李全霞，崔亞娟,2*，陳兆天，張績(jī)覓，徐佳佳，劉玉峰

1(北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所 分析檢測(cè)中心，北京，100069)　2(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京，100193)

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利用冷凍保藏菌種測(cè)定食品中的水溶性維生素

李全霞1，崔亞娟1,2*，陳兆天1，張績(jī)覓1，徐佳佳1，劉玉峰1

1(北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所 分析檢測(cè)中心，北京，100069)2(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京，100193)

建立了一種簡(jiǎn)單的甘油保護(hù)的冷凍保藏菌種的制備方法，通過(guò)測(cè)定冷凍菌種的活菌數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線，研究冷凍菌種的穩(wěn)定性和重復(fù)性。結(jié)果顯示，-20 ℃下保藏8個(gè)月時(shí)，冷凍菌種保藏液中的活菌數(shù)仍達(dá)到107CFU/mL以上，利用冷凍菌種測(cè)定煙酸、泛酸、葉酸和生物素的標(biāo)準(zhǔn)曲線與傳統(tǒng)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線高度一致，利用冷凍保藏的菌種和新鮮菌種同時(shí)進(jìn)行6種樣品的分析，結(jié)果沒(méi)有顯著差異。冷凍菌種表現(xiàn)穩(wěn)定，使用方便，快捷，適合作為菌種來(lái)源。

微生物法；煙酸；泛酸；葉酸；生物素

維生素是生物體內(nèi)具有生理活性的物質(zhì)，是一種食物或者膳食營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的真實(shí)反映。食物中某些維生素的生物活性可以作為食物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的一部分。測(cè)定生物活性的最直接手段就是利用基于生理功能的生物分析方法。這也是維生素被發(fā)現(xiàn)的原因，至今我們也還在利用此方法去估量其他具有潛在治療益處的維生素類似物[1]。隨著儀器分析方法的迅猛發(fā)展，一些新的測(cè)定維生素的方法不斷涌現(xiàn)，如高效液相-柱后衍生熒光法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[2-5]。微生物分析維生素方法因?yàn)槠涓叩撵`敏度和可靠性，測(cè)定結(jié)果可涵蓋食物中添加和天然兩種類型，從1940年代一直沿用至今。

由于微生物對(duì)維生素的特異活性，微生物法很長(zhǎng)時(shí)間被喻為“黃金標(biāo)準(zhǔn)”方法，所有的B族維生素都能夠利用微生物法進(jìn)行測(cè)定[6]。所使用的分析菌種都來(lái)自于美國(guó)典型培養(yǎng)物培養(yǎng)中心(American Type Culture Collection,ATCC)。目前，國(guó)標(biāo)方法中除了維生素B6使用酵母菌檢測(cè)外，其他測(cè)定方法所使用的菌種都屬于乳酸桿菌。

水溶性維生素一般是作為輔酶或輔基參與到機(jī)體的基礎(chǔ)代謝反應(yīng)中，是生物體生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)素。自然界中某些細(xì)菌或真菌也需要維生素維持生長(zhǎng)，但本身并不能合成維生素，屬于營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株，采用微生物分析維生素的原理就來(lái)源于此。在使用微生物進(jìn)行測(cè)定過(guò)程中，保持營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的代謝活性對(duì)維生素的定量至關(guān)重要。傳統(tǒng)的連續(xù)傳代保存方法容易引入基因突變或者雜菌，培養(yǎng)基的理化性質(zhì)及微生物代謝產(chǎn)物等原因還會(huì)導(dǎo)致微生物性狀發(fā)生改變[7]。因此應(yīng)該與其他能夠長(zhǎng)期保存菌株的方法相結(jié)合防止菌種衰退。1980年，GROSSOWLCZ等首先利用甘油保護(hù)的菌種進(jìn)行血液中葉酸分析[8]。1982年，Willon和Horne對(duì)冷凍菌種的制備方法進(jìn)行了改良，將其用于大鼠組織部分中葉酸的測(cè)定分析[9]。2005年，美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(Association of Official Analytical Chemists,AOAC)將冷凍菌種寫入官方分析方法2004.05中，用于谷物中葉酸的測(cè)定[10]。2007年，BUI和SMALL利用冷凍菌種測(cè)定面條中的葉酸[11]。2010年，Ortiz-Escobar等參照Grossowlcz的制備方法重新改良用來(lái)測(cè)定墨西哥仙人掌頸中的葉酸[12]。2011年，徐文婕等將甘油冷凍保存乳酸桿菌與96孔酶標(biāo)相結(jié)合檢測(cè)血漿葉酸[13]。筆者參照WILLON和HORNE的菌種制備方法，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的條件，建立了制備測(cè)定煙酸、泛酸、葉酸和生物素的冷凍保藏菌種方法，并應(yīng)用于日常的檢測(cè)分析中。經(jīng)過(guò)8個(gè)多月的對(duì)比分析，該冷凍菌種表現(xiàn)穩(wěn)定，使用方便，快捷。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

菌種：植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ATCC 8014，鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)ATCC 7469。

乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；煙酸測(cè)定培養(yǎng)基、泛酸測(cè)定培養(yǎng)基、生物素測(cè)定培養(yǎng)基、葉酸測(cè)定培養(yǎng)基，美國(guó)Difco公司。雞胰酶，上海物競(jìng)化工公司；淀粉酶，美國(guó)Sigma公司；蛋白酶，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；煙酸(≥99.9%)、泛酸鈣(≥99.9%)、生物素(≥98.0%)、葉酸(≥98.0%)，美國(guó)Sigma公司；抗壞血酸、甘油、氫氧化鈉、硫酸、乙醇，分析純。

1.2儀器與設(shè)備

BPMJ-250F恒溫培養(yǎng)箱；日立U-3900H紫外分光光度計(jì)；TOMY SX-700高壓蒸汽滅菌鍋；NU-425-400E生物安全柜；Sartorius千分之一和萬(wàn)分之一電子天平；BCD-235新飛冰箱；BCD-130HTB海爾超低溫保存箱。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1)煙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取20.0 mg煙酸，用25%乙醇溶液溶解并定容至100 mL[14]。

2)泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取21.25 mg泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品，溶于50 mL蒸餾水中，加入1 mL 0.2 mol/L乙酸，10 mL 0.2 mol/L醋酸鈉，然后用蒸餾水定容至100 mL加3滴甲苯，于4 ℃冰箱保存[15]。

3)生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取20.0 mg生物素50%乙醇溶液溶解并定容至100 mL[16]。

4)葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取20.0 mg葉酸，用0.01 mol/L氫氧化鈉乙醇(1∶4)溶液溶解并定容至100 mL[17]。

1.3.2培養(yǎng)基的配制

1)乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基：按照培養(yǎng)基說(shuō)明進(jìn)行配制。

2)乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：按照乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基說(shuō)明進(jìn)行配制，加入1%瓊脂。

3)測(cè)定用培養(yǎng)基：按照培養(yǎng)基說(shuō)明配制。

4)冷凍保藏菌種培養(yǎng)液：測(cè)定培養(yǎng)基中加入相應(yīng)含量的維生素工作溶液，使得相應(yīng)的培養(yǎng)液中維生素濃度分別為煙酸、泛酸20 ng/mL葉酸、生物素0.2 ng/mL。

1.3.3甘油溶液的配制

取甘油80 mL加入20 mL蒸餾水，混勻，121℃滅菌30 min。

1.3.4菌種的活化

將純菌種植物乳桿菌和干酪乳桿菌穿刺接種于柱狀乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基中，在36℃±1℃培養(yǎng)19～22 h。培養(yǎng)好的乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基試管的培養(yǎng)物作為儲(chǔ)備菌種。

1.3.5冷凍保藏菌種的制備

接種1環(huán)儲(chǔ)備菌種瓊脂培養(yǎng)物于5 mL乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，在36℃±1℃培養(yǎng)19～22 h；取0.5 mL種子培養(yǎng)液接入50 mL冷凍保藏菌種培養(yǎng)液中，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)19～22 h。立即取出放入冰浴中。在無(wú)菌環(huán)境中取1 mL培養(yǎng)液于滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL 甘油，混勻，放入-20 ℃和-70 ℃冰箱保存。

1.3.6接種量試驗(yàn)

冷凍菌種保藏1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行接種量的試驗(yàn)，分別按照0.25%，0.5%，1%，2%，4%，8%體積分?jǐn)?shù)的接種量接種于空白試管和煙酸、泛酸20 ng/mL，葉酸、生物素0.2 ng/mL的試管中，在36℃±1℃培養(yǎng)19～24 h，測(cè)定吸光值，比較空白管和標(biāo)準(zhǔn)管的差異，判斷最佳接種量。

1.3.7冷凍菌種中活菌的計(jì)數(shù)

每月取冷凍菌種溶液，稀釋到合適梯度后利用乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)36 h，計(jì)數(shù)，計(jì)算每毫升菌液中的活菌落數(shù)。

1.3.8標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取煙酸、泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.00 mL稀釋至質(zhì)量濃度為20 ng/mL，6支試管加2.50 mL測(cè)定用培養(yǎng)基，再加0～50 ng標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，一式3份；取葉酸、生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.00 mL稀釋至質(zhì)量濃度為0.2 ng/mL，6支試管加2.50 mL測(cè)定用培養(yǎng)基，再加0～0.5 ng標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，一式3份。

以最佳接種量進(jìn)行接種，在36℃±1℃培養(yǎng)19～24 h。培養(yǎng)后的標(biāo)準(zhǔn)管從恒溫箱中取出后，用分光光度計(jì)于550 nm波長(zhǎng)下，以標(biāo)準(zhǔn)管的零管調(diào)零，測(cè)定各管的吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)所含的維生素質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.9樣品測(cè)定及分析

樣品處理和測(cè)定分析按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的進(jìn)行[14-20]。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)P<0.05為具有顯著差異。

2　結(jié)果與分析

2.1最佳接種量

以未接種的空白試管為對(duì)照，測(cè)定各個(gè)接種量下的空白試管和標(biāo)準(zhǔn)試管的吸光值(見(jiàn)表1)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，隨著接種量的增加，空白試管和標(biāo)準(zhǔn)試管的吸光值增加，但是在接種量小于1%時(shí)，這種變化沒(méi)有顯著差異，接種量高于1%時(shí)，空白試管的吸光值變大，因此0.25%，0.5%，1%的接種量最合適，為保險(xiǎn)起見(jiàn)，選0.5%做為最佳接種量。

表1　不同接種量下煙酸、泛酸、葉酸、生物素空白管和標(biāo)準(zhǔn)管的吸光值

2.2冷凍時(shí)間對(duì)活菌數(shù)的影響

圖1顯示，隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)不斷減少，測(cè)定煙酸的冷凍菌種表現(xiàn)得最為明顯，它在一開(kāi)始急劇下降，2個(gè)月后穩(wěn)定存在。-20 ℃冷凍保藏8個(gè)月后，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的活菌數(shù)仍能達(dá)到107CFU/mL以上，但明顯的是，植物乳桿菌的活菌數(shù)從開(kāi)始就比鼠李糖乳桿菌多。我們也同時(shí)做了測(cè)定煙酸冷凍菌種的-70 ℃和-20 ℃凍存的比較，8個(gè)月時(shí)，-70 ℃保存的冷凍菌種活菌數(shù)仍能達(dá)到9×108CFU/mL，而-20 ℃保存的冷凍菌種活菌數(shù)只剩下1.8×108CFU/mL。由于-70 ℃冰箱并不常用，有條件的實(shí)驗(yàn)室可以優(yōu)先選擇-70 ℃保存。

圖1　冷凍菌種8個(gè)月內(nèi)的活菌數(shù)變化Fig.1　Change of CFU incryopreserved cultures during eight months

2.3不同時(shí)間下冷凍菌種標(biāo)準(zhǔn)曲線的變化

利用同樣的冷凍菌種，在8個(gè)月內(nèi)進(jìn)行了8次標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定分析(見(jiàn)圖2)。結(jié)果顯示，冷凍菌種對(duì)煙酸、泛酸、葉酸和生物素有高度的特異性與依賴性，隨著標(biāo)準(zhǔn)濃度的增加，試管中的溶液渾濁度隨之增加，但在高點(diǎn)時(shí)增加趨勢(shì)減少。冷凍菌種具有和新鮮菌種同樣的靈敏度。并且，在8個(gè)月內(nèi)，冷凍菌種具有高的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

圖2　利用冷凍菌種進(jìn)行微生物法分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線在8個(gè)月內(nèi)的變化Fig.2　Change of standard curve for microbiological assay with cryopreserved cultures in eight months

2.4冷凍菌種和新鮮菌種標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比

分別取冷凍菌種和新鮮菌種的8次標(biāo)準(zhǔn)曲線各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)吸光值的平均值做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行比較。新鮮菌種與冷凍菌種的標(biāo)準(zhǔn)曲線有很高的相似性，二者泛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線是重疊的，煙酸和生物素的標(biāo)準(zhǔn)曲線也高度一致，葉酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線在高點(diǎn)時(shí)，冷凍菌種的生長(zhǎng)稍有點(diǎn)低。

圖3　冷凍菌種和新鮮菌種標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比Fig.3　Comparison of standard curve with cryopreserved and fresh cultures

2.5樣品測(cè)定結(jié)果

如表2所示，利用冷凍保藏的菌種和傳代培養(yǎng)的新鮮菌種同時(shí)進(jìn)行6種樣品的分析，重復(fù)測(cè)定6次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用χ±s表示，t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)，結(jié)果表明，采用兩種方法測(cè)定的6種樣品含量相一致，沒(méi)有顯著的差異(P>0.05)。

3　討論

用同樣的方法制備測(cè)定維生素B12的萊士曼氏乳桿菌的冷凍保藏培養(yǎng)液，但是發(fā)現(xiàn)冷凍后的活菌數(shù)很低，這種方法不適合于萊士曼氏乳桿菌。在GROSSOWLCZ和ORTIZ-ESCOBAR二者的方法中，冷凍菌種保藏液使用之前，要用生理鹽水洗去其中殘余的維生素。我們測(cè)定了保藏液中的維生素含量，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)完全消耗掉了，因此不必清洗，直接使用即可。

采用微生物分析法測(cè)定維生素至今已有60年左右的歷史，因?yàn)樗某杀镜?，可操作性?qiáng)，靈敏度高，在我國(guó)現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中依然用來(lái)測(cè)定嬰幼兒食品和乳品中的生物素、泛酸、葉酸、維生素B12、煙酸以及食品中的維生素B6、維生素B12、煙酸、泛酸、葉酸。國(guó)標(biāo)中規(guī)定的接種方式依然是傳統(tǒng)的連續(xù)傳代接種，測(cè)定周期一般是4～5 d，而直接低溫保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基中，使得菌種可以快速利用，大大節(jié)省測(cè)定周期，2～3 d就可以得到結(jié)果。由于冷凍保護(hù)的菌種在-20 ℃可以穩(wěn)定至少8個(gè)月以上，這樣方便實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化分析，可以簡(jiǎn)化分析程序，不會(huì)因?yàn)榫N活力問(wèn)題引起測(cè)定結(jié)果的差異性。冷凍保護(hù)的菌種制備技術(shù)簡(jiǎn)單，在短時(shí)間內(nèi)能夠制備豐富的菌種，可以利用8個(gè)月以上。最重要的是，一批冷凍菌種的生長(zhǎng)曲線在8個(gè)月內(nèi)比較穩(wěn)定，而新鮮菌種在轉(zhuǎn)接過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)未知的一些問(wèn)題，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線不穩(wěn)定。

表2　利用冷凍菌種和新鮮菌種測(cè)定樣品的結(jié)果

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Use of cryopreserved cultures for microbiological assay of soluble-vitamins in food

LI Quan-xia1，CUI Ya-juan1,2*，CHEN Zhao-tian1，ZHANG Ji-mi1，XU Jia-jia1，LIU Yu-feng1

1(Analysis Laboratory of Beijing Nutrition Resources Institute, Beijing 100069, China) 2(College of Agriculture and Biotechnology of China Agriculture University,Beijing 100193,China)

A simple procedure for preparing glycerol-cryopreserved cultures has been developed. The stability and repeatability of cryopreserved cultures have been studied by measuring the standard curve and colony-forming units. The results revealed that there were more than 107CFU/mL in cryopreserved cultures stored at -20℃ for 8 months. Standard curves of nicotinic acid, pantothenic acid, folic acid and biotin determined using cryopreserved cultures were highly consistent with those from traditional method. There were no significant differences among the results of six samples that determined with cryopreserved and fresh cultures at the same time. Cryopreserved cultures were stable, convenient, fast, and suitable ready source of inoculum.

microbiological method;nicotinic acid;pantothenic acid;folic acid;biotin

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601011

碩士、助理研究員(崔亞娟副研究員為通訊作者,E-mail：cuiyj66@163.com)。

北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目(Z141100002614013)

2015-03-02，改回日期：2015-06-10