錢茜茜，吳燕燕，魏涯，林婉玲，戚勃，榮輝

1(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州，510300) 2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海，201306)

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海鱸魚腌制過程中產(chǎn)胺菌的分離篩選與生物學(xué)特性研究

錢茜茜1,2，吳燕燕1*，魏涯1，林婉玲1，戚勃1，榮輝1

1(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州，510300) 2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海，201306)

為探明海鱸腌制加工過程生物胺產(chǎn)生菌的菌相，通過生物胺對培養(yǎng)基進行初篩，采用高效液相色譜進行分析以，并通過VITEK 2 菌種鑒定系統(tǒng)，對海鱸腌制加工過程中的產(chǎn)胺菌進行分離鑒定，研究了溫度、pH和NaCl濃度對產(chǎn)胺量較高的菌株生長和產(chǎn)胺能力的影響。結(jié)果表明，海鱸腌制加工過程中不僅存在假單胞菌(Pseudomonas)、弧菌(Vibrio)以及葡萄球菌(Staphylococcus)等常見的產(chǎn)胺菌，而且還分離到新的產(chǎn)胺菌——麻疹孿生球菌(Gemellamorbillorum)、瓊氏不動桿菌(Acinetobacterjunii)、皮氏羅爾斯頓菌(Ralstoniapickettii)和格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)。這些生物胺產(chǎn)生菌生長和產(chǎn)胺的最適溫度是30 ℃，pH值對其影響不大，具有較高的耐鹽性，100～200 g/L的食鹽質(zhì)量濃度可以抑制產(chǎn)胺菌的生長，100 g/L的食鹽質(zhì)量濃度下可以抑制組胺的產(chǎn)生，但200 g/L的食鹽才可以抑制腐胺、尸胺和酪胺的形成。

海鱸魚；腌制加工；產(chǎn)胺菌；分離與鑒定

產(chǎn)胺菌普遍存在于海水魚的體表及活魚的鰓和內(nèi)臟中，魚體存活時并不會對其造成危害，一旦死亡，隨著防御系統(tǒng)的破壞，產(chǎn)胺菌在適宜的條件下迅速生長繁殖并產(chǎn)生大量生物胺。過量的生物胺會對人體產(chǎn)生傷害，會出現(xiàn)諸如頭痛，惡心，痙攣等一系列中毒性狀，嚴重的甚至?xí)＜吧黐1-2]。其中，組胺對人體的毒害作用是最大的，是人們對水產(chǎn)品安全問題關(guān)注的熱點[3-4]。其次是酪胺，這兩種生物胺可以讓人體產(chǎn)生明顯的中毒反應(yīng)。腐胺和尸胺本身毒性很低，但它們會加強組胺和酪胺的毒性，同時，它們還是致癌物質(zhì)亞硝胺類的前體[5-6]。微生物產(chǎn)生物胺需要具備3個條件[7]：1)必須要有充足的游離氨基酸；2)具有氨基酸脫羧酶活性的微生物；3)具有適合微生物生長及氨基酸脫羧酶合成的環(huán)境條件。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，一些假單胞菌可以產(chǎn)生腐胺、組胺和酪胺，腸細菌是腐胺、尸胺最主要的產(chǎn)生菌，有的還可以產(chǎn)生酪胺和組胺[8]。另外，一些葡萄球菌屬和弧菌屬也是發(fā)酵肉制品中的主要產(chǎn)胺菌[9]。

海鱸魚肉質(zhì)鮮嫩，潔白嫩滑，滋味醇香，營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)和多種營養(yǎng)維生素、DHA等對人體健康有益的微量元素。近年來，淡水養(yǎng)殖海鱸魚獲得成功，并且產(chǎn)量劇增，已成為今年水產(chǎn)養(yǎng)殖品種中比較出彩的一個品種。但是，目前還沒有關(guān)于海鱸魚深加工過程中產(chǎn)胺菌的研究報道。本課題組通過生物胺篩選培養(yǎng)基，并結(jié)合高效液相色譜技術(shù)對海鱸魚在傳統(tǒng)腌制加工過程中的產(chǎn)胺菌進行分離鑒定，研究溫度、pH和鹽含量對所分離菌株生長和產(chǎn)生物胺能力的影響，為水產(chǎn)品在腌制加工過程中生物胺的控制提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與設(shè)備

1.1.1原料

海鱸魚(Japanese Sea Bass)，500～600 g/條，體長30～40 cm，購自廣州華潤萬家超市。

1.1.2主要試劑

生物胺標準品：腐胺(PUT)(≥98%)；尸胺(CAD)(≥95%)；組胺(HIS)(≥99%)；酪胺(TYR)(≥99%)，均購自美國Sigma公司；乙腈(色譜純)、丹磺酰氯(Dns-Cl，≥99%)、甲醇(色譜純)購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；L-組氨酸、L-酪氨酸、L-鳥氨酸、L-賴氨酸均為分析純，購自BIOSHARP公司；其他試劑均為化學(xué)純或分析純，購于廣州粵申化學(xué)試劑廠；實驗用水均為超純水。

1.1.3培養(yǎng)基

生物胺初篩培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母浸粉5 g，L-組氨酸18.5 g，NaCl 5 g，CaCO31 g，瓊脂20 g，溴甲酚紫0.06 g，蒸餾水1000 mL。pH5.3，121 ℃高壓滅菌20 min。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉酵粉3 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL。pH 7.4±0.2,121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.4儀器設(shè)備

Agilent 1100高 效 液 相 色 譜 儀，美國Agilent 公司；立式蒸汽壓力滅菌鍋388型，上海申安醫(yī)療器械廠；VITEK 2 Compact菌種鑒定系統(tǒng)，法國生物梅里埃公司；3K30冷凍離心機，美國Sigma公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，江蘇蘇凈安泰公司；SPX-320生化培養(yǎng)箱，寧波東南儀器廠；BX53顯微鏡，日本OLYMPUS；TU-1990 紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2實驗方法

1.2.1傳統(tǒng)腌干魚工藝[10]

鮮海鱸魚→加鹽(200 g/L)腌制→浸泡脫鹽→干燥成品

取海鱸魚腌制加工過程中4個階段的產(chǎn)品作為樣品，每個階段隨機抽取2條魚，裝入無菌自封袋中，于4 ℃保存。這4個加工階段分別以A、B、C、D表示。

1.2.2產(chǎn)胺菌株的初步分離與純化

無菌剪取10 g魚肉，剪碎后置于裝有90 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，混合均勻，用無菌生理鹽水依次稀釋為102、103、104倍，取0.1 mL上述不同濃度的稀釋液涂布于生物胺初篩培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落。挑出各培養(yǎng)基上的藍色或紫色菌落，在初篩培養(yǎng)基上純化2次以上，取單菌落保存菌種。

1.2.3產(chǎn)胺菌生物胺檢測[11-12]

將純化后的細菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，取1 mL菌懸液接種于9 mL添加了0.1%氨基酸(組氨酸、酪氨酸、賴氨酸、鳥氨酸)的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃,140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)2 d后，取培養(yǎng)液1 mL，加入1 mL 5%的三氯乙酸，用冷凍離心機于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液，加入200 L 2 mol/L NaOH 溶液使之成堿性，再加入300 μL飽和NaHCO3緩沖溶液進行緩沖，然后加入丹磺酰氯(10 mg/mL 溶于丙酮)2 mL，轉(zhuǎn)移至5 mL的容量瓶中，于40 ℃恒溫水浴鍋中避光反應(yīng)45 min后，再加100 L氨的體積分數(shù)為25%的氨水于暗處靜置30 min，終止衍生反應(yīng)，最后用乙腈定容至5 mL，衍生處理后用0.22 μm濾膜過濾，用高效液相色譜測定生物胺含量。通過與生物胺標準品的液相色譜圖進行對照，最終確定樣品中的生物胺成分。色譜條件如下：色譜柱：C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；柱溫40℃；進樣量10 μL；流速1 mL/min；熒光激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長為520 nm。流動相A為0.1 mol/L乙酸銨溶液，B為甲醇，C為乙腈，D為超純水。

1.2.4產(chǎn)胺菌的鑒定

挑取產(chǎn)胺菌進行革蘭氏染色實驗，確定細菌鑒定卡的選擇。然后將其接種于3 mL無菌鹽水(4.5 g/L NaCl，pH4.5～7.0)中，混勻，用VITEK 2比濁儀配制相當(dāng)于0.80～0.10 麥氏單位的菌懸液，使用VITEK 2 全自動微生物分析系統(tǒng)進行菌種鑒定[13]。

1.2.5溫度對產(chǎn)胺菌生長和產(chǎn)生物胺的影響

取1 mL產(chǎn)胺菌的菌懸液接種至9 mL添加氨基酸的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，分成6組分別于0，4，20，25，30，35 ℃下靜置培養(yǎng)24 h，每個溫度均設(shè)置空白對照；取一定量的菌液，用紫外分光光度計測定其在605 nm處的吸光值(OD值)；另取1 mL通過高效液相色譜測定生物胺含量。生物胺含量的測定參照1.2.3中的方法。

1.2.6pH對產(chǎn)胺菌生長和產(chǎn)生物胺的影響

取1 mL產(chǎn)胺菌的菌懸液接種至9 mL pH分別為4，5，6，7，8含氨基酸的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，每個pH值均設(shè)置空白對照，30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h；采用1.2.5中的方法測定菌液的OD值和生物胺含量。

1.2.7NaCl質(zhì)量濃度對產(chǎn)胺菌生長和產(chǎn)生物胺的影響

取1 mL產(chǎn)胺菌的菌懸液接種至9mL NaCl質(zhì)量濃度分別為5，50，100，150，200 g/L含氨基酸的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，每個NaCl質(zhì)量濃度均設(shè)置空白對照，30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h；采用1.2.4中的方法測定菌液OD值和生物胺含量。

1.2.8數(shù)據(jù)處理方法

所有數(shù)據(jù)采用Excel與JMP軟件進行處理和分析，其中顯著性分析采用Tukey法進行兩兩比較，以P<0.05 說明變化顯著。

2　結(jié)果與討論

2.1產(chǎn)胺菌的初步分離與純化

通過初步的分離篩選共獲得不同菌落形態(tài)的細菌14株，其中樣品A獲得4株，B獲得2株，C獲得6株，D獲得2株,將初步篩選到的菌株在生物胺初篩培養(yǎng)上純化，均能使培養(yǎng)基變成藍紫色，按照分離的時間順序分別編號為A1～A4，B1～B2，C1～C6，D1～D2。

2.2產(chǎn)胺菌的生物胺檢測及菌種鑒定

如圖1所示，腐胺、尸胺、組胺和酪胺4種生物胺的分離效果良好。

PUT-腐胺；CAD-尸胺；HIS-組胺；TYR-酪胺圖1　生物胺樣品圖譜Fig.1　HPLC chromatographic profiles of biogenic amines

產(chǎn)胺菌的生物胺含量及菌種鑒定結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，樣品C中產(chǎn)胺菌的檢出率最高(6株)，并且大多數(shù)具有較強的產(chǎn)生物胺能力。而樣品B和D產(chǎn)胺菌的檢出率最低。原因是腌制過程中隨著食鹽的不斷滲入，高濃度的食鹽抑制了微生物的生長，漂洗階段魚肉中食鹽濃度迅速下降，魚肉暴露于空氣中且肌肉水分含量較高而易于產(chǎn)胺菌生長。到了干燥階段，魚肉中水分含量的降低導(dǎo)致水分活度下降，抑制了細菌的生長。

通過對培養(yǎng)液中細菌代謝物的檢測，發(fā)現(xiàn)所分離的各產(chǎn)胺菌產(chǎn)生物胺種類和濃度存在很大差異，LOPER-SABATER 等[14]在研究金槍魚中組胺產(chǎn)生菌時也發(fā)現(xiàn)魚體中組胺的產(chǎn)生及產(chǎn)量跟魚體內(nèi)組胺產(chǎn)生菌的種屬與數(shù)量有密切關(guān)系。產(chǎn)胺菌的種類有很多，發(fā)酵魚制品中主要有弧菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、乳酸菌中的乳桿菌屬等[15]，這些菌種都能夠產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，本實驗不僅分離到了假單胞菌屬，葡萄球菌屬和弧菌屬，而且還分離出瓊氏不動桿菌、麻疹孿生球菌、皮氏羅爾斯頓菌等新的產(chǎn)胺菌。分離的弧菌均具有較強的產(chǎn)尸胺能力，但不產(chǎn)組胺。周衛(wèi)楓等[16]用TCBS培養(yǎng)基和組胺選擇性培養(yǎng)基來篩選鯖魚魚肉中產(chǎn)組胺的弧菌，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)分離出來的弧菌在組胺選擇性培養(yǎng)基中呈陰性。其他產(chǎn)胺菌均可同時產(chǎn)生4種生物胺，但含量各不一樣。格氏乳球菌C5和C6分別具有最高的產(chǎn)腐胺量和產(chǎn)尸胺量，沃氏葡萄球菌C1的產(chǎn)組胺量最高，溶血葡萄球菌D1的產(chǎn)酪胺量最高，因此繼續(xù)對C5、C6、C1、和D1這4株菌進行分析，探究溫度、pH、食鹽質(zhì)量濃度對其生長和產(chǎn)胺量的影響。

表1　14株細菌的生物胺產(chǎn)生情況及鑒定結(jié)果

注：ND表示未檢出，同一列相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2.3溫度對產(chǎn)胺菌生長和產(chǎn)生物胺的影響

通常情況下，25～35 ℃的溫度范圍對產(chǎn)胺菌的生長最有利，且在該溫度范圍內(nèi)產(chǎn)胺量也最大[17]，溫度低于4℃時，產(chǎn)胺菌的生長和產(chǎn)胺能力均會受到抑制[18]。這與本研究的結(jié)論一致，由圖2可以看出，20～35 ℃溫度范圍最適合4株產(chǎn)胺菌的生長，在30 ℃下，4株產(chǎn)胺菌的OD值均達到最大且均有最大的產(chǎn)生物胺量。低溫對產(chǎn)胺菌的生長和產(chǎn)胺量均有明顯的抑制作用，溫度低至4℃時，產(chǎn)胺菌株仍能生長，但產(chǎn)胺量明顯減少。當(dāng)溫度低至0 ℃時，4株產(chǎn)胺菌株的生物胺能力明顯被抑制，幾乎不產(chǎn)生物胺。但在20～30 ℃范圍內(nèi)，產(chǎn)胺菌的生長和產(chǎn)胺量均隨著溫度的上升而增加，之后，隨溫度的上升而減少。由此可見，30 ℃對產(chǎn)胺菌的生長最有利，同時，在該溫度下，4株產(chǎn)胺菌均有最大產(chǎn)胺量。因此，盡量避免將海鱸魚暴露在30 ℃左右的環(huán)境中，另外，低溫貯藏也可以抑制生物胺的產(chǎn)生。

圖2　溫度對菌株生長和產(chǎn)生物胺的影響Fig.2　Effect of the temperature on growth and biogenic amine production of strains (C1菌株的生物胺含量指組胺含量C6菌株的生物胺含量指腐胺，C5指尸胺，D1指酪胺。圖3和圖4與此相同。)

2.4pH對產(chǎn)胺菌生長和產(chǎn)生物胺的影響

由圖3可以看出，在6～8的pH范圍內(nèi)，4株產(chǎn)胺菌均有較大吸光度值，且在pH6時吸光度值均達到最大，同時，沃氏葡萄球菌在pH6時也達到最大產(chǎn)組胺量，但是，其他3株產(chǎn)胺菌的產(chǎn)生物胺含量受pH變化的影響很小。在pH4～5范圍內(nèi)，吸光度值基本沒有變化，說明低pH值可以抑制產(chǎn)胺菌的生長?？偟膩碚f，pH變化對產(chǎn)胺菌生長和產(chǎn)組胺能力有一定的影響，但是對其產(chǎn)腐胺、尸胺和酪胺能力的影響并不明顯。

圖3　pH對菌株生長和產(chǎn)生物胺的影響Fig.3　Effect of the pH on growth and biogenic amine production of strains

2.5食鹽濃度對產(chǎn)胺菌生長和產(chǎn)生物胺的影響

由圖4可以看出，食鹽質(zhì)量濃度<50 g/L，產(chǎn)胺菌均能正常生長，但隨著食鹽濃度增大，對產(chǎn)胺菌的抑制作用也越明顯。在100 g/L食鹽質(zhì)量濃度下，沃氏葡萄球菌雖然能緩慢生長，但其產(chǎn)組胺能力明顯被抑制，幾乎不產(chǎn)組胺。溶血葡萄球菌耐鹽性最強，在200 g/L的食鹽質(zhì)量濃度下仍能生長，但產(chǎn)酪胺量為0，同時，在該食鹽濃度下腐胺和尸胺含量也為0。由以上結(jié)果可知，100～200 g/L的食鹽質(zhì)量濃度可以抑制產(chǎn)胺菌的生長，100 g/L食鹽濃度可以抑制組胺的產(chǎn)生，但是，200 g/L的食鹽質(zhì)量濃度才可以抑制腐胺、尸胺和酪胺的形成。據(jù)資料顯示，當(dāng)培養(yǎng)基中的食鹽濃度從0增加到60 g/L時，保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)的數(shù)量和產(chǎn)生物胺能力大大降低[19]。LATORRE-MORATALLA 等[20]發(fā)現(xiàn)食鹽質(zhì)量濃度在35～55 g/L能夠抑制組胺的積累。而本研究中得出100 g/L以上的食鹽濃度才可以抑制產(chǎn)胺菌可能是由于這些產(chǎn)胺菌本身來源于傳統(tǒng)腌制海鱸，自身的耐鹽性比較強。

圖4　食鹽質(zhì)量濃度對菌株生長和產(chǎn)生物胺的影響Fig.4　Effect of the salt concentration on growth and biogenic amine production of strains

3　結(jié)論

(1)本研究利用生物胺初篩培養(yǎng)基，并結(jié)合高效液相色譜技術(shù)，從海鱸魚傳統(tǒng)腌制加工過程中不僅分離得到假單胞菌、弧菌以及葡萄球菌等常見的產(chǎn)胺菌，而且還分離到了麻疹孿生球菌、瓊氏不動桿菌、皮氏羅爾斯頓菌和格氏乳球菌這些新的產(chǎn)胺菌。

(2)溫度和鹽度的變化對產(chǎn)胺菌的生長和產(chǎn)生物胺的影響較大，pH變化對其影響較小。低溫對產(chǎn)胺菌的生長和產(chǎn)胺能力均有明顯抑制作用，30 ℃是其生物胺產(chǎn)生菌生長和產(chǎn)胺的最適溫度。100～200 g/L的食鹽含量對產(chǎn)胺菌株也有明顯的抑制作用，100 g/L的食鹽含量可以抑制組胺的產(chǎn)生，200 g/L的食鹽含量才可以抑制腐胺、尸胺和酪胺的形成。所以高鹽度對生物胺的形成有一定的控制作用。

(3)分離到的產(chǎn)胺菌在低溫環(huán)境下生長緩慢，并且具有較高的耐鹽性，因此，可以采用低溫和高食鹽濃度來控制生物胺的產(chǎn)生。大量研究報道，細菌對生物胺的產(chǎn)生非常重要，研究生物胺菌的生物學(xué)特性，從而抑制這類細菌的生長，是減少腌制水產(chǎn)品中生物胺含量一種有效的方法。

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Study on isolation and biological characteristics of biogenic amine-forming bacteria during the pickled processing of Japanese Sea Bass

QIAN Qian-qian1,2,WU Yan-yan1*,WEI Ya1,LIU Wan-ling1,QI Bo1,RONG Hui1

1(South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Key Lab of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture,Guangzhou 510300,China) 2(Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

In order to explore the bacterial analysis during the pickled processing of Japanese Sea Bass, biogenic amine-forming bacteria during that processing were isolated and identified by primary screening with biogenic amine-forming bacteria isolation agar, high performance liquid chromatography analysis and VITEK 2 strain identification system. Effects of temperature, pH and salt concentration on growth and biogenic amine production of strains producing higher biogenic amine were studied. The results showed that not only existed common biogenic amine-forming bacteria such asPseudomonas,VibrioandStaphylococcuswere existed in the Japanese Sea Bass during the pickled processing, but also new strains includingGemellamorbillorum,Acinetobacterjunii,RalstoniapickettiiandLactococcusgarvieaewere isolated. The optimal growing temperature for production of biogenic amine in biogenic amine-forming bacteria were 30 ℃. The effect of pH was little on biogenic amine production of strains. These strains could tolerate relatively high salt concentration. 100～200 g/L salt concentration could inhibit the growth of biogenic amine-forming bacteria. 100 g/L salt concentration could inhibit the production of histamine. Furthermore, 200 g/L salt concentration could inhibit the production of putrescine, cadaverine, tyramine.

Japanese Sea Bass; pickled processing; biogenic amine-forming bacteria; isolation and identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601013

碩士研究生(吳燕燕博士為通訊作者,E-mail: wuyygd@163.com)。

廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(A201501C02);國家自然科學(xué)基金項目(31371800);中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所)資助項目(2015YD02)

2015-07-22，改回日期：2015-09-14