells in each group were assayed by CCK-8 kit at different time points. TheapoptosisofCaki-2 cellswasobserved aftersilencing Wnt geneby transmission electronmicroscope.The invasion abilityofeach group cellswas tested using Transwell chambers.The genes expression changes of Wnt/β-catenin signaling pathway and apoptosis related gene were determined by realtime PCR.ResultsCompared with the other two groups，the cell proliferate ability of the cells after silencing Wnt gene was suppressed，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Apoptosis increased significantly in shRNA+Caki-2+Wnt group cells with silencing of Wnt gene，and apoptotic body appeared in these cells.In invasive experiment，the number of emigrated cells in shRNA+Caki-2+Wnt group were significantly lower than other groups（P＜0.05）.The expression of Wnt mRNA，β-catenin mRNA and Bcl-2mRNA in shRNA+Caki-2+Wnt group cells was lower than other groups（P＜0.05）.ConclusionSilencing of Wnt gene of kidney cancer Caki-2 cells can affect the proliferation rate of the cells，promote the cell apoptosis，and inhibit the invasion ability，which provide certain theoretical basis for the research and development of new drugs and new therapeutic targets.

kidney cancer；Wnt；β-catenin；Bcl-2

·論著·

R730.23

A

0258-4646（2016）04-0289-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.001

國家自然科學基金（81202955）；遼寧省教育廳高校重點實驗室支持計劃項目（LS2010170）

孟凡東（1970-），男，副教授，博士. E-mail：dd528@126.com

2015-12-02

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