俞俊文,劉獻(xiàn)文

(1.新疆維吾爾自治區(qū)葉城縣人民醫(yī)院，新疆喀什 844900 2.寧波美康生物科技股份有限公司，浙江寧波 315105)

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·臨床研究·

尿RBP膠乳增強(qiáng)免疫比濁檢測(cè)方法的建立及性能評(píng)價(jià)

俞俊文1,劉獻(xiàn)文2

(1.新疆維吾爾自治區(qū)葉城縣人民醫(yī)院，新疆喀什 844900 2.寧波美康生物科技股份有限公司，浙江寧波 315105)

目的根據(jù)膠乳增強(qiáng)免疫比濁原理，建立一種尿視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)檢測(cè)方法。方法將RBP多克隆抗體標(biāo)記到膠乳微球表面，利用抗原抗體凝集反應(yīng)原理，建立了尿RBP免疫檢測(cè)方法，并對(duì)本方法進(jìn)行了精密度、準(zhǔn)確度、線性、穩(wěn)定性試驗(yàn)和相關(guān)性試驗(yàn)。結(jié)果本檢測(cè)方法的靈敏度為0.2 mg/L，對(duì)濃度為1.07 mg/L的低值質(zhì)控品重復(fù)測(cè)定20次，其精密度為2.28%；線性范圍為0.5～10.0 mg/L，對(duì)高、低濃度質(zhì)控品的相對(duì)偏差為-6.03%和-2.95%，與RBP酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒的決定系數(shù)R2為0.998 6。結(jié)論該研究建立了尿RBP膠乳增強(qiáng)免疫比濁檢測(cè)方法，各項(xiàng)性能指標(biāo)均達(dá)到臨床檢測(cè)要求，可用于臨床尿RBP濃度的檢測(cè)。

尿視黃醇結(jié)合蛋白；膠乳增強(qiáng)免疫比濁法；精密度；準(zhǔn)確度

視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)是由肝臟合成，自由通過腎小球，由腎小管近曲端上皮細(xì)胞重吸收并降解[1-2]。尿RBP濃度升高，提示腎小管近曲端重吸收功能障礙。尿RBP濃度與腎小管間質(zhì)損壞程度呈明顯正相關(guān)，可作為檢測(cè)腎小管的病變病程，指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后的一項(xiàng)靈敏的生化指標(biāo)[3-4]。目前國內(nèi)RBP檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫比濁法，其中ELISA操作復(fù)雜，不能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)；而免疫比濁法的靈敏度低。本研究利用膠乳增強(qiáng)免疫比濁原理，建立了一種尿RBP檢測(cè)方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2014年11月1～30日葉城縣人民醫(yī)院腎病患者尿標(biāo)本45例，其中男20例，年齡25～50歲；女25例，年齡30～55周歲。

1.2儀器與試劑RBP多克隆抗體、RBP質(zhì)控品、膠乳微球均為寧波美康生物科技股份有限公司提供。采用RBP ELISA檢測(cè)試劑盒(上海西塘生物科技有限公司)，7180型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3方法

1.3.1膠乳微球的活化用50 mmol/L pH6.0的MES緩沖液稀釋膠乳,稀釋至乳膠微球體積分?jǐn)?shù)為2%，取100 mL，加入碳二亞胺(EDAC)100 mg，室溫反應(yīng)1 h，離心6 000 r/min 15 min，去上清液，沉淀懸浮于50 mmol/L pH6.0的MES緩沖液中，超聲分散；再次離心，去上清液，沉淀懸浮于50 mmol/L pH6.0的MES緩沖液中，超聲分散。

1.3.2膠乳微球的致敏邊攪拌邊加入10 mg RBP抗體，室溫反應(yīng)1 h。6 000 r/min離心15 min，去上清液，沉淀懸浮于50 mmol/L pH6.0的MES緩沖液中，體積分?jǐn)?shù)為1%，超聲分散，加入2%牛血清白蛋白(BSA)，4 ℃封閉過夜。離心去上清液，用分散液(50 mmol/L pH7.5的三羥甲基氨基甲烷+1% BSA+0.1%疊氮化鈉)溶解膠乳，體積分?jǐn)?shù)為0.2%，超聲分散。

1.3.3性能評(píng)價(jià)測(cè)定儀器采用日立7180全自動(dòng)生化分析儀，分析方法為兩點(diǎn)終點(diǎn)法。分析參數(shù)R1為240 μL，R2為60 μL，標(biāo)本為10 μL；波長為546 nm。測(cè)定步驟：先加入R1和標(biāo)本，于37 ℃孵育5 min后，加入R2，立即讀取第一點(diǎn)吸光度值，計(jì)時(shí)反應(yīng)5 min后，讀取第二點(diǎn)吸光度值，計(jì)算兩點(diǎn)吸光度差值。定標(biāo)曲線制作：以定標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)，各濃度定標(biāo)液對(duì)應(yīng)的吸光度差值為縱坐標(biāo)，做logit-log(4p)函數(shù)曲線。標(biāo)本濃度計(jì)算方法：根據(jù)標(biāo)本的吸光度值差值，代入定標(biāo)曲線，計(jì)算相對(duì)應(yīng)的濃度值。

2　結(jié)　　果

表1　　靈敏度分析

2.2精密度測(cè)試將高、低濃度質(zhì)控品各重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算精密度。本檢測(cè)方法精密度為≤10%。采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁檢測(cè)法檢測(cè)質(zhì)控品在高(4.51 mg/L)、低(1.07 mg/L)兩種濃度下的測(cè)量值，各重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算精密度。本檢測(cè)方法精密度為≤10%。結(jié)果顯示，在高、低兩種濃度下的精密度分別為1.57%、2.28%。

2.3準(zhǔn)確度測(cè)試重復(fù)測(cè)定高、低濃度的兩份質(zhì)控品，各重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算相對(duì)偏差。本檢測(cè)方法檢測(cè)質(zhì)控品的相對(duì)偏差≤10%，說明方法具有很好的準(zhǔn)確度。見表2。

表2　　準(zhǔn)確度分析

2.4線性范圍測(cè)試將RBP為10 mg/L的高濃度尿標(biāo)本用生理鹽水按照1.00、0.95、0.90、0.80、0.70、0.60、0.50、0.40、0.30、0.20、0.10、0.05的稀釋比例進(jìn)行稀釋，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次。以稀釋比例為橫坐標(biāo)，以測(cè)定值為縱坐標(biāo)作圖，進(jìn)行線性相關(guān)性分析。本檢測(cè)方法對(duì)尿標(biāo)本RBP的檢測(cè)范圍為0.5～10.0 mg/L。見圖1。

圖1　　檢測(cè)試劑線性分析

2.5抗干擾性在同一份人血清標(biāo)本中分別加入不同濃度的干擾物質(zhì)后進(jìn)行測(cè)定。加入干擾物質(zhì)后的測(cè)定值與加入干擾物質(zhì)前的測(cè)定值之間的差值除以加入干擾物前的測(cè)定值比值即為干擾率。分別加入以下5種干擾物質(zhì)，其結(jié)果為：(1)結(jié)合膽紅素添加量為0.0、37.5、75.0、100.0、150.0 mg/dL，干擾率分別為0.0%、0.0%、-1.0%、1.0%、-0.2%；(2)血紅蛋白添加量為0.0、125.0、250.0、375.0、500.0 mg/L，干擾率分別為0.0%、0.7%、-0.4%、-1.1%、-2.1%；(3)維生素C(VC)添加量為0.0、7.5、15.0、22.5、30.0 mg/L，干擾率分別為0.0%、-1.4%、-0.3%、-2.0%、-2.4%；(4)葡萄糖添加量為0.0、250.0、500.0、750.0、1 000.0 mg/L，干擾率分別為0.0%、0.2%、0.5%、1.0%、1.4%；(5)尿微量白蛋白(mAlb)添加量為0.0、25.0、50.0、75.0、100.0 mg/L，干擾率分別為0.0%、0.0%、0.0%、0.0%、0.0%。試驗(yàn)結(jié)果表明結(jié)合膽紅素、血紅蛋白、VC、葡萄糖和mAlb的濃度分別在150.0、500.0、30.0、1 000.0、100.0 mg/dL時(shí)，它們對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾率均在3%以下。

2.6相關(guān)性分析采用本檢測(cè)方法和RBP ELISA檢測(cè)試劑盒，分別對(duì)45份人尿液進(jìn)行測(cè)定，本檢測(cè)方法和對(duì)照試劑的決定系數(shù)R2為0.998 6，建立回歸方程Y=1.008 7X-0.029 8。該結(jié)果表明檢測(cè)方法與對(duì)照試劑具有很好的相關(guān)性。見圖2。

圖2　　兩種方法檢測(cè)值的回歸直線

3　討　　論

隨著社會(huì)環(huán)境和自然環(huán)境的日益變化，以及人口結(jié)構(gòu)的老齡化，高血壓、糖尿病、冠心病、惡性腫瘤等慢性疾病已經(jīng)成為危害國人健康的主要疾病。這些慢性疾病最容易累積腎臟，引起腎臟的病變。由于當(dāng)前國內(nèi)基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的資源配備不足，導(dǎo)致慢性基礎(chǔ)疾病的控制不佳或者不斷進(jìn)展，腎臟也在不知不覺中發(fā)生損傷，然而其強(qiáng)大的代償能力使得腎臟的慢性損傷缺乏明顯的臨床癥狀。由于臨床表現(xiàn)隱匿，往往不易早期發(fā)現(xiàn)，也失去了最好的干預(yù)治療時(shí)機(jī)。因此早期的腎臟診斷指標(biāo)就顯得尤為重要。

目前，評(píng)價(jià)腎小管損傷的內(nèi)源性指標(biāo)主要有N-乙酰-B-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、β2-微球蛋白(β2-MG)等[5-6]。以上標(biāo)志性蛋白均受諸多因素影響，限制了其臨床應(yīng)用價(jià)值。NAG主要分布于近段小管上皮細(xì)胞中，尿NAG主要由腎小管上皮細(xì)胞破損，溶酶體破裂后釋放所致。腎小管輕微受損時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞受損但沒有大量溶酶體破裂，從而使尿中NAG濃度較低，不能準(zhǔn)確地反映腎小管間質(zhì)損害程度[7]。β2-MG是有體內(nèi)有核細(xì)胞產(chǎn)生，其血中濃度易受慢性炎癥、肝病、腫瘤、病毒感染等影響而升高，腎小管重吸收β2-MG的閾值為5 mg/L，當(dāng)非腎性疾病導(dǎo)致β2-MG合成顯著增多時(shí)，血中濃度超過閾值，可出現(xiàn)腎小管非重吸收功能受損的β2-MG尿，血清和尿中均可增高，影響了其特異性；而且β2-MG在酸性尿中極不穩(wěn)定，影響了其檢測(cè)準(zhǔn)確度[8-9]。

而RBP是肝臟合成并分泌的一種低分子量蛋白，游離的RBP能迅速被腎小球?yàn)V過，幾乎全部被腎近曲小管重吸收而分解，尿液中RBP含量甚微。正常情況下，RBP在尿液中性能穩(wěn)定，不易分解，不受尿pH值和血壓的影響，當(dāng)腎近曲小管損傷時(shí)，其尿液中含量明顯增加。尤其當(dāng)慢性腎病患者近端腎小管有損傷時(shí)，血β2-MG以及內(nèi)生肌酐清除率尚在正常范圍內(nèi)，RBP排泄量便有明顯增加。因此RBP是較為理想的反映腎小管間質(zhì)受損的敏感特異性標(biāo)志物，對(duì)診斷腎小管間質(zhì)受損及受損程度、監(jiān)控治療效果具有重要的應(yīng)用價(jià)值和臨床意義[10-13]。

綜上所述，本研究采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁原理建立了尿RBP檢測(cè)方法，具有良好的靈敏度、精密度、線性、準(zhǔn)確度和相關(guān)性。并且在全自動(dòng)生化儀上進(jìn)行尿RBP檢測(cè)操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、適合常規(guī)檢測(cè)，與其他指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)能為腎臟損傷的部位和程度提供更準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，值得臨床推廣應(yīng)用。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.054

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1673-4130(2016)17-2481-03

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2016-05-01)