羅海燕，官春云

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所，長(zhǎng)沙 410128)

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化學(xué)雜交劑SX-1誘導(dǎo)油菜花粉敗育的細(xì)胞學(xué)觀察

羅海燕，官春云

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所，長(zhǎng)沙 410128)

通過石蠟切片和用Sudan Black B進(jìn)行花藥脂染色，對(duì)化學(xué)雜交劑SX-1誘導(dǎo)的油菜雄性不育花藥發(fā)育進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)觀察。結(jié)果表明，SX-1對(duì)油菜花藥發(fā)育各個(gè)時(shí)期都有一定影響，一類是花粉敗育發(fā)生在造孢細(xì)胞時(shí)期到四分體時(shí)期，絨氈層細(xì)胞異常加厚、提前解體或是液泡化；另一類是絨氈層細(xì)胞延遲解體，單核小孢子不能發(fā)育為成熟的花粉粒?；ㄋ幹旧Y(jié)果表明，SX-1影響了絨氈層細(xì)胞的油脂積累，油脂代謝受到抑制，不能為花粉外壁形成提供充足的脂類物質(zhì)，是單核小孢子不能發(fā)育為成熟花粉粒的原因之一。

油菜；雄性不育；細(xì)胞學(xué)；絨氈層；化學(xué)雜交劑

由于作物在長(zhǎng)期進(jìn)化繁衍過程中形成了雌配子與雄配子之間對(duì)環(huán)境條件反應(yīng)的差異，雄配子比雌配子對(duì)諸如溫度、水分、化學(xué)物質(zhì)等的敏感性強(qiáng)，因而在不良環(huán)境中存在雄配子敗育現(xiàn)象。一類能夠誘導(dǎo)植物雄配子敗育的化學(xué)物質(zhì)，被稱為化學(xué)雜交劑(Chemical hybridization Agent，簡(jiǎn)稱CHA)，也稱化學(xué)殺雄劑。利用化學(xué)雜交劑選育和生產(chǎn)油菜雜種是當(dāng)前油菜雜種選育和制種的重要途徑之一，探究化學(xué)雜交劑誘導(dǎo)雄性不育的機(jī)理，對(duì)化學(xué)雜交劑的應(yīng)用以及開發(fā)具有指導(dǎo)意義。已有的研究表明，化學(xué)雜交劑SX-1殺雄效果好、對(duì)雌蕊授粉后結(jié)實(shí)正常、植株沒有明顯藥害，在生產(chǎn)上被大量使用[1～3]。但是對(duì)SX-1誘導(dǎo)油菜雄性不育的機(jī)理基礎(chǔ)研究較少。本試驗(yàn)對(duì)化學(xué)雜交劑SX-1誘導(dǎo)的雄性不育花藥小孢子發(fā)育過程進(jìn)行石蠟切片細(xì)胞學(xué)觀察，并用Sudan Black B進(jìn)行花藥脂染色，探討花藥細(xì)胞發(fā)育變化和小孢子敗育時(shí)期、方式、特點(diǎn)以及絨氈層細(xì)胞油脂代謝變化，以期對(duì)化學(xué)雜交劑誘導(dǎo)油菜雄性不育的機(jī)理有進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為甘藍(lán)型油菜品種滬油15號(hào)，種子由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所提供。SX-1購(gòu)買自陜西省雜交油菜研究中心，該雜交劑由兩種制劑組成，名為1號(hào)制劑和2號(hào)制劑。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)材料播種于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地，小區(qū)種植，行距50 cm，株距10 cm，實(shí)驗(yàn)地采取常規(guī)田間管理。依據(jù)SX-1配制使用說明及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SX-1對(duì)滬油15的使用最適濃度為：1號(hào)制劑施用濃度為6.8 mg/L，2號(hào)制劑施用濃度為8.0 mg/L。具體使用時(shí)期如下：在油菜主花序最大花蕾長(zhǎng)2～3 mm時(shí)，此時(shí)油菜株高20～30 cm，用手持噴霧器對(duì)油菜植株噴施1號(hào)制劑。噴施1號(hào)制劑后10 d左右用2號(hào)制劑進(jìn)行第二次噴施。兩次的噴施劑量相同，平均每株油菜用量約10 mL。對(duì)照組噴以等量的清水。油菜開花后，取不同大小可育株和不育株花蕾，用1%醋酸洋紅染色確定花藥中小孢子發(fā)育時(shí)期，分組取樣，浸泡于FAA固定液(38%甲醛5 mL∶冰醋酸5 mL∶70%酒精90 mL)，用于制作切片。

1.3花藥細(xì)胞學(xué)觀察

石蠟切片參照陳平平[4]和李栒[5]的方法：材料經(jīng)不同濃度的乙醇脫水、二甲苯-乙醇透明、石蠟包埋、切片5.0～7.0 μm，鐵明礬蘇木精染色，樹脂封片，Olympus BX-51RT光學(xué)顯微鏡觀察并照相。

1.4蘇丹黑B染色

參照文獻(xiàn)[6]。石蠟切片方法同上，脫蠟復(fù)水后，于50～60℃的70%酒精溶解的蘇丹黑B試劑中染色30～60 min，用70%的乙醇洗去浮色，超純水漂洗。Olympus BX-51RT光學(xué)顯微鏡觀察并照相。

2　結(jié)果與分析

2.1花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)

油菜花粉發(fā)育大致經(jīng)過孢原細(xì)胞分化、造孢細(xì)胞增殖為花粉母細(xì)胞、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂、小孢子有絲分裂、花粉粒成熟等階段。在孢原細(xì)胞分化階段，造孢細(xì)胞性狀不規(guī)則，細(xì)胞核大而圓，造孢細(xì)胞外圍依次為絨氈層、中間層、藥室內(nèi)壁、表皮(圖1，A)。造孢細(xì)胞增殖為花粉母細(xì)胞，此時(shí)絨氈層細(xì)胞絨氈層體積增大，大部分絨氈層細(xì)胞出現(xiàn)雙核轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谛徒q氈層細(xì)胞，中間層變?yōu)閹罱Y(jié)構(gòu)(圖1，B)。進(jìn)入減數(shù)分裂階段后花粉母細(xì)胞變?yōu)闄E圓形，絨氈層細(xì)胞壁開始降解，細(xì)胞之間開始出現(xiàn)間隙，中間層消失(圖1，C、D)。減數(shù)分裂后形成四分體，呈四面體形，相鄰絨氈層細(xì)胞之間間隙繼續(xù)增大(圖1，E)。單核小孢子逐漸從四分體中釋放出來，單核早期小孢子細(xì)胞壁很薄，細(xì)胞質(zhì)濃厚且染色較深(圖1，F(xiàn))。小孢子形成大液泡，細(xì)胞核被擠到細(xì)胞邊緣，進(jìn)入單核靠邊期，中間層細(xì)胞消失，此時(shí)小部分絨氈層細(xì)胞仍能看見雙核，絨氈層細(xì)胞壁持續(xù)降解，藥室內(nèi)壁逐漸變薄(圖1，G)。單核小孢子進(jìn)行一次不對(duì)稱有絲分裂，形成二核花粉粒，二核花粉粒進(jìn)行第二次有絲分裂形成三核花粉粒，這期間絨氈層細(xì)胞大量解體，隨著花粉粒的進(jìn)一步發(fā)育成熟，藥室內(nèi)壁完全消失(圖1，H、I)。

圖1　對(duì)照油菜可育株花藥發(fā)育的顯微觀察(×400)Fig.1　Microscopic observation of anther development of fertile plants注：A.造孢細(xì)胞時(shí)期；B.花粉母細(xì)胞時(shí)期；C、D.減數(shù)分裂期；E.四分體時(shí)期；F、G.單核期；H.雙核期；I.三核期。

經(jīng)過SX-1噴施后的滬油15花藥能分化出花粉囊，數(shù)目4個(gè)，呈蝶狀，和未噴旋SX-1的對(duì)照滬油15花藥的分化一致。在造孢細(xì)胞時(shí)期，花粉囊由內(nèi)到外依次為造孢細(xì)胞、絨氈層、藥室內(nèi)壁、表皮細(xì)胞，表明藥室細(xì)胞層類型的分化是正常的，但是細(xì)胞的發(fā)育出現(xiàn)異常：造孢細(xì)胞出現(xiàn)液泡化，絨氈層細(xì)胞異常加厚或是明顯解體(圖2，A、B)?；ǚ勰讣?xì)胞時(shí)期，絨氈層細(xì)胞提前降解(圖2，C)。花粉發(fā)育到四分體時(shí)期，四分體發(fā)育異常，形狀怪異，其中小孢子個(gè)數(shù)2到4個(gè)不等且形狀異常，絨氈層細(xì)胞降解嚴(yán)重或是伴有液泡化現(xiàn)象(圖2，D、E)。單核小孢子時(shí)期，花藥中的絨氈層凝結(jié)延遲降解，仍可見中間層(圖2，F(xiàn))。最后在大花蕾花藥中，單核小孢子內(nèi)含物降解、空泡化，僅有極少數(shù)的小孢子繼續(xù)發(fā)育到二核小孢子，花粉內(nèi)物質(zhì)完全降解，最后花粉囊中只剩下花粉空殼(圖2，F(xiàn)、G、I)。

圖2　SX-1誘導(dǎo)的油菜雄性不育株花藥顯微觀察(×400)Fig.2　Microscopic observation of anther development of male sterile plants induced by SX-1注：A、B.造孢細(xì)胞時(shí)期；C.花粉母細(xì)胞時(shí)期；D、E.四分體期；F、G.單核期；H.二核期；I.敗育花藥(×200)。

絨氈層細(xì)胞的異常表現(xiàn)可以概括為兩類：小孢子發(fā)生期(花粉母細(xì)胞時(shí)期、減數(shù)分裂期、四分體時(shí)期)絨氈細(xì)胞提前解體，雄配子形成期(單核小孢子發(fā)育為成熟花粉粒期間)絨氈細(xì)胞延遲降解。

2.2花藥脂染色結(jié)果

用脂類物質(zhì)特異染料蘇丹黑B對(duì)可育花藥進(jìn)行染色處理，觀察油脂代謝在花藥細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)變化。造孢細(xì)胞增殖為花粉母細(xì)胞的過程中，整個(gè)花藥沒有染色信號(hào)(圖3，B、C)?；ǚ勰讣?xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂期，絨氈層細(xì)胞可見明顯的著色信號(hào)，此時(shí)花粉母細(xì)胞有微弱的著色信號(hào)(圖3，D)。從四分體中釋放出來的早期單核小孢子著色信號(hào)微弱，絨氈層細(xì)胞著色信號(hào)增強(qiáng)(圖3，E)。隨著花粉外壁進(jìn)一步形成，單核小孢子著色信號(hào)逐漸增強(qiáng)，絨氈層細(xì)胞的著色信號(hào)逐漸減弱(圖3，F(xiàn)、G)。小孢子繼續(xù)發(fā)育，絨氈層細(xì)胞大量解體著色信號(hào)逐漸消失，脂類物質(zhì)不斷聚集到小孢子外壁上，小孢子發(fā)育為成熟的花粉粒，最終花粉粒著色為深黑色(圖3，H、I)。結(jié)果表明：花藥造孢細(xì)胞時(shí)期，絨氈層細(xì)胞處于分化發(fā)育階段，沒有進(jìn)行油脂合成代謝；花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期絨氈層細(xì)胞開始合成并積累脂類物質(zhì)，并隨著花藥發(fā)育逐漸增強(qiáng)，同時(shí)絨氈層細(xì)胞將集聚的脂質(zhì)分泌到腔室供給小孢子發(fā)育；到單核后期，絨氈層細(xì)胞基本完成脂質(zhì)的分泌，解體的絨氈層細(xì)胞碎片為花粉發(fā)育成熟提供其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

圖3　對(duì)照油菜可育株花藥脂染色觀察(×400)Fig.3　Sudan Black B staining analysis of anthers from fertile plants注：A.陰性對(duì)照，未用蘇丹黑B處理；B.造孢細(xì)胞時(shí)期；C.花粉母細(xì)胞時(shí)期；D.減數(shù)分裂期；E、F、G.單核期；H.二核期；I.三核期。

根據(jù)SX-1誘導(dǎo)滬油15敗育花藥細(xì)胞學(xué)特征，可知絨氈層的發(fā)育異常主要表現(xiàn)為在小孢子發(fā)生期提前降解，雄配子形成期延遲降解。因此SX-1誘導(dǎo)的不育花藥脂染色結(jié)果，可以分為兩類討論。四分體期到小孢子從四分體中釋放出來，提前解體的絨氈層細(xì)胞中著色信號(hào)微弱且不均勻(圖4，B、C)。雄配子形成期延遲降解的絨氈層直到最終解體，絨氈層的著色信號(hào)一直處于微弱狀態(tài)，小孢子的著色信號(hào)雖然不斷增強(qiáng)，但是脂質(zhì)未得到充足供應(yīng)不能發(fā)育成成熟的花粉粒，敗育花粉粒外壁物質(zhì)潰散，著色信號(hào)變?nèi)?圖4，D～I(xiàn))。提前解體的絨氈層中檢測(cè)到脂染色信號(hào)，說明在四分體期間絨氈層有油脂積累。延遲降解的絨氈層中著色信號(hào)微弱，說明絨氈層的脂質(zhì)合成受阻，而后絨氈層解體小孢子的著色信號(hào)并沒有增強(qiáng)，說明絨氈層對(duì)花粉外壁脂質(zhì)的提供大部分是取決于解體前的合成與積累。

圖4　SX-1誘導(dǎo)油菜雄性不育株花藥脂染色觀察(×400)Fig.4　Sudan Black B staining analysis of anthers from male sterile plants induced by SX-1注：A.陰性對(duì)照，未用蘇丹黑B處理；B～I(xiàn).與可育花藥各個(gè)時(shí)期花蕾大小相對(duì)應(yīng)的花藥切片，其中B.四分體期；C～F.單核期。

3　小結(jié)與討論

化學(xué)雜交劑誘導(dǎo)的敗育花藥細(xì)胞學(xué)特征復(fù)雜。官春云等[7]用殺雄劑1號(hào)處理不同時(shí)期油菜，觀察到不育花藥中絨氈層細(xì)胞發(fā)育異常，根據(jù)殺雄劑1號(hào)浸種或在造孢細(xì)胞形成及以前任何時(shí)期進(jìn)行處理不能誘導(dǎo)雄性不育，認(rèn)為殺雄劑1號(hào)誘導(dǎo)油菜雄性不育主要是作用于花藥，花藥中特異表達(dá)的基因表達(dá)受到影響使得絨氈層發(fā)育異常進(jìn)而導(dǎo)致花粉敗育。成宇峰[8]將單嘧磺酯鈉誘導(dǎo)的油菜敗育類型分成兩類，一類是絨氈層細(xì)胞在單核早期已經(jīng)全部解體，小孢子發(fā)育到成熟期時(shí)內(nèi)含物收縮或全部降解，小孢子敗育；另一類是小孢子從花粉母細(xì)胞時(shí)期就出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核收縮降解現(xiàn)象，隨著小孢子的進(jìn)一步發(fā)育，小孢子發(fā)育畸形內(nèi)含物不斷降解，二核、三核期時(shí)小孢子細(xì)胞降解，絨氈層細(xì)胞發(fā)育異常或是延遲解體。唐志康[9]、井苗[10]、于橙宇[11]、崔建民[12]等用不同化學(xué)雜交劑誘導(dǎo)不同品種油菜的研究結(jié)果表明，化學(xué)雜交劑對(duì)油菜花藥發(fā)育不同時(shí)期的小孢子、絨氈層細(xì)胞造成影響，并認(rèn)為雜交劑對(duì)性細(xì)胞有直接殺傷作用。由于絨氈層位于花藥四層體細(xì)胞的最內(nèi)層，與花粉母細(xì)胞直接相連，在小孢子發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，如分泌胼胝質(zhì)酶使小孢子從四分體中釋放出來、為花粉壁的形成提供脂質(zhì)、為花粉成熟提供營(yíng)養(yǎng)[13～15]，因此，絨氈層發(fā)育異常被認(rèn)為是化學(xué)雜交劑誘導(dǎo)油菜雄性不育的原因[7，9，10]。

對(duì)SX-1誘導(dǎo)滬油15花粉敗育的細(xì)胞學(xué)觀察表明，SX-1對(duì)油菜花藥發(fā)育各個(gè)時(shí)期都有一定影響，絨氈層細(xì)胞的異常表現(xiàn)可以概括為兩類：小孢子發(fā)生期(花粉母細(xì)胞時(shí)期、減數(shù)分裂期、四分體時(shí)期)絨氈細(xì)胞提前解體，雄配子形成期(單核小孢子發(fā)育為成熟花粉粒期間)絨氈細(xì)胞延遲降解。花藥脂染色結(jié)果表明，SX-1影響了絨氈層細(xì)胞的油脂代謝，不能為單核小孢子的花粉外壁形成提供充足的脂類物質(zhì)，是單核小孢子不能發(fā)育為成熟花粉粒的原因之一。與Li等[16]根據(jù)不同發(fā)育時(shí)期花藥與葉片的基因表達(dá)的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)認(rèn)為花藥細(xì)胞中碳水化合物和脂質(zhì)代謝受到影響可能是低濃度單嘧磺酯鈉誘導(dǎo)油菜雄性不育的原因的結(jié)論具有一致性。

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Cytological Observation of Anther Development on Male Sterility in Brassica napus L.Induced by Chemical Hybridization SX-1

LUO Haiyan，GUAN Chunyun

(Oil Crops Research Institute，HNAU，Changsha，Hunan 410128，China)

Cytological observation of anther development on male sterility inBrassicanapusL.induced by chemical hybridization SX-1 was conducted after parafin sections and Sudan Black B staining.The effects were divided into two categories，one is the pollen aborted in sporogenous stage to tetrad stage while tapetal cells thickened abnormally，or disintegrated earlier，or became vacuolization；one is the tapetum cell delayed disintegration and the uninucleate microspore could not develop into mature pollen.The result of Sudan Black B staining suggested that SX-1 have influenced lipid accumulation in the tapetal cell，lipid metabolism in tapetal cell was inhibited，causing tapetum could not provide sufficient material for the formation of pollen wall，that is part of reason uninucleate microspore could not further developed into mature pollen.

rape；male sterility；cytology；tapetum；chemical hybridization agents

2016-03-08

羅海燕(1990-)，女，碩士研究生，Email：342269254@qq.com。*通信作者：官春云，教授，中國(guó)工程院院士，Email：guancy2011@aliyun.com。

國(guó)家科技部項(xiàng)目(2011AA10A104_6)。

S565.401；Q842.1

A

1001-5280(2016)04-0397-05

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2016.04.11