馬樂，張有林，韓軍岐，周星余，夏莎莎

(陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院, 陜西 西安，710119)

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大孔樹脂對核桃青皮中胡桃醌的分離純化

馬樂，張有林，韓軍岐*，周星余，夏莎莎

(陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院, 陜西 西安，710119)

比較6種不同極性大孔樹脂對核桃青皮提取物中胡桃醌的靜態(tài)吸附和解吸性能，篩選出最佳的大孔樹脂。通過與胡桃醌標準品HPLC 保留時間相比較的方法對胡桃醌含量進行分析。結(jié)果表明：D101樹脂為純化核桃青皮胡桃醌的最佳樹脂，較佳的動態(tài)吸附條件為上樣液胡桃醌濃度0.114 mg/mL，pH 2.0，上樣速率為1.0 mL/min，吸附率可達81.85%；較佳的洗脫條件為體積分數(shù)95%的丙酮，pH 4.0，洗脫速率為0.33 mL/min，解吸率為76.5%。經(jīng) HPLC鑒定和分析，D101分離純化核桃青皮胡桃醌不會造成組成變化和較大損失。 D101大孔樹脂對核桃青皮胡桃醌有較好的分離純化效果。

核桃青皮；胡桃醌；大孔樹脂；分離純化

核桃青果皮(walnut green husk)在中藥中被稱為青龍衣，是核桃外部一層厚厚的綠色果皮，青龍衣含有一類生物活性較高的物質(zhì)——胡桃醌(5-羥基-1,4-萘醌)。青龍衣辛、苦、澀、平，有清熱解毒、祛風療癬、止痛止痢的功效[1]。由于胡桃醌具有廣泛的藥用價值，所以近年來備受人們關(guān)注。據(jù)相關(guān)研究表明，核桃青皮中胡桃醌有抑癌、抗腫瘤作用，因此綜合開發(fā)和有效利用核桃青皮中的胡桃醌具有重要意義[2]。大孔吸附樹脂有較好的選擇性、吸附容量大和易于再生等優(yōu)點，被廣泛應用于天然產(chǎn)物活性物質(zhì)的分離純化[3]，但尚未見此法應用于核桃青皮胡桃醌分離純化的相關(guān)報道。因此，本研究以核桃青皮為原料，通過6種不同性能樹脂(見表1)的吸附解吸試驗，篩選適合樹脂，對核桃青皮胡桃醌進行分離純化，以期獲得最佳的純化效果。

表1　6種大孔樹脂的基本性能

1　材料與方法

1.1材料與儀器

青皮核桃：8月中旬核桃采摘于陜西省藍田縣 青皮核桃取青皮，冷凍干燥處理后研磨，過 60 目篩，裝于棕色玻璃瓶內(nèi)，冷藏備用；大孔吸附樹脂AB-8、S-8、NKA-9、D-101，西安藍曉科技新材料股份有限公司；X-5、LS-300，西安藍深特種樹脂有限公司；胡桃醌標準品，美國Sigma公司；H3PO4、甲醇 色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；無水乙醇、丙酮、甲醇、NaOH、濃HCl,分析純, 天津富宇化工有限公司。

KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海安亭實驗儀器有限公司； UV-1100紫外可見分光光度計,上海美譜達儀器有限公司； HL-2S恒流泵,上海滬西分析儀器廠有限公司；SHZ-82恒溫振蕩器,金壇市富華儀器有限公司； LGJ-18C冷凍干燥機,北京四環(huán)科學儀器廠；PHS-3C精密pH計,上海精密科學儀器有限公司；JA1203電子天平,上海精密科學儀器有限公司；Breeze1525高相液相色譜儀,美國Waters公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品溶液的制備

稱量一定量的核桃青皮干粉，以體積分數(shù)85%乙醇為提取劑，設(shè)置超聲波功率為 150 W，處理時間30 min，提取溫度35 ℃，料液比1∶20(g∶mL)，提取2次，真空抽濾，合并濾液；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，獲得胡桃醌粗品，以甲醇溶解制得樣品溶液。

1.2.2胡桃醌含量的測定

精確稱取胡桃醌對照品7.50 mg，甲醇溶解定容至50 mL，即為胡桃醌標準品溶液。分別取胡桃醌標準品溶液0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mL 定容至50 mL，即得濃度分別為0、0.001 5、0.003、0.006、0.012、0.024、0.048 mg/mL梯度溶液。在紫外可見分光光度計下，422 nm波長處測定各梯度溶液的吸光值。繪制吸光值(A)與胡桃醌標準品質(zhì)量濃度(c)的標準曲線，獲得回歸方程。

1.2.3大孔樹脂的預處理

大孔樹脂先用4% NaOH 溶液浸泡4 h，蒸餾水洗至中性；后用 4% HCl 溶液浸泡4 h，蒸餾水洗至中性；最后通過體積分數(shù)95%乙醇浸泡處理4 h，蒸餾水沖洗至無醇味，備用。

1.2.4大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸

(1)靜態(tài)吸附實驗。準確稱取1.0 g 濕樹脂放置于50 mL具塞錐形瓶中，加入樣品溶液30 mL，密封置于175 r/min搖床上，25 ℃下振蕩12 h，吸取上清液測定胡桃醌含量。根據(jù)公式(1)和(2)計算吸附量和吸附率[4-5]：

(1)

(2)

式中：qe,吸附量,mg/g；E,吸附率, %；c0,起始質(zhì)量濃度,mg/mL；c1,平衡質(zhì)量濃度,mg/mL；V1,吸附溶液體積,mL；m,樹脂的質(zhì)量,g。

(2)靜態(tài)解吸實驗。將已經(jīng)充分吸附的樹脂用蒸餾水清洗，直至表面無樣品液殘留，然后再用濾紙吸干水分，放置于具塞錐形瓶中。分別加入30 mL不同溶劑密封置于175 r/min振蕩器中，25 ℃下振蕩，解吸12 h后，吸取上清液測定胡桃醌含量。根據(jù)下列公式計算解吸率和解吸量[4-8]：

(3)

(4)

式中：D,解吸率, %；qd,解吸量,mg/g;c0,起始質(zhì)量濃度,mg/mL；c1,平衡質(zhì)量濃度mg/mL；V1,吸附溶液體積mL；c2,解吸液中多酚質(zhì)量濃度,mg/mL；V2,解吸溶液體積,mL；m,樹脂取量,g。

1.2.5大孔樹脂動態(tài)吸附與解吸

將預處理好的大孔樹脂濕法裝入(16 mm×500 mm)層析柱中，用蒸餾水平衡后，將樣品溶液以一定流速上樣并收集流出液，每10 mL為一管，測定并計算流出液的濃度，確定流速、體積等條件，得到最佳的吸附條件，繪制動態(tài)吸附曲線。

將吸附飽和的樹脂進行解吸試驗，用蒸餾水洗至無粗提液殘留，適當濃度的洗脫液以一定流速進行洗脫并收集洗脫液，計算流出液濃度，確定洗脫流速、體積等條件，得到最佳的洗脫條件，繪制動態(tài)洗脫曲線。

1.3核桃青皮中胡桃醌的含量HPLC分析

經(jīng)過大孔樹脂純化后的核桃青皮胡桃醌提取物采用 HPLC法測定其含量。具體 HPLC 條件參考曲中原等的方法[2]，色譜柱為Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 流動相為V(甲醇)∶V(水)=55∶45, 水相用H3PO4調(diào)pH 值約為 3.5(磷酸∶水體積比為 1∶500), 體積流量0.8 mL/min, 檢測波長250 nm, 柱溫30 ℃。樣品色譜峰保留時間與標準品保留時間相比較，根據(jù)峰面積計算胡桃醌含量，結(jié)果以1g核桃青皮干粉中胡桃醌含量(μg)計。

1.4統(tǒng)計分析

試驗重復3次，結(jié)果以均值±標準差表示，結(jié)果采用DPS進行方差分析及Excel軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果與分析

2.1標準曲線的繪制

以胡桃醌標準品濃度為橫坐標(X, mg/mL)，吸光度值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，見圖1。回歸方程為：Y=20.279X+0.001 9，R2=0.999 7，表明該曲線具有較好的線性關(guān)系。

圖1　胡桃醌標準曲線圖Fig.1　Standard curve of juglone

2.2大孔樹脂的篩選

由于大孔樹脂物理結(jié)構(gòu)、化學性質(zhì)的不同，所以對胡桃醌的吸附、解吸效果也有所不同，表2顯示了6種大孔樹脂對核桃青皮粗提液中胡桃醌的靜態(tài)吸附量、解吸量和解吸率。

表2　6種大孔樹脂靜態(tài)吸附和解析性能的分析比較

注：同列不同字母表示統(tǒng)計學上具有顯著差異(P<0.05)。

據(jù)表2可知，D101對核桃青皮胡桃醌的吸附量最高，可達到0.315 mg/g；其次是NKA-9吸附量為0.308 mg/g；吸附效果最差的S-8吸附量僅為0.182 mg/g。通過對6種大孔樹脂解吸性能試驗可得，D101對胡桃醌的解吸性能最好，解吸率可達70.2%；其次AB-8解吸率為65.67%；LS-300的解吸率最差僅有50.3%。這一現(xiàn)象說明，大孔樹脂對核桃青皮胡桃醌的吸附和解吸存在一定的選擇性。D101樹脂吸附量明顯高于其他5種樹脂(P<0.05)，可能是由于D101樹脂的極性和核桃青皮中胡桃醌極性相似，且D101在解吸效果中也明顯優(yōu)于其他樹脂(P<0.05)，故綜合考慮D101樹脂為此次試驗中純化胡桃醌的最佳樹脂。

2.3靜態(tài)吸附與解吸條件的優(yōu)化

2.3.1大孔樹脂對核桃青皮胡桃醌的吸附性能

D101樹脂中加入胡桃醌粗提液進行靜態(tài)吸附，每隔一段時間測定胡桃醌含量，計算吸附量。將吸附飽和樹脂進行靜態(tài)解吸試驗，同樣測定胡桃醌含量，計算解吸量，并繪制靜態(tài)吸附和解吸動力學曲線。

D101樹脂在靜態(tài)吸附起始階段對核桃青皮胡桃醌的吸附量快速增加，屬快速平衡型[9]。隨著時間的延長，吸附量逐漸達到飽和。當在4 h時樹脂吸附基本達到平衡，如果再延長吸附時間，吸附量的變化幅度不大，因此可選擇4 h作為吸附平衡態(tài)，見圖2。

圖2　D101樹脂靜態(tài)吸附和解吸動力學曲線Fig.2　The static adsorption and desorption kinetic curve of D101 resin

通過解吸曲線可知，解吸開始時隨著時間的延長而不斷增大，當處在2h時樹脂解吸量已達較高，再延長時間解吸量變化不太明顯，說明2 h后就達到了解吸平衡狀態(tài)。

2.3.2粗提液pH值對大孔樹脂吸附效果的影響

調(diào)節(jié)粗提液pH值為1.0～7.0，經(jīng)過一段時間的靜態(tài)吸附，測吸附后胡桃醌含量，計算吸附率，結(jié)果見圖3。

圖3　pH值對胡桃醌吸附率的影響Fig.3　The effect of pH on adsorption ratio of juglone

由圖3可知，當pH 2.0時樹脂對胡桃醌吸附效果最佳，隨pH值升高D101樹脂吸附能力逐漸下降，這可能是因為核桃青皮胡桃醌結(jié)構(gòu)中的-OH基團中的H+被解離出來，以離子形式存在于溶液中，在此狀態(tài)下不易被樹脂吸附。說明核桃青皮中的胡桃醌可能在酸性環(huán)境下能夠保持分子狀態(tài)，有利于D101樹脂的吸附。

2.3.3粗提液胡桃醌濃度對樹脂吸附效果的影響

配制粗提液胡桃醌濃度為0.072 4～0.201 0 mg/mL，進行靜態(tài)吸附試驗，測胡桃醌含量并計算吸附率，結(jié)果見圖4。

圖4　不同濃度胡桃醌靜態(tài)吸附曲線Fig.4　Static adsorption curve of different juglone concentration

上樣濃度大小影響大孔樹脂的吸附性能。一般情況，大孔樹脂吸附量與上樣液濃度成反比，低濃度有利于吸附進行[10]。由圖4可知，隨樣品液初始濃度不斷增加，D101樹脂的吸附量也不斷升高，當胡桃醌濃度增加到0.114 mg/mL時，樹脂吸附率由高逐漸降低。應該是由于在低濃度時，胡桃醌分子能夠有機會充分接觸樹脂，而在高濃度條件下，胡桃醌分子擴散受到抑制使樹脂吸附能力下降，故試驗選擇胡桃醌上樣濃度0.114 mg/mL為宜。

2.3.4不同洗脫劑對大孔樹脂解吸效果的影響

將已吸附飽和的樹脂進行靜態(tài)解吸試驗，分別選用甲醇、乙醇和丙酮作為洗脫劑，經(jīng)過一段時間的洗脫，測定胡桃醌含量并計算解吸率，結(jié)果見圖5。

圖5　不同洗脫劑對胡桃醌解吸率的影響Fig.5　Effect of different elution reagents on the desorption rate of juglone

一般情況，大孔樹脂使用的洗脫劑主要有甲醇、乙醇和丙酮[11]。如圖5所示，甲醇作為洗脫劑進行解吸，解吸率僅為17.7%，均低于乙醇和丙酮，而丙酮對胡桃醌的洗脫能力最強，因此丙酮為最佳洗脫劑。

2.3.5丙酮濃度對大孔樹脂解吸效果的影響

將不同濃度的丙酮溶液分別放入吸附飽和的樹脂中，靜態(tài)解吸一段時間，測胡桃醌含量，計算解吸率，結(jié)果見圖6。

圖6　丙酮濃度對胡桃醌解吸率的影響Fig.6　Effect of acetone concentration on desorption rate of juglone

如圖6所示，隨著丙酮濃度提高，解吸率不斷增加，當丙酮濃度增加到95%時，再進一步增加濃度，解吸率反而會降低，可能是因為洗脫劑的極性在一定程度上影響吸附質(zhì)洗脫[12]，所以選擇95%丙酮為較佳的洗脫濃度。

2.3.6解吸液pH值對大孔樹脂解吸效果的影響

調(diào)節(jié)洗脫劑pH值為1.0～7.0，經(jīng)過一段時間靜態(tài)解吸測定解吸后的胡桃醌含量，計算解吸率，結(jié)果見圖7。

圖7　pH對胡桃醌解吸率的影響Fig.7　Effect of pH on desorption rate of juglone

圖7所示，隨洗脫劑pH不斷升高，胡桃醌解吸率逐漸增加，當pH 4.0時解吸率達到最大，但當pH值繼續(xù)升高，解吸能力反而下降。這可能是因為酸性不斷降低使胡桃醌分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導致解吸率降低。而當pH值為4.0時，因胡桃醌與樹脂之間的作用較弱，胡桃醌容易被洗脫，故解吸率達到最大。

2.4大孔樹脂動態(tài)吸附與解吸條件優(yōu)化

2.4.1上樣流速對大孔樹脂吸附效果的影響

大孔樹脂濕法裝柱后, 胡桃醌粗提液分別以0.33、1.0和1.7 mL/min流速上樣，收集流出液，測胡桃醌濃度并繪制動態(tài)吸附曲線，結(jié)果見圖8。

圖8　流速對吸附效果的影響Fig.8　Influence of flowing rates on adsorption effect

通常上樣速度慢有利于樹脂對胡桃醌吸附，如果流速過快，樣品液中部分胡桃醌來不及擴散到樹脂內(nèi)表面，就流出柱子，導致樹脂對胡桃醌的吸附量下降；但是如果流速過慢，不僅會影響生產(chǎn)效率，而且還會增長生產(chǎn)周期[13]。如圖8所示，在0.33 mL/min和1.0 mL/min兩種上樣流速下，樹脂吸附胡桃醌的能力均優(yōu)于1.7 mL/min的情況。在0.33、1.0 mL/min速率下，樹脂的吸附能力相差不大(P>0.05)，因此選擇流速1.0 mL/min為宜。

2.4.2洗脫劑流速對大孔樹脂解吸效果的影響

吸附飽和的樹脂，用95%丙酮溶液進行洗脫，洗脫流速分別為0.33、1.0和1.7 mL/min流速上樣，收集洗脫液，測定胡桃醌濃度并繪制動態(tài)解吸曲線，結(jié)果見圖9。

圖9　洗脫劑流速解吸效果的影響Fig.9　Influence of eluting rates on desorption effect

一般而言，洗脫流速要求慢，如果流速快，可能會使洗脫劑不能夠和樹脂充分接觸，導致解吸量降低，生產(chǎn)效率下降；但如果流速過慢，又會延長生產(chǎn)周期，故生產(chǎn)中要進行綜合考慮[14]。由圖9可知，隨著洗脫速度的增加，解吸量不斷下降，當洗脫速度為0.33 mL/min時有較好的洗脫效果，所以選此流速為最佳洗脫流速。

2.5核桃青皮中胡桃醌的含量HPLC分析

D101純化前后的核桃青皮胡桃醌提取物及胡桃醌標準品HPLC譜見圖10。核桃青皮胡桃醌純化前保留時間4～15 min 之間有許多雜峰，經(jīng)D101純化后雜峰被有效降低，與胡桃醌標準品對比出峰時間也無明顯變化，表明D101 大孔樹脂適用于分離純化核桃青皮胡桃醌且不會造成成分變化。核桃青皮胡桃醌純化前后含量見表3。

表3　D101大孔樹脂純化前后胡桃醌含量比較1)

注：1)含量以 μg/ g核桃青皮粉計，均值±標準差；2)保留率：核桃青皮胡桃醌純化后與純化前含量的比值。

A：純化前;B：純化后 C：胡桃醌標準品圖10　大孔樹脂D101純化前、后的核桃青皮提取物HPLC譜及胡桃醌標準品 HPLC 譜Fig.10　Effects of D101 resin on HPLC spectrum of walnut green husk extract and the HPLC spectrum of standard juglone

3　結(jié)論

通過靜態(tài)吸附、解吸試驗對6種大孔樹脂進行篩選，得到適用于核桃青皮胡桃醌分離純化的D101樹脂。試驗對胡桃醌粗提液pH值、質(zhì)量濃度、洗脫劑種類、洗脫液濃度以及上樣液流速等影響因素進行考察，初步確定了胡桃醌的吸附、解吸條件。(1)最佳吸附條件為：核桃青皮胡桃醌上樣質(zhì)量濃度為0.114 mg/mL，pH 2.0時，以1.0 mL/min的流速上樣，在此條件下樹脂對胡桃醌的吸附率最高，可達到81.85%。(2)最佳解吸條件為：洗脫劑為體積分數(shù)95%的丙酮，pH 4.0時，以0.33 mL/min的流速洗脫，解吸效果較好，解吸率可達76.5%。經(jīng)HPLC分析鑒定，D101樹脂分離純化核桃青皮胡桃醌不僅能夠有效去除雜質(zhì)而且也不會引起胡桃醌成分的變化。由此可見，D101樹脂分離核桃青皮胡桃醌是可行的，且為以后在生產(chǎn)中開展胡桃醌的分離純化奠定理論基礎(chǔ)。

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Separation and purification of juglone from walnut green husk by macroporous resin

MA Le, ZHANG You-lin, HAN Jun-qi*, ZHOU Xing-yu,XIA Sha-sha

(College of Food Engineering and Nutritional Science Shanxi Normal University, Xi'an 710119, China)

The content of juglone from walnut green husk extraction was relatively low, which influences its biological activity. So it is important to find a simple and effective method to separate and purify it. Moreover, the optimum technology and conditions were also needed. Method: The static adsorption and desorption performance of six different polarities macroporous resins to juglone of walnut green husk extracts were compared to select the most suitable resin. The juglone content of walnut green husk extracts were analyzed by HPLC (high performance liquid chromatography) through comparing to the retention time of juglone standard. Result: Macroporous resin D101 was the best one for purification of walnut green husk juglone. Its optimum absorption condition was: feeding concentration 0.114 mg/mL, pH2.0, feeding rate 1.0mL/min, then the adsorption ratio was 81.85%. The optimum desorption conditions were: elute acetone concentration 95%, pH4.0, elution rate 0.33mL/min. The desorption ratio could reach to 76.5%. Identified and analyzed by HPLC, there was no large lose and change on the juglone profiles of walnut green husk with D101 macroporous resin purification. Conclusion: D101 macroporous resin could be used to purify juglone of walnut green husk.

walnut green husk; juglone; macroporous resin; separation and purification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601020

碩士研究生(韓軍岐博士為通訊作者)。

西安市農(nóng)業(yè)公關(guān)項目(NC1505.4)

2015-07-29，改回日期：2015-09-01