趙麗，王佳，李君，朱丹實(shí)，王勝男，王勃，何余堂，馬濤，劉賀

(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州，121013)

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紅花籽水解蛋白的精制

趙麗，王佳，李君，朱丹實(shí)，王勝男，王勃，何余堂，馬濤，劉賀*

(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州，121013)

以水酶法制油工藝得到的紅花籽水解蛋白為原料，對比了DA201-C、XAD1180N、D3520三種大孔吸附樹脂對紅花籽水解蛋白的靜態(tài)吸附性能，并對其組成成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明：DA201-C樹脂對水解蛋白吸附率與解吸率最高，能有效去除糖類等雜質(zhì)；DA201-C樹脂對水解蛋白的吸附平衡時(shí)間為2 h，吸附率為48.39%，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇解吸效果最好，解吸率為90.44%。經(jīng)DA201-C樹脂純化后的水解蛋白，蛋白質(zhì)含量提高了30.10%，脂肪含量降低了91.53%，糖含量降低了95.52%，色差L*值提高了11.63%，b*值降低了20.91%。

紅花籽水解蛋白；大孔吸附樹脂；純化

紅花(CarthamustinctoriusG.Safflower)，又稱紅蘭花或草紅花，屬于菊科、紅花屬，是一年生雙子葉植物[1]，其花冠、籽實(shí)、莖葉、秸稈都可利用。紅花籽，是紅花的種子，俗稱為“白平子”，紅花籽蛋白含有許多氨基酸，且絕大多數(shù)為必需氨基酸[2]，可作為一種蛋白質(zhì)營養(yǎng)強(qiáng)化劑和食品添加劑，從而緩解植物蛋白質(zhì)資源的缺乏，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值。

水酶法是以機(jī)械和生物酶解為手段來破壞植物種子細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增加油料組織中油的流動(dòng)性，繼而分離出油脂同時(shí)制得蛋白質(zhì)[3]。水酶法反應(yīng)條件溫和，周期短，工藝簡單，制成的水解蛋白營養(yǎng)價(jià)值高，且主要以低分子質(zhì)量的短肽和游離氨基酸為主，易于人體吸收。但水酶法制得的紅花籽水解蛋白中含有較多的脂肪、糖類、灰分等雜質(zhì)，嚴(yán)重影響其色澤、貨架期等，極大地限制了在食品行業(yè)中的應(yīng)用。

蛋白質(zhì)的分離純化有溶劑法、沉淀法、超濾法、層析法等[4]。層析法中，柱填料有大孔吸附樹脂、離子交換樹脂、凝膠、硅膠、聚丙烯酰胺等[5]。大孔吸附樹脂主要通過分子間作用力如范德華引力或氫鍵等對被吸附的分子進(jìn)行吸附，吸附劑表面的親水性或疏水性決定了具有不同的吸附特性；同時(shí)其本身的多孔性結(jié)構(gòu)亦決定其具有一定的分子篩作用[6]。大孔吸附樹脂由于具有比表面積大、理化性質(zhì)穩(wěn)定、吸附量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、易再生、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)[7]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于環(huán)保、化工、醫(yī)藥和食品行業(yè)。

本試驗(yàn)以水酶法制油工藝得到的紅花籽水解蛋白為原料，對比了DA201-C、XAD1180N、D3520三種大孔吸附樹脂對紅花籽水解蛋白的靜態(tài)吸附性能，篩選出最佳大孔吸附樹脂以除去其中糖類、脂肪及色素等雜質(zhì)，以提高紅花籽水解蛋白的純度。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

紅花籽，新疆紅花緣科技有限公司；胰蛋白酶，酶活4 000 u/g，南寧龐博生物工程有限公司；牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；NaOH、酒石酸鉀鈉、無水Na2CO3，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；福林酚試劑，分析純，上海荔達(dá)生物科技有限公司；CuSO4、正丁醇、葡聚糖，分析純，天津市化學(xué)試劑三廠；石油醚，分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；蒽酮，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三氯甲烷、濃H2SO4、濃HCl，分析純，錦州古城化學(xué)試劑廠；無水乙醇，分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；DA201-C、D3520、XAD1180N大孔吸附樹脂，鄭州勤實(shí)科技有限公司，具體物理參數(shù)見表1。

表1　不同大孔吸附樹脂的物理參數(shù)

SL-205A高速多功能粉碎機(jī)，浙江省永康市松青五金廠； DZF-6050真空干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-3C精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；DK-8D電熱恒溫水浴槽，上海一恒科技有限公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；L-535R離心機(jī)，長沙湘儀儀器有限公司；JA21002精密電子天平，上海舜宇恒平科技儀器有限公司；SP-1500噴霧干燥機(jī)，上海順儀試驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHG-9055A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-2550紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；CR-400型色彩色差計(jì)，Konica Minolta。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1紅花籽水解蛋白的制備工藝

將紅花籽干燥粉碎后，與去離子水以1∶5(g∶mL)比例混勻，置于80 ℃水浴中滅酶10 min，調(diào)pH 9～12，加入156 u/g胰酶，50～55 ℃酶解3 h；80 ℃水浴滅酶10 min后，4 000 r/min離心20 min；移取上層清油和少許乳化層，得到水解蛋白液[8]；再進(jìn)行真空濃縮(比例0.6)；然后噴霧干燥，霧化頻率60 Hz，撞針間隔時(shí)間5 s，進(jìn)氣壓力0.3 MPa，進(jìn)料速度276.5 mL/h、進(jìn)口溫度175 ℃，最終制得紅花籽水解蛋白粉[9]。

1.2.2大孔吸附樹脂的預(yù)處理

將不同型號的大孔吸附樹脂先用無水乙醇浸泡24 h，使樹脂充分溶脹，然后用無水乙醇洗至220 nm處無吸收峰，再用去離子水洗凈至無乙醇味備用。接著浸泡于5倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaOH溶液中2 h，用蒸餾水洗至pH值為7；最后浸泡于5倍體積的體積分?jǐn)?shù)5%HCl溶液中浸泡2 h后，用蒸餾水洗至pH值為7，備用[10]。

1.2.3大孔吸附樹脂的篩選

(1)靜態(tài)吸附：稱取處理好的DA201-C、D3520、XAD1180N樹脂各10 g，分別加入質(zhì)量濃度8 mg/mL的紅花籽水解蛋白溶液50 mL，在25 ℃恒溫?fù)u床振蕩12 h，速度為150 r/min。測定溶液中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算各型號樹脂的吸附率及吸附量，公式如下[11]：

(2)靜態(tài)解吸：取上述已經(jīng)吸附平衡的各型號樹脂10 g過濾，加入75%乙醇40 mL作為洗脫劑，在25 ℃恒溫?fù)u床振蕩12 h，速度為150 r/min，測定溶液中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算解吸率，公式如下[11]：

1.2.4DA201-C大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附能力

稱取DA201-C大孔吸附樹脂10 g，加入質(zhì)量濃度8 mg/mL紅花籽水解蛋白溶液50 mL，在25 ℃恒溫?fù)u床振蕩12 h，速度為150 r/min，間隔1 h取樣[12]，測定溶液中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算樹脂的吸附率。

1.2.5DA201-C大孔吸附樹脂解吸劑的確定

稱取10 g DA201-C大孔吸附樹脂，加入質(zhì)量濃度8 mg/mL紅花籽水解蛋白溶液50 mL，在25 ℃恒溫?fù)u床振蕩2 h，速度為150 r/min。將吸附后的10 g DA201-C樹脂過濾，分別加入體積分?jǐn)?shù)(下同)65%、70%、75%、80%、85%、90%乙醇40 mL作為洗脫劑，在25 ℃恒溫?fù)u床振蕩12 h，速度為150 r/min，測定解附液中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算解吸率[13]。

1.2.6樣品成分分析

蛋白質(zhì)含量的測定：Folin-酚測定法[14]；粗脂肪含量的測定：索氏抽提法，參照GB/T5009.6—2003；糖含量的測定：蒽酮-硫酸法[15]；水分含量的測定：直接干燥法，參照GB/T5009.3—2003。

1.2.7色差的測定

用CR-400型色彩色差計(jì)測定色差。

1.2.8統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果與分析

2.1最佳大孔吸附樹脂的確定

不同大孔吸附樹脂對紅花籽水解蛋白的吸附性能見圖1。

圖1　不同大孔吸附樹脂對紅花籽水解蛋白的吸附性能Fig.1　Effect of different macroporous adsorption resins on adsorption performance of safflower seeds protein hydrolysate

由圖1可知，DA201-C樹脂對紅花籽水解蛋白的吸附性能最好，吸附率為48.39%，吸附量為13.9 mg/g，解吸率為85.60%，而D3520和XAD1180N樹脂對紅花籽水解蛋白的吸附率和解析率相對較低，表明DA201-C大孔吸附樹脂對紅花籽水解蛋白不僅具有較強(qiáng)的吸附能力，而且容易洗脫，適用于紅花籽水解蛋白的分離精制。

大孔樹脂的吸附性能主要取決于樹脂的極性和空間結(jié)構(gòu)(孔徑、比表面積等)。大孔吸附樹脂的吸附主要為物理吸附，吸附樹脂的比表面積決定了其飽和吸附量，隨著比表面積的增加，表面張力也在增大，吸附量提高，對吸附有利[11]。DA201-C大孔吸附樹脂的比表面積最大，所以DA201-C大孔吸附樹脂為純化紅花籽水解蛋白的最佳樹脂。這與楊萬根[16]等學(xué)者試驗(yàn)時(shí)篩選的最佳樹脂結(jié)果類似。

2.2DA201-C大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附過程

圖2是DA201-C大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

圖2　DA201-C大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線 Fig.2　Static adsorption kinetics curve of DA201-C type macroporous adsorption resin

吸附速度是樹脂吸附性能的重要參考指標(biāo)，由圖2可見，DA201-C大孔吸附樹脂對紅花籽水解蛋白的吸附屬于快速平衡型，吸附率在0～1 h較快，1 h時(shí)吸附率達(dá)到40.24%，2 h時(shí)達(dá)到吸附平衡，此時(shí)吸附率為48.39%。DA201-C大孔吸附樹脂是由偶極矩很小的單體聚合制得，不帶任何功能基，孔表的疏水性較強(qiáng)[17]。在紅花籽水酶法制油過程中，隨著酶解的進(jìn)行，紅花籽水解蛋白逐漸被水解，更多疏水性氨基酸暴露，在吸附過程中，通過疏水相互作用從水相轉(zhuǎn)移到樹脂的疏水表面上。

王旭蘋等[18]利用大孔樹脂純化酒花多酚，SP850樹脂對酒花多酚的吸附量在0～2 h內(nèi)，隨時(shí)間延長而增大，之后吸附量趨于平衡，表明SP850樹脂對酒花多酚能快速吸附平衡，與本研究結(jié)果類似。

2.3DA201-C大孔吸附樹脂解吸劑的確定

根據(jù)相似相溶原理，對非極性大孔吸附樹脂，解吸劑極性越小，其解吸能力越強(qiáng)[19]。本試驗(yàn)選用水-乙醇作為解吸劑，將已吸附了紅花籽水解蛋白達(dá)到飽和的DA201-C大孔吸附樹脂在25 ℃下分別用65%、70%、75%、80%、85%、90%乙醇解吸12 h，其解吸率見圖3。

圖3　乙醇濃度對DA201-C樹脂解吸率的影響Fig.3　Effect of different ethanol concentration on desorption rate of DA201-C type macroporous adsorption resin

從圖3可以看出，一定濃度的乙醇溶液利于樹脂解吸，隨著乙醇濃度的增加，樹脂的解吸率顯著提高，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，DA201-C樹脂解吸率最高，為90.44%；繼續(xù)增加乙醇濃度時(shí)，樹脂解吸率反而下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%時(shí)，溶液出現(xiàn)渾濁并且分層現(xiàn)象，這可能與紅花籽水解蛋白中存在一部分相對分子質(zhì)量較大的肽有關(guān)，這部分物質(zhì)在乙醇體積分?jǐn)?shù)較大時(shí)溶解性較差，使得解吸劑與吸附的紅花籽水解蛋白的相互作用受到影響，因此選擇70%乙醇為解吸劑。

過振宇等[13]在大孔吸附樹脂吸附分離家蠅抗菌肽的研究中，選用乙醇-水體系進(jìn)行洗脫，隨著乙醇濃度的增加，解吸率上升，75%乙醇溶液解吸率最高為74.79%。安曉婷等[20]利用大孔樹脂純化藍(lán)莓果渣多酚，選用了乙醇-水體系進(jìn)行洗脫時(shí)，60%乙醇解吸率達(dá)到最高。

2.4純化前后紅花籽水解蛋白組成成分分析

表2是紅花籽水解蛋白經(jīng)過DA201-C樹脂處理前后的組成成分。

表2　純化前后紅花籽水解蛋白組成成分比較　%

由表2可知，紅花籽水解蛋白在DA201-C樹脂吸附下，蛋白質(zhì)含量70.1%提高到了91.2%，純度較之前提高了30.10%；脂肪含量由5.9%降低至0.5%，降低了91.53%；糖含量由6.7%降低至0.3%，降低了95.52%?？梢?，DA201-C樹脂可顯著降低其脂肪和糖含量，提高紅花籽水解蛋白的純度。

馬寒冰等[21]采用DA201-C大孔吸附樹脂純化豆粕蛋白酶解液中的大豆多肽，純化后大豆多肽含量提高了70.35%，糖含量降低了70.80%，鹽含量降低了93.93%，說明DA201-C大孔吸附樹脂能去除豆粕蛋白酶解液中大部分無機(jī)鹽及糖類。章紹兵等[22]采用DA201-C大孔吸附樹脂純化水酶法提取的麥胚水解蛋白，可溶性總糖含量由33.72%降至10.95%，蛋白質(zhì)含量由43.82%增加到76.64%，純化效果明顯。

2.5純化前后紅花籽水解蛋白色差分析

表3是紅花籽水解蛋白經(jīng)過DA201-C樹脂處理前后的色差比較。

表3　純化前后紅花籽水解蛋白色差比較

由表3可知，經(jīng)DA201-C樹脂純化后，L*值由75.48提高到了84.26，提高了11.63%；b*值由17.98降低至14.22，降低了20.91%。純化前紅花籽水解蛋白顏色較暗，且比較偏黃；而經(jīng)DA201-C樹脂純化后的水解蛋白顏色變亮，黃色明顯變淺，脫色效果明顯。

3　結(jié)論

(1)比較了DA201-C、XAD1180N、D35203三種大孔吸附樹脂對紅花籽水解蛋白的靜態(tài)吸附性能，結(jié)果表明，DA201-C樹脂對水解蛋白吸附率與解吸率最高，因此DA201-C為純化紅花籽水解蛋白最佳的樹脂。

(2)DA201-C靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線表明，DA201-C樹脂對水解蛋白的吸附平衡時(shí)間為2 h，吸附率為48.39%；靜態(tài)解吸以70%乙醇效果最佳，解吸率為90.44%。

(3)經(jīng)DA201-C樹脂純化后的紅花籽水解蛋白，蛋白質(zhì)含量提高了30.10%，脂肪含量降低了91.53%，糖含量降低了95.52%，色差L*值提高了11.63%，b*值降低了20.91%。

(4)在后續(xù)研究中，可對紅花籽水解蛋白進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)，并對其進(jìn)行功能性質(zhì)檢測(起泡性、乳化性、溶解性和抗氧化性等)，將其生產(chǎn)成功能性飲料、咀嚼片和速溶沖劑等。

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The refinement of safflower seeds protein hydrolysates

ZHAO Li, WANG Jia, LI Jun, ZHU Dan-shi,WANG Sheng-nan,WANG Bo, HE Yutang, MA Tao, LIU He*

(School of Food Science and Technology, Bohai University; Food Safety Key Lab of Liaoning Province;National & Local Joint Engineering Research Center of Storage, Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products; Jinzhou 121013, China)

In this paper, the macroporous adsorption resins DA201-C、XAD1180N and D3520 were chosen for purifying protein hydrolysates extracted by aqueous-enzymatic extraction of safflower seeds oil. The chemical composition of purified safflower seeds protein hydrolysates was studied. The results of static adsorption performance indicated that DA201-C showed higher adsorption rate and desorption rate. The adsorption equilibrium time of protein hydrolysates was 2 h, and the adsorption ration was 48.39%. The best desorption solvent was 70%ethanol, and the desorption rate was 90.44%. After purification by DA201-C, the protein content in safflower seeds protein hydrolysates increased with 30.10%, fat content decreased 91.53%, sugar content decreased 95.52%,L*increased with 11.63%,b*decreased 20.91%.

safflower seeds protein hydrolysates; macroporous adsorption resin; purification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601018

碩士研究生(劉賀教授為通訊作者,E-mail：liuhe2069@163.com)。

遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(No.LR2014034)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.31471621)；國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(No.31201385)

2015-07-10，改回日期：2015-09-18