石志剛 萬如 李彥龍 王亞軍 馬婷慧

摘要：對寧夏枸杞主要品種psbA-trntH的DNA條形碼序列進行分析，從分子水平對枸杞做出鑒定。采用改進CTAB法提取枸杞葉片DNA，利用合成的特異引物對其葉綠體間隔序列進行擴增、克隆，對目的片段測序分析，克隆到枸杞主要品種psbA-trntH片段，并獲得其堿基序列（總長為545 bp）。

關(guān)鍵詞：枸杞屬；psbA-trntH；DNA測序；鑒定

中圖分類號：R282.5 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2016）06-0001-03

寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）是我國名貴的道地藥材，具有抗氧化、抗腫瘤、軟化血管、降脂、降糖、生精、保肝、明目、增強人體免疫力等療效[1-4]。寧夏自20世紀60年代起開展枸杞新品種育種工作，目前寧夏農(nóng)林科學院自主選育出寧杞1號、寧杞2號、寧杞3號、寧杞5號、寧杞6號、寧杞7號、寧農(nóng)杞9號等10余個新品種，國內(nèi)科技工作者也選育出柴杞1號、蒙杞1號、精杞1號等新品種。由于各品種之間常有相同的基原或為近緣，使得它們在外在形態(tài)、習性、組織構(gòu)造以及所含的化學成分方面具有高度的相似性，傳統(tǒng)的鑒定方法已難以準確鑒別。以DNA條形碼為工具對物種進行快速、準確的識別和鑒定已用于系統(tǒng)學研究和品種的鑒定。近些年來，國內(nèi)外許多學者都對植物中適合作為DNA條形碼的基因序列進行了積極的探索與研究。psbA-trntH基因片段作為植物DNA條形碼最大的優(yōu)勢是進化速率快，累積較多變異，從而能更好地鑒別親緣關(guān)系很近的物種[5-8]。目前，利用psbA-trntH基因序列測定鑒定寧夏枸杞品種的研究還未見報道，因此，本課題以寧夏枸杞主要品種為試材，對枸杞psbA-trntH基因片段序列進行分析研究，以期為從分子水平鑒定枸杞品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為收集保存在寧夏農(nóng)林科學院枸杞中心枸杞種質(zhì)資源圃內(nèi)的枸杞主要品種（見表1）。

1.2 試驗儀器

PCR儀：Bio-Rad公司；DYY-12型電泳儀：北京六一儀器廠；DYCp231型電泳槽：北京六一儀器廠； UV-2550紫外可見分光光度儀；TOMOS3-18R Refrigerated Centrifuge；Alpha lnnotech凝膠成像儀；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒：Tiangen公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組總DNA的提取 參照文獻[9]的方法進行。

1.3.2 引物設(shè)計 依據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的茄科植物nrDNA ITS序列，采用測序引物設(shè)計的軟件Premier 5.0設(shè)計引物。AHf：5，-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3；AHr：5，-CGCGCATGGTG

GATTCACAATCC-3。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3.3 目的基因的克隆及測序 以上述引物對7個供試材料的基因組DNA基因PCR擴增，反應體系15.0 μL：7.5 μL 2×Mix混合液，上下游引物各0.5 μL，2.0 μL模板DNA，4.5 μL ddH2O。PCR反應程序為：1） 94 ℃預變性3 min；2） 94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，36次循環(huán)；3） 72 ℃保溫10 min；4） 4 ℃保存。PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA膠回收試劑盒對約550 bp的目標條帶進行回收。將回收產(chǎn)物與Lethal Based Fast Cloning Kit連接，T4 DNAlrgse，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，采用藍白斑法篩選陽性菌落。對陽性菌落進行PCR檢測后，送往生工生物工程公司（上海）完成。

1.3.4 序列分析 序列分析在NCBI網(wǎng)站及使用DNAMAN，DNAstar軟件進行。

2 結(jié)果與分析

利用DNAMAN軟件將試驗測得的寧夏枸杞主要品種psbA-trntH序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的psbA-trntH進行同源性比較，并對所測得的序列進行對位排列，結(jié)果如圖1所示。

8個供試材料整個ITS序列長度變異范圍為545 bp，僅有寧杞3-2號有變異，變異位點9個，變異率1.7%，寧杞1，2，3-1，4，5，6，7號這7個沒有差異。

3 結(jié)論與討論

雖然DNA分子標記技術(shù)應用于枸杞屬植物鑒定等方面已有一些報道[10-11]，但目前植物性中藥材的基因組序列絕大多數(shù)沒有測定，尤其是枸杞序列國內(nèi)未見報道。本課題利用psbA-trntH基因片段的保守區(qū)序列，自行設(shè)計引物擴增出整個psbA-trntH基因片段，并完成了擴增產(chǎn)物的DNA堿基序列的測定，得到7個枸杞主要品種psbA-trntH基因片段的完整序列，經(jīng)過分析能夠鑒定出供試材料之間的差異，但是否可利用psbA-trntH基因片段序列在分子生物學水平對枸杞品種進行鑒定有待進一步篩選和研究。

參考文獻

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