王宏,溫冬玲，馬生健

(嶺南師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣東 湛江,524048)

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Box-Behnken優(yōu)化富硒豆芽處理?xiàng)l件

王宏,溫冬玲，馬生健*

(嶺南師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣東 湛江,524048)

以有機(jī)富硒液體肥為硒源，對豆芽的富硒培育條件進(jìn)行優(yōu)化研究。選擇熱燙溫度、熱燙時間、有機(jī)富硒濃度和浸泡時間作為優(yōu)化因素，研究各因素的不同水平對富硒豆芽發(fā)芽率和硒含量的影響。通過單因素試驗(yàn)和box-behnken設(shè)計(jì)得出了豆芽富硒處理的最佳條件。結(jié)果表明：最佳處理?xiàng)l件為熱燙溫度49 ℃、熱燙時間為10 min,有機(jī)富硒濃度為3.5×10-4mg/mL，浸泡時間為6 h，在此條件下富硒豆芽的實(shí)測發(fā)芽率達(dá)到最大值為97.96%，相應(yīng)地硒含量為14.893 μg/g。

有機(jī)富硒液體肥；box-behnken；發(fā)芽率；硒含量

硒是人體必需的微量元素之一。硒元素不僅是多種酶的構(gòu)成成分，同時具有抗氧化、調(diào)節(jié)甲狀腺激素水平、維持正常免疫、預(yù)防克山病和大骨節(jié)病等作用，還具有抗腫瘤、維持正常生育功能、保護(hù)視力、拮抗汞毒等多種生理功能[1]。硒分為無機(jī)硒、有機(jī)硒。硒鹽的毒理分析表明，無機(jī)硒均為劇毒，過量攝入硒會導(dǎo)致急、慢性中毒，一般僅用于醫(yī)藥品而不用于食品，其使用范圍和劑量都受到限制。有機(jī)硒是生物體通過代謝過程將環(huán)境中的無機(jī)硒通過與體內(nèi)的生物大分子相結(jié)合形成含硒有機(jī)物，與無機(jī)硒相比，其毒性小而生物活性高[2-3]。

利用無機(jī)硒浸泡可顯著提高豆芽的硒含量，但由于無機(jī)硒的使用存在安全隱患，因此生產(chǎn)上很難推廣使用。當(dāng)前市場上已有使用較安全的有機(jī)硒肥，并在多種作物上應(yīng)用具有較好的富硒效果，但目前鮮有有機(jī)硒肥應(yīng)用于豆芽上的富硒效果研究。故本研究選擇有機(jī)富硒液體肥為硒源，選擇對硒有一定富集能力，而又為消費(fèi)者經(jīng)常食用的豆芽菜為對象。

在豆芽的生產(chǎn)過程中品種篩選和籽粒精選是決定著芽苗菜的產(chǎn)量與品質(zhì)的內(nèi)因，燙種、浸種和栽培是外因。普通的浸泡、萌發(fā)工藝生產(chǎn)富硒豆芽常常遇到萌發(fā)率不高、產(chǎn)量不高、富硒效果不佳、質(zhì)量不佳和爛根等問題[4]。植物種子萌芽是一個較復(fù)雜的生物學(xué)過程，通過合理科學(xué)的種子熱燙處理可提高種子發(fā)芽率并提高產(chǎn)量等。熱燙處理主要是在一定溫度下對種子進(jìn)行水浴熱處理，使種皮的透性增大，氧氣可以順利進(jìn)入，從而使種子內(nèi)的代謝活動加強(qiáng)，促進(jìn)三大貯藏物質(zhì)的分解，達(dá)到促進(jìn)種子生長的目的[5]。本文主要研究熱燙、浸種處理及有機(jī)富硒濃度對富硒豆芽發(fā)芽率和硒含量的影響，并采用響應(yīng)曲面法中的Box-behnken對影響豆芽發(fā)芽率和富硒含量的不同處理?xiàng)l件(熱燙溫度、熱燙時間、有機(jī)富硒濃度、浸泡時間)及其相互作用進(jìn)行研究，從而得出最佳富硒豆芽生產(chǎn)處理?xiàng)l件。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

大豆:當(dāng)年產(chǎn)的東北大豆(購買于廣東省湛江市赤坎區(qū)信和超市)，挑選籽粒飽滿，無爛或蟲蛀的大豆做實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1試劑

綠維康牌有機(jī)富硒肥，楊凌奧邦生物科學(xué)有限公司生產(chǎn)。產(chǎn)品登記證號：農(nóng)肥(2008)準(zhǔn)字1755號。執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn): NY1428-2010)。

硒標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于湛江市赤坎區(qū)步行街康百公司購買，濃度1 000 μg/mL；硒標(biāo)準(zhǔn)使用液：1.568 μg/mL。

EDTA溶液、KI溶液、醋酸鈉溶液(NaAc)、HCl、可溶性淀粉、結(jié)晶紫溶液。

1.2.2儀器

HPX-9052ME數(shù)顯電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；721分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AUY200精密電子天平，四川成都科恒達(dá)儀儀器設(shè)備有限公司；GZX-9140MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DFY-200型手提式高級中藥粉碎機(jī)，青州市三寶中藥機(jī)械廠。

1.3富硒豆芽工藝流程

黃豆→沖洗→燙種→浸種→萌發(fā)(催芽)→采收

1.4單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照文獻(xiàn)[5-9]中的富硒豆芽的處理方法，確定富硒豆芽的基本處理?xiàng)l件分別為，熱燙溫度為50 ℃、熱燙時間4 min、浸泡時間6 h。經(jīng)過初步預(yù)實(shí)驗(yàn)與富硒食品含硒量標(biāo)準(zhǔn)[12]確定有機(jī)富硒濃度為1×10-4mg/mL，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)。

1.4.1不同熱燙溫度對大豆發(fā)芽率和硒含量的影響

分別稱取6份100 g的大豆洗凈后分別置于大燒杯內(nèi)，按以下方法進(jìn)行處理：將大豆分別在40、45、50、55、60 ℃溫水中燙4 min，然后將處理好的大豆用1×10-4mg/mL綠維康有機(jī)富硒液體肥溶液在25 ℃培養(yǎng)箱中浸泡6 h，待浸泡完后，將種子置于底鋪紗布的帶孔塑料圓盤中，上蓋紗布于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)4 d，每隔12 h噴灑10 mL的蒸餾水。觀察培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h的大豆發(fā)芽情況，硒含量采用分光光度計(jì)進(jìn)行測定[10]。比較熱燙溫度對發(fā)芽率和硒含量的影響，確定有利的熱燙溫度，以未處理的樣品做對照。

1.4.2不同熱燙時間對大豆發(fā)芽率和硒含量的影響

操作方法同1.4.1，改變燙種時間，分別為2、4、8、16、32 min，比較熱燙時間對大豆發(fā)芽率和硒含量的影響，以未處理的樣品做對照。

1.4.3有機(jī)富硒濃度對大豆發(fā)芽率和硒含量的影響

操作方法同1.4.1，其他條件保持不變，將大豆分別置于不同濃度的綠維康有機(jī)富硒肥溶液中浸泡，分別為1×10-4、2×10-4、3×10-4、4×10-4、5×10-4mg/mL,根據(jù)我國富硒食品硒含量標(biāo)準(zhǔn)[11]以及人每天推薦攝入硒含量確定較適宜的濃度，以未處理的樣品做對照。

1.4.4浸泡時間對大豆發(fā)芽率和硒含量的影響

操作方法同1.4.1，在其他因素不變的條件下，分別浸種3、6、9、12、15 h。確定大豆富硒的最佳浸泡時間，以未處理的樣品做對照。

1.5實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測定

1.5.1發(fā)芽率的測定[6]

發(fā)芽率是指經(jīng)過浸泡、萌發(fā)處理后，樣品中發(fā)芽的大豆數(shù)量占樣品中大豆總數(shù)的百分比。發(fā)芽率的測定方法為，從每份萌發(fā)好的大豆樣品中隨機(jī)取出3份小樣，每份小樣的大豆總數(shù)在30～50粒之間，計(jì)數(shù)每份小樣中發(fā)芽與不發(fā)芽的大豆數(shù)，即可計(jì)算該份小樣的發(fā)芽率，然后用3份小樣發(fā)芽率的平均值來代表整份大豆樣品的發(fā)芽率。大豆發(fā)芽的判定標(biāo)準(zhǔn)為伸出大豆種皮的胚根長度大于1 mm。

1.5.2豆芽硒含量測定[10]

1.5.2.1實(shí)驗(yàn)原理

利用濃HNO3的強(qiáng)氧化性，將硒氧化成四價(jià)，四價(jià)硒與I-在酸性介質(zhì)中得到體積較大的I3-離子與結(jié)晶紫大陽離子形成有色締合物。用分光光度計(jì)測定硒(IV)-KI-結(jié)晶紫體系吸光度值，應(yīng)用對照法測定豆芽中硒含量。

1.5.2.2樣品處理

取培養(yǎng)結(jié)束的豆芽用蒸餾水沖洗，烘干，取出，研成細(xì)末，置干燥器中備用。取細(xì)粉1.000 g，精密稱定，置100 mL燒杯中。加入10 mL濃HNO3浸泡12 h后加熱蒸發(fā)浸取液近干稍冷，加1 mL H2O2,在稍加熱，冷卻后濾去殘?jiān)?，濾液置于250 mL容量瓶中，用純凈水定容，作為待測液。

1.5.2.3硒含量測定

取編號為1、2、3三只25 mL容量瓶，移取1 mL硒標(biāo)準(zhǔn)液于2號瓶中，移取1 mL以處理好的樣品液于3號瓶中，在3只容量瓶中均依次加入9 mL HCl、2.5 mL KI、2 mL NaAc、2 mL淀粉溶液、2 mL結(jié)晶紫，以水定容，搖勻。配好溶液穩(wěn)定10 min后，用1 cm比色皿，在波長544 nm處以1號瓶溶液為參比液測定吸光度值，硒含量(X)記錄。

式中:A樣，樣品的吸光度值； A標(biāo)，硒標(biāo)液的吸光度值；c標(biāo),硒標(biāo)準(zhǔn)溶液溶度μg/mL；m,樣品質(zhì)量g；V,定容后濾液體積，mL。

1.6Box-behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)上述的單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 8.0.5軟件，分別選擇單因素實(shí)驗(yàn)中的4個不同因素的3種不同水平進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。以熱燙溫度(℃)(X1),熱燙時間(min)(X2)、有機(jī)富硒濃度(10-4mg/mL)(X3)、浸種時間(h)(X4)為主要考察因素，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

1.7數(shù)據(jù)處理

每個樣品試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。采用Excel 2007和Design-Expert 8.05進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析，數(shù)據(jù)采用方差(ANOVA)，當(dāng)P<0.05時表示差異性顯著，P<0.01表示極顯著。

表1　Box-behnken實(shí)驗(yàn)因素水平編碼

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1熱燙溫度與時間對大豆發(fā)芽率和硒含量的影響

如表2所示,與未熱燙處理的大豆相比較，在熱燙溫度40～50 ℃內(nèi)，隨著溫度的升高，大豆24 h發(fā)芽率與硒含量都呈現(xiàn)增加趨勢，但溫度為60 ℃，發(fā)芽率明顯下降，大豆硒含量也減少，原因是溫度過高，對大豆造成器質(zhì)上的傷害[12]。當(dāng)熱燙溫度為50 ℃ 時，隨著熱燙時間的延長各項(xiàng)指標(biāo)呈現(xiàn)先升高后降低的變化，當(dāng)熱燙時間為8 min時，發(fā)芽率最高，硒含量也較高。這說明熱燙時間過短，對大豆的刺激不夠，生長緩慢，吸收硒溶液較慢。但熱燙時間過長，大豆無氧呼吸增強(qiáng)反而會喪失部分發(fā)芽能力，抑制種子的萌發(fā)，也在一定程度上影響其硒溶液的吸收。

表2　熱燙溫度與時間對大豆發(fā)芽率和硒含量的影響

2.1.2有機(jī)富硒濃度與浸泡時間對大豆發(fā)芽率和硒含量的影響

從表3可以看出，用有機(jī)富硒肥浸泡的大豆的發(fā)芽率明顯高于未處理組，而且發(fā)芽率與硒含量隨著濃度的增大而增大，含硒量是未處理組的10多倍。說明有機(jī)富硒肥可以縮短大豆發(fā)芽時間，提高發(fā)芽率，還能顯著提高大豆的硒含量，達(dá)到很好的富硒效果,與有機(jī)富硒肥產(chǎn)品功能介紹相符。隨著浸泡時間的升高，大豆在24 h發(fā)芽率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，說明長時間浸泡，大豆無氧呼吸增強(qiáng)反而會喪失部分發(fā)芽能力，抑制種子的萌發(fā)。硒含量在3～9 h是不斷增加的，增加的幅度較大，而在12～18 h時變化不大。說明浸泡時間到一定程度時，大豆吸收硒溶液達(dá)到了一個飽和狀態(tài)。

表3　有機(jī)富硒濃度與浸泡時間對大豆發(fā)芽率和硒含量的影響

2.2Box-behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析[13-14]

根據(jù)試驗(yàn)因素和水平的設(shè)計(jì)，采用不同的熱燙溫度、熱燙時間、有機(jī)富硒濃度和浸泡時間處理大豆，利用Design-Expert 8.0.5軟件共進(jìn)行了29次實(shí)驗(yàn)，并分別對大豆發(fā)芽率和硒含量進(jìn)行評定。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表4。

表4　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過析因?qū)嶒?yàn)和中心試驗(yàn)，以析因點(diǎn)為自變量取值在熱燙溫度X1，熱燙時間X2、有機(jī)富硒濃度X3和浸泡時間X4所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，中心點(diǎn)試驗(yàn)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，回歸分析結(jié)果見表5。

由表5知，大豆發(fā)芽率模型(P<0.000 1)達(dá)到極顯著水平，且有很好的確定系數(shù)。方差分析中，熱燙溫度(X1)、熱燙時間(X2)、有機(jī)富硒濃度(X3)和浸種時間(X4) 對大豆發(fā)芽率影響是顯著的(P<0.05)。

表5　大豆發(fā)芽率響應(yīng)曲面二次模型的方差分析

注：P<0.05顯著，P<0.001極顯著。

回歸診斷顯示，多元相關(guān)系數(shù)(R2)=0.975 1，表明方程擬合度和可信度較高。失擬項(xiàng)P=0.219 9>0.05不顯著，表明可用二次回歸方程模型代替試驗(yàn)點(diǎn)對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。綜上，該回歸模型可用于大豆發(fā)芽率的響應(yīng)值預(yù)測。

根據(jù)Design-Expert 8.05軟件得到的二次回歸方程如下：

發(fā)芽率/%=+96.24-4.12X1-1.89X2+1.41X3-2.15X4-2.37X1X2-1.18X1X3-2.36X1X4-0.26X2X3-1.84X2X4-0.45X3X4-5.83X12-3.12X22-1.94X32-1.02X42

硒含量=+9.10-0.17X1-0.034X2+1.66X3+0.18X4-0.19X1X2-0.14X1X3-0.011X1X4-0.064X2X3+0.17X2X4-0.23X3X4-0.55X12+8.708E-003X22+0.37X32-0.18X42

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果，可由Design-Expert 8.05軟件得到圖1。

圖1　各種因素對大豆發(fā)芽率的交互影響Fig.1　Effect of interaction of each fators on germination rate of soybeans

圖1為各個因素之間的相互作用對大豆發(fā)芽率的影響。從圖1-a可以看出，熱燙溫度和熱燙時間對大豆發(fā)芽率的影響是顯著的。在一定的熱燙時間下，隨著熱燙溫度的上升，發(fā)芽率呈現(xiàn)先增大后降低，曲面坡度變化較大，在接近50 ℃時，達(dá)到最大值。熱燙溫度一定時，發(fā)芽率隨著熱燙時間的延長也呈先增大后減少趨勢。

圖1-b顯示，熱燙溫度和有機(jī)富硒濃度對大豆發(fā)芽率的影響是顯著的。熱燙溫度在上升過程中，大豆發(fā)芽率先增加后減少，當(dāng)熱燙溫度為50 ℃左右時，發(fā)芽率達(dá)到最大值；有機(jī)富硒濃度不斷上升過程中，大豆發(fā)芽率也不斷增加，曲面坡度比較陡。圖1-c、圖1-d同理進(jìn)行分析得出浸泡時間與熱燙溫度，熱燙時間之間都存在一定的相互作用。

2.3模型優(yōu)化和驗(yàn)證

通過對二次回歸模型的分析，在設(shè)定大豆發(fā)芽率最大的前提下，以硒含量為指標(biāo)，確定富硒豆芽最佳處理?xiàng)l件見表6。

表6　富硒豆芽的優(yōu)選理論工藝參數(shù)

綜合以上分析結(jié)果，采用優(yōu)化的富硒豆芽處理?xiàng)l件進(jìn)行富硒豆芽的評定驗(yàn)證試驗(yàn)，熱燙溫度為49 ℃，熱燙時間為10 min，有機(jī)富硒濃度為3.5×10-4mg/mL，浸泡時間為6 h，重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果取3次的平均值。豆芽發(fā)芽率為97.96%，硒含量為14.893 μg/g，這表明理論值和實(shí)際值之間具有良好的擬合性，優(yōu)化模型可靠。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)利用Box-behnken對富硒豆芽的處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳處理?xiàng)l件為熱燙溫度49 ℃，熱燙時間為10 min,有機(jī)富硒濃度為3.5×10-4mg/mL，浸泡時間為6 h，在此條件下富硒豆芽的實(shí)測發(fā)芽率達(dá)到最大值為97.96%，相應(yīng)地硒含量為14.893 μg/g.

中國營養(yǎng)學(xué)會推薦的成年人硒攝入量為50～250 μg/d[12]，依照經(jīng)過3.5×10-4mg/mL有機(jī)硒溶液處理后豆芽含硒量及我國的RDA標(biāo)準(zhǔn)，成人每天只需攝入15 g該富硒豆芽就能滿足中國營養(yǎng)學(xué)會的RDA標(biāo)準(zhǔn)。由于有機(jī)硒容易被吸收，如果按照人每天攝入量100 g計(jì)算，則浸泡處理大豆的有機(jī)硒濃度將要更低。

本文對豆芽進(jìn)行富硒處理就是其中一種富硒產(chǎn)品。而對豆芽富硒處理可以采用浸泡和噴灑的方式，而本論文實(shí)驗(yàn)對豆芽采用的是有機(jī)硒濃度浸泡的方式，噴灑方式對硒含量的影響有待進(jìn)一步研究。

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Optimization of the processing conditions of the selenium-enriched bean sprouts with box-behnken design

WANG Hong, WEN Dong-ling， MA Sheng-jian*

(Life Science and Technology School，Lingnan Normal University，Zhanjiang 524048,China)

This paper optimize the cultivation conditions of selenium-enriched sprouts by taking selenium-rich liquid fertilizer as organic selenium source. Blanching temperature, blanching time, concentration of selenium fertilizer and soaking time were selected as the factors in optimization, the effect of different factors to the germination rate and selenium content of selenium-enriched bean sprouts were studied. The optimum processing conditions for selenium-enriched bean sprouts were determined by single factor experiment and Box-behnken design. The results showed that the best conditions were: blanching temperature 49 ℃, blanching for 10 min, at selenium fertilizer 3.5×10-4mg/mL, soaking for 6 hours. Under the above conditions, the maximum germination rate was 97.96% and selenium content of selenium-enriched bean sprouts was 14.893 μg/g.

organic elenium-riched liquid fertilizer； box-behnken； germination rate； selenium content

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601021

碩士，副教授(馬生健副教授為通訊作者，E-mail：mashengjian1@163.com)。

國家星火計(jì)劃資助(2013GA780088)；湛江市熱帶特色資源植物技術(shù)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2014A06008)

2015-04-29，改回日期：2015-09-16