姜露，葉麟，楊雪，黎杉珊，申光輝，張志清

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安， 625014)

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不同前處理對(duì)植物酯酶抑制法檢測(cè)蔬菜中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的影響

姜露，葉麟，楊雪，黎杉珊，申光輝，張志清*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安， 625014)

利用酶抑制法可以快速檢測(cè)蔬菜中的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留，這兩類農(nóng)藥能抑制酯酶的活性，并影響酯酶對(duì)底物的催化能力。根據(jù)這一原理，采用麥麩酯酶作為酶源對(duì)酶抑制法快速檢測(cè)農(nóng)殘前處理方法中農(nóng)殘?zhí)崛∫?、提取方法、提取時(shí)間及樣品提取液的處理方式進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：用5%丙酮-磷酸鹽緩沖液作為提取液，然后超聲提取5min后，將樣品提取液再用0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后蔬菜中農(nóng)藥殘留提取量可達(dá)到最高；且樣品加標(biāo)回收率為83.61%～102.81%，變異系數(shù)為1.20% ～7.23%。因此，該前處理方法可滿足于麥麩酯酶抑制法快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的需要。

麥麩酯酶；酶抑制法；有機(jī)磷農(nóng)藥；氨基甲酸酯類農(nóng)藥；蔬菜；前處理方法

農(nóng)藥是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，它的使用能有效保障或提高農(nóng)作物的收成。但是農(nóng)產(chǎn)品種植中，因缺乏科學(xué)使用農(nóng)藥的知識(shí)及片面追求高產(chǎn)量，隨意并超量使用違禁農(nóng)藥，進(jìn)而導(dǎo)致食品中的農(nóng)殘超標(biāo)問(wèn)題比較突出[1]。攝取的殘留農(nóng)藥經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期累積會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重?fù)p害，可能誘發(fā)基因突變，致使癌變、畸形的比例和可能性大大提高[2]。因此，加強(qiáng)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)力度，杜絕農(nóng)殘嚴(yán)重超標(biāo)的食品流入市場(chǎng)變得尤為重要。

酶抑制法是快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留研究較多且較為成熟的一種方法，該法與傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)法相比具有檢測(cè)成本低、耗時(shí)短、設(shè)備和試劑簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。我國(guó)已經(jīng)將其列入國(guó)標(biāo)，可對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中的有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測(cè)[3]。檢測(cè)用酶主要有來(lái)自動(dòng)物及昆蟲的膽堿酯酶和從植物中提取的植物酯酶[4-6]。其中，植物酯酶屬于羧酸酯水解酶類，廣泛存在于小麥、玉米、大豆等谷物中，與膽堿酯酶相比具有原料易得、成本很低、保存期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。在農(nóng)藥殘留檢測(cè)過(guò)程中，無(wú)論是傳統(tǒng)儀器檢測(cè)法還是快速檢測(cè)都需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理。農(nóng)藥殘留分析前處理是農(nóng)殘分析檢測(cè)的關(guān)鍵步驟，它直接關(guān)系著整個(gè)分析過(guò)程的準(zhǔn)確性與精密度[9]。有統(tǒng)計(jì)表明，大部分傳統(tǒng)農(nóng)藥殘留檢測(cè)過(guò)程中，需要通過(guò)有機(jī)溶劑提取、濃縮、凈化等前處理步驟，約占整個(gè)分析時(shí)間的70%左右[10]，在此操作過(guò)程中產(chǎn)生的誤差也占整個(gè)分析誤差的絕大多數(shù)且無(wú)法對(duì)廉價(jià)的蔬菜進(jìn)行隨時(shí)隨地的快速檢測(cè)。

目前，對(duì)酶抑制法快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的研究主要是以酶源的篩選及分離純化為主[12-13]，很少有對(duì)其前處理方法進(jìn)行報(bào)道，且研究表明國(guó)標(biāo)中的直接浸提法對(duì)農(nóng)殘的提取率并不高[14]。因此，本研究根據(jù)酶抑制法快速檢測(cè)有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的原理，采用麥麩中提取的植物酯酶作為檢測(cè)酶源，對(duì)快速檢測(cè)方法中前處理過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)對(duì)幾種有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行樣品回收率實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證麥麩酯酶快速檢測(cè)蔬菜中農(nóng)藥殘留的可行性。

1　材料與方法

1.1材料

麥麩酯酶，實(shí)驗(yàn)室自制；卷心菜(Brassica oleraceavar.capitata)、小白菜(Brassica rapaL.ChinensisGroup)，雅安市市售。

1.2試劑與儀器

1.2.1試劑

有機(jī)磷類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：敵敵畏(液體1.00mg/mL)、甲基對(duì)硫磷(液體1.00mg/mL)、樂(lè)果(液體1.00mg/mL)，成都杰銳科技有限公司；氨基甲酸酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：丁硫克百威(液體1.00mg/mL)、西維因(固體純度≥99.8%)、葉蟬散(固體純度≥99.8%),成都杰銳科技有限公司；α-乙酸萘酯，上海源葉生物科技有限公司；固蘭B鹽，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；HCl，四川西隴化工有限公司；α-萘酚、十二烷基硫酸鈉(SDS)、Na2HPO4·7H2O、NaH2PO4·2H2O、無(wú)水乙醇，成都市科龍化工試劑廠，所用試劑均為分析純。

1.2.2儀器

CP225D型電子天平，德國(guó)Sartorius股份公司；HS6150D型超聲波清洗儀，恒奧科技有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；UV-3100型紫外分光光度儀計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；TS-I平衡脫色搖床，上海亞榮生化儀器廠；Milli-Q型超純水純化系統(tǒng)，美國(guó)密理博公司。

1.3研究方法

1.3.1麥麩酯酶的制備

從麥麩中提取麥麩酯酶參考楊雪等[15]的方法，并將其稀釋5倍待用。

1.3.2蔬菜的預(yù)處理

取卷心菜及小白菜的可食部分，用自來(lái)水、蒸餾水分別洗滌3次，放在干燥處并用濾紙片擦干備用。

1.3.3蔬菜樣品中農(nóng)藥殘留的提取方法

用濃度為0.5mg/L的西維因農(nóng)藥噴灑于1g卷心菜上，4 ℃下放置12h。將菜葉剪成1cm2的碎片，放入提取液使其淹沒(méi)菜葉提取一定時(shí)間后，定容到10mL，然后取上清液作為樣品提取液待用。

1.3.4樣品提取液對(duì)酶活抑制率的測(cè)定方法

酶活抑制率的測(cè)定參考楊雪等[15]的方法，并稍作修改，于試管中加入4.25mL的樣品提取液，再加入0.25mL麥麩酯酶，混勻后在35℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30min。取出試管加入0.25mL濃度為(8×10-4)mol/L的α-乙酸萘酯溶液，40 ℃恒溫水浴5min后加入0.25mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.2%SDS，再加入0.25mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.03%固蘭B鹽搖勻，最后加入0.25mL體積分?jǐn)?shù)20%HCl溶液搖勻后讀取吸光度值A(chǔ)1，作為實(shí)驗(yàn)組。用提取液替代樣品提取液做為對(duì)照組A0，以未加α-乙酸萘酯溶液組做空白對(duì)照，其他操作與樣品提取液測(cè)定方法相同，通過(guò)測(cè)得的吸光度值計(jì)算酶活抑制率。

酶活抑制率公式：

式中：A0，對(duì)照組的吸光度值；A1，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值。

1.3.5農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線

6種農(nóng)藥先用丙酮分別配制成10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后用磷酸鹽緩沖液(pH7.2，0.2mol/L)將敵敵畏、葉蟬散稀釋成0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00mg/L系列濃度；西維因稀釋成0.05、0.10、0.25、0.50、1.00mg/L系列濃度；樂(lè)果、甲基對(duì)硫磷稀釋成1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00mg/L系列濃度；丁硫克百威稀釋成0.10、0.16、0.25、0.50、0.72、1.00mg/L系列濃度，然后按照1.3.4方法將樣品提取液替換成不同濃度的農(nóng)藥進(jìn)行測(cè)定。并計(jì)算不同濃度農(nóng)藥對(duì)麥麩酯酶酶活的抑制率，然后以農(nóng)藥濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6蔬菜中農(nóng)藥殘留提取液的選擇

分別配制不同體積分?jǐn)?shù)的丙酮磷酸鹽緩沖液(0%、5%、10%、20%)，按照1.3.3的實(shí)驗(yàn)方法將不同濃度的丙酮磷酸鹽緩沖液替代樣品提取液測(cè)定麥麩酯酶酶活吸光度值，考察不同濃度的丙酮對(duì)酯酶酶活的影響，從而確定丙酮的最佳濃度。并將該濃度下的丙酮緩沖液、pH7.2的磷酸鹽緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaCl作為蔬菜中農(nóng)殘的提取液，從中選擇最適宜的提取液。

1.3.7不同提取方法及提取時(shí)間的確定

實(shí)驗(yàn)采用振蕩法和超聲波法對(duì)蔬菜中的農(nóng)藥殘留分別進(jìn)行提取，振蕩法提取時(shí)提取時(shí)間為5、10、15、20、25、30min，而超聲波法提取時(shí)間分別為1、3、5、7、9、12min,將上清液靜置5～10min后取上清液按照1.3.4的方法測(cè)定，考察不同提取方法及不同提取時(shí)間對(duì)農(nóng)藥回收率的影響。

1.3.8樣品提取液不同處理方法的比較

樣品提取液在測(cè)定前的不同處理方式也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，本實(shí)驗(yàn)以卷心菜和小白菜為例，在最佳的提取方法基礎(chǔ)上分別對(duì)這2種蔬菜的樣品提取液進(jìn)行直接測(cè)定、活性炭吸附后過(guò)濾、0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾3種不同的處理方法，取上清液按照1.3.4的方法測(cè)定，考察不同處理方法對(duì)農(nóng)藥回收率的影響。

1.3.9農(nóng)藥加標(biāo)回收率的測(cè)定

將各農(nóng)藥配制成濃度為10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后分別取0.25、0.5、1.0mL的敵敵畏、葉蟬散、西維因、丁硫克百威標(biāo)準(zhǔn)工作液和1.0、1.5、2.0mL的樂(lè)果、甲基對(duì)硫磷的標(biāo)準(zhǔn)工作液噴灑于1g卷心菜葉上，放置過(guò)夜，按照上述確定的最佳提取方法提取并測(cè)定酶活抑制率作為實(shí)驗(yàn)組。并將同一批次購(gòu)買未噴灑農(nóng)藥的卷心菜同樣加入提取液進(jìn)行提取，測(cè)定酶活抑制率作為空白值，然后根據(jù)農(nóng)藥濃度與抑制率的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算加標(biāo)回收率。

2　結(jié)果與分析

2.1農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由表1可知，6種農(nóng)藥在系列濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其相關(guān)性均在0.98以上。

表1　農(nóng)藥濃度與麥麩酯酶抑制關(guān)系

注：y:抑制率，%；x: 農(nóng)藥濃度對(duì)數(shù)(lgc)(c為農(nóng)藥質(zhì)量濃度，mg/L)。

2.1應(yīng)用于酯酶抑制法檢測(cè)農(nóng)殘的蔬菜中農(nóng)殘?zhí)崛∫旱拇_定

2.1.1丙酮含量對(duì)麥麩酯酶酶活性的影響

用pH7.2的磷酸鹽緩沖液將丙酮稀釋成不同體積濃度，然后測(cè)定丙酮對(duì)麥麩酯酶酶活的影響，并用吸光度值來(lái)表示，吸光度值越高說(shuō)明麥麩酯酶酶活性越大。由圖1可知，當(dāng)磷酸鹽緩沖溶液中丙酮含量為5%時(shí)，麥麩酯酶酶活性變化不大，差異不顯著(P>0.05)。但是隨著丙酮含量的增加，麥麩酯酶酶活迅速減小(P<0.05)，說(shuō)明當(dāng)丙酮含量過(guò)高時(shí)會(huì)抑制麥麩酯酶的活性,原因可能是一方面極性有機(jī)溶劑如丙酮可溶解大量的水并剝?nèi)ッ副３只钚缘谋匦杷?，從而使酶失去活性；另一方面可能是由于丙酮可通過(guò)破壞酶蛋白活性構(gòu)型的氫鍵、疏水作用等而使酶變性失活。因此，在提取蔬菜中的農(nóng)藥殘留時(shí)提取液中丙酮的體積分?jǐn)?shù)不得超過(guò)5%。

圖1　不同含量丙酮對(duì)麥麩酯酶酶活吸光度值的影響Fig.1　Effect of different concentrations on the activity of wheat bran esterase

2.1.2蔬菜中農(nóng)藥殘留提取液的確定

經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)篩選出的磷酸鹽緩沖液和體積分?jǐn)?shù)5%的丙酮磷酸鹽緩沖液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaCl鹽溶液作為蔬菜中農(nóng)藥殘留的提取液，從而選出最佳的農(nóng)殘?zhí)崛∫?。由圖2可知，含有5%丙酮的磷酸鹽緩沖液提取后的樣品提取液農(nóng)藥殘留回收率最大，而使用5%NaCl溶液和磷酸鹽緩沖液提取后的樣品提取液回收率差異不顯著( P>0.05),而且這2種樣品提取液的回收率均顯著(P<0.05)低于含有丙酮的緩沖液。原因可能是由于農(nóng)藥多屬于有機(jī)化合物，不易溶于水，而溶于丙酮、石油醚等有機(jī)溶劑。所以用含有丙酮的緩沖液提取樣品中的農(nóng)藥效果比磷酸鹽緩沖液和氯化鈉鹽溶液要好。因此，選擇5%的丙酮磷酸鹽緩沖液作為蔬菜中農(nóng)藥殘留提取液。

圖2　不同提取液對(duì)回收率的影響Fig.2　Effect of different extracting solution on the recovery of pesticide

2.2樣品提取時(shí)間的選擇

2.2.1振蕩法提取時(shí)間的確定

提取方法是指用溶劑將待測(cè)樣品中農(nóng)藥溶解、分離出來(lái)的操作步驟。利用上述實(shí)驗(yàn)確定的提取液采用振蕩的方法進(jìn)行提取，比較不同的提取時(shí)間回收率的影響。由圖3可知，振蕩時(shí)間在5～25min時(shí)回收率逐漸升高，當(dāng)提取時(shí)間大于25min后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)回收率基本趨于平穩(wěn)，差異不顯著(P>0.05)。說(shuō)明振蕩時(shí)間太短時(shí)，蔬菜上的農(nóng)藥不能完全被提取出來(lái)。所以，采用振蕩法提取農(nóng)藥時(shí)將25min作為最佳的提取時(shí)間。

圖3　振蕩提取時(shí)間對(duì)回收率的影響Fig.3　Influence of oscillation extraction time on the recovery

2.2.2超聲波法提取時(shí)間的確定

采用了超聲波法提取蔬菜中的農(nóng)藥殘留，并對(duì)2種提取方法進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果如圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間在1～5min時(shí)回收率迅速升高(P<0.05)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)回收率呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的延長(zhǎng)蔬菜中的農(nóng)藥被完全提出，但是提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使提取液溫度升高、細(xì)胞破碎導(dǎo)致提取液里有效充分發(fā)生變化，色素類物質(zhì)開始溶出，影響檢測(cè)結(jié)果。所以，采用超聲波法提取農(nóng)藥殘留時(shí)最佳的提取時(shí)間是5min。

圖4　超聲波提取時(shí)間對(duì)回收率的影響Fig.4　Influence of ultrasonic extraction time on the recovery

由圖3和圖4可以看出，2種提取方法的酶活抑制率都隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)增加。但超聲波法在最佳提取時(shí)間下的農(nóng)殘回收率顯著(P<0.05)高于振蕩法，說(shuō)明超聲波法要優(yōu)于振蕩法，這是由于振蕩提取只能提取出菜葉表面的農(nóng)藥殘留，而不能將葉片內(nèi)部殘留的農(nóng)藥提取出來(lái)。而且超聲所用的提取時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于振蕩提取法，所以選擇超聲波法提取蔬菜中的農(nóng)藥殘留，最佳提取時(shí)間為5min。

2.3樣品提取液處理方式的確定

將超聲波提取5min后的卷心菜和小白菜樣品提取液分別進(jìn)行直接測(cè)定、活性炭吸附后過(guò)濾、 0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾3種不同的處理方法進(jìn)行處理。結(jié)果由表2可知，從卷心菜中提取的樣品提取液經(jīng)直接測(cè)定和0.45μm濾膜過(guò)濾后回收率差異顯著(P>0.05)，但是均顯著大于活性炭吸附后的回收率。說(shuō)明從卷心菜上提取的樣品提取液過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜與直接測(cè)定對(duì)測(cè)定結(jié)果沒(méi)有影響。這主要是因?yàn)榫硇牟祟伾珳\，質(zhì)地較硬，樣品提取液無(wú)色透明不渾濁，所以在檢測(cè)時(shí)對(duì)透光率影響小。而從小白菜中提取的樣品提取液經(jīng)過(guò)3種處理方式后測(cè)定的結(jié)果差異均顯著(P<0.05)，其中過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜后的回收率明顯要高于其他兩種處理方式。這可能是因?yàn)樾“撞祟伾珵榇渚G色，質(zhì)地軟，細(xì)胞破碎程度大，因此經(jīng)超聲波提取的樣品提取液顏色深且渾濁，而有機(jī)濾膜可過(guò)濾掉大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、附著有色素的粗纖維等，不影響小分子的物質(zhì)(農(nóng)藥)通過(guò)，提取液變澄清透明。無(wú)論在卷心菜還是小白菜中利用活性炭吸附后的回收率均低于濾膜過(guò)濾的，原因一方面可能是活性炭在吸附雜質(zhì)時(shí)也吸附了部分農(nóng)藥，另一方面是由于其吸附效果不如濾膜，因此測(cè)得的結(jié)果偏低。所以，在檢測(cè)顏色較淺的蔬菜時(shí)對(duì)樣品提取液可直接測(cè)定，而那些顏色較深的蔬菜樣提取液需采用0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾掉樣品提取液中的雜質(zhì)。

表2　樣品提取液處理方式對(duì)農(nóng)藥回收率的影響　%

2.4樣品回收率實(shí)驗(yàn)

加標(biāo)回收率是衡量農(nóng)藥殘留量分析方法準(zhǔn)確度和可靠性的指標(biāo)。為了驗(yàn)證麥麩酯酶檢測(cè)蔬菜中6種農(nóng)藥殘留方法的可行性，將每種農(nóng)藥由小到大配制成3種不同的濃度進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明該單標(biāo)樣品回收率在83.61%～102.81%之間，回收率測(cè)定值的變異系數(shù)小于7.23%(表3)。說(shuō)明按照上述試驗(yàn)方法處理后測(cè)得的回收率均比較高，即該方法檢測(cè)蔬菜殘留的農(nóng)藥效果較好。

表3　卷心菜中6種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率

3　結(jié)論

本研究依據(jù)酶抑制法快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法以麥麩酯酶為檢測(cè)用酶，在農(nóng)殘檢測(cè)的最佳條件下通過(guò)對(duì)麥麩酯酶酶活抑制率的測(cè)定，對(duì)蔬菜中的農(nóng)藥殘留提取的前處理進(jìn)行優(yōu)化，得到了一組最優(yōu)前處理方法。即用體積分?jǐn)?shù)5%丙酮磷酸鹽緩沖液作為提取液，然后超聲波法提取5min后，將樣品提取液再用0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾。并用該方法檢測(cè)蔬菜中農(nóng)藥殘留的加標(biāo)回收率和變異系數(shù)，按照本方法處理后測(cè)得的回收率比較高且變異系數(shù)均在10%以內(nèi)，也進(jìn)一步證明了該方法的準(zhǔn)確性。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)前處理方法的優(yōu)化，即可以節(jié)省前處理用時(shí)，又不失檢測(cè)的精確性與穩(wěn)定性。

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Effectofdifferentpre-treatmentmethodsondetectionresultsoforganophosphateandcarbamatepesticideresiduesinvegetablesbyplantesteraseinhibitionmethod

JIANGLu,YELin,YANGXue,LIShan-shan,SHENGGuang-hui,ZHANGZhi-qing*

(CollegeofFoodScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014，China)

Theactivityofesterasecanbeinhibitedbyorganophosphateandcarbamatepesticideresidues.Theabilityoftheesterasetocatalyzethesubstratecanalsobereduced.Usingthisprinciple,theoptimizationsofpesticideresidueextractionsolution,extractingmethods,extractiontimeandthetreatmentofsamplesolutionwereseparatelydonebyusingwheatbranenzymeinhibitionmethod.Theresultsshowedthattheoptimalwaytoextractpesticidesresiduesinvegetableswas5%acetone/PBSextracting5minbyultrasonic,thenfilteredwith0.45μmorganicfilm.Withtheabovepre-treatmentmethods,theresponseraterangedfrom83.61%to102.81%,withcoefficientofvariationattherangedfrom1.2%to7.23%.Therefore,thispre-treatmentcanmeettheneedofrapiddetectionofpesticideresidues.

plantesterase;enzymeinhibition;organophosphoruspesticide;carbamatepesticide;vegetables;pre-treatmentmethod

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601037

碩士研究生(張志清教授為通訊作者，E-mail:zqzhang)。

2015-07-02，改回日期：2015-09-01