查鑫華，鄭璞*，陳鵬程，魏哲

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214112) 2(山東金洋藥業(yè)有限公司，山東 淄博，255100)

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以右旋糖酐發(fā)酵廢液為原料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸

查鑫華1，鄭璞1*，陳鵬程1，魏哲2

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214112) 2(山東金洋藥業(yè)有限公司，山東 淄博，255100)

以右旋糖酐發(fā)酵廢液為原料利用琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，在比較不同糖濃度廢液對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸影響的基礎(chǔ)上，通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出對(duì)搖瓶發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的主要影響因素 NaH2PO4·2H2O，并用單因素試驗(yàn)確定其最適質(zhì)量濃度為 2.8 g/L。在3 L發(fā)酵罐上進(jìn)行分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵，以 60 g/L 初糖質(zhì)量濃度的右旋糖酐發(fā)酵廢液為碳源，分批發(fā)酵 46.8 h產(chǎn)丁二酸 40.5 g/L；采用30 g/L葡萄糖為起始發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，后續(xù)補(bǔ)加濃縮右旋糖酐發(fā)酵廢液的方式進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，丁二酸質(zhì)量濃度達(dá)到 55.0 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度 1 g/(L·h)，糖酸轉(zhuǎn)化率為 0.83 g/g。結(jié)果表明：以右旋糖酐發(fā)酵廢液為原料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，為解決廢液處理排放提供了新途徑，具有良好的應(yīng)用前景。

右旋糖酐發(fā)酵廢液；培養(yǎng)基優(yōu)化；補(bǔ)料分批發(fā)酵；丁二酸

右旋糖酐發(fā)酵廢液 (WFBD) 是生物法生產(chǎn)右旋糖酐過(guò)程中提取產(chǎn)物之后剩下的發(fā)酵液，一般被作為工業(yè)廢水進(jìn)行環(huán)保處理，但給企業(yè)增加額外的環(huán)保處理費(fèi)用。右旋糖酐是一種高分子葡萄糖聚合物，是最早使用和得到公認(rèn)的一種優(yōu)良血漿代用品，在醫(yī)藥、食品和石油等方面都有著廣泛的應(yīng)用[1]。右旋糖酐也是世界上第一個(gè)工業(yè)化生產(chǎn)的微生物多糖，高濃度蔗糖通過(guò)腸膜明串珠菌發(fā)酵，生成高分子葡萄糖聚合物，再經(jīng)過(guò)精制處理得到不同分子量的右旋糖酐產(chǎn)品[2]。右旋糖酐發(fā)酵廢液中存在較高濃度的果糖和少量葡萄糖，人們嘗試了從發(fā)酵廢液中提取果糖[3]、發(fā)酵生產(chǎn)飼用復(fù)合酶制劑[4]、發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸[5]等方面的研究。

丁二酸是一種重要的 C4平臺(tái)化合物，目前已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[6]，在將來(lái)還可作為生產(chǎn)可降解塑料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚酯多元醇、增塑劑、聚氨酯和原材料型化學(xué)產(chǎn)品 1,4-丁二醇的基礎(chǔ)材料，應(yīng)用前景十分廣闊[7-8]。琥珀酸放線桿菌具有利用多種碳源(葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖等)發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的特性[9]。本文首次報(bào)道了利用右旋糖酐發(fā)酵廢液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，涉及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化、補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝，以期為解決右旋糖酐發(fā)酵廢液的處理提供新途徑，實(shí)現(xiàn)其廢物利用的價(jià)值，同時(shí)也能進(jìn)一步降低生物基丁二酸的生產(chǎn)成本。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes) CCTCC M2012036，由本實(shí)驗(yàn)室自主篩選誘變得到，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)[10]。

1.1.2原料

右旋糖酐發(fā)酵廢液由山東金洋藥業(yè)有限公司提供，原廢液濃縮4倍后葡萄糖 14.9±0.3 g/L，果糖 92.7±0.5 g/L。

1.1.3培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基參見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。

發(fā)酵培養(yǎng)基(除碳源外)參見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。

1.2方法

1.2.1發(fā)酵方法

搖瓶發(fā)酵：以右旋糖酐發(fā)酵廢液為母液，補(bǔ)加發(fā)酵培養(yǎng)基中其他成分，配制總還原糖(葡萄糖+果糖)質(zhì)量濃度60 g/L 的發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝體積25 mL，121℃滅菌20 min，接種量4%(體積分?jǐn)?shù))，38 ℃下CO2環(huán)境中厭氧培養(yǎng)48 h，分析發(fā)酵液中糖及有機(jī)酸含量。

不同比例葡萄糖與果糖的WFBD組和模擬組的對(duì)照試驗(yàn)：WFBD組以右旋糖酐發(fā)酵廢液為母液，添加外源葡萄糖配制發(fā)酵培養(yǎng)基，果糖(g/L)/葡萄糖(g/L)分別設(shè)置50∶10、45∶15、40∶20、35∶25和30∶30 五個(gè)比例梯度；模擬組中完全不使用右旋糖酐發(fā)酵廢液，以純果糖和葡萄糖作為碳源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，果糖與葡萄糖的比例設(shè)置同于WFBD組。

發(fā)酵罐分批發(fā)酵：裝液量1.6 L，接種量10% (體積分?jǐn)?shù))，溫度38 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵過(guò)程中以MgCO3控制pH 6.0～6.5，定時(shí)取樣，分析發(fā)酵液中糖及有機(jī)酸含量。

發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵(兩種不同補(bǔ)料方式)：①以右旋糖酐發(fā)酵廢液為碳源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，初始還原糖質(zhì)量濃度約50 g/L，隨著發(fā)酵進(jìn)行緩慢流加 500 g/L 高質(zhì)量濃度外源葡萄糖，控制發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度在 10～15 g/L(A)。②以30 g/L葡萄糖為碳源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，待發(fā)酵液中葡萄糖消耗至10 g/L 左右間歇流加還原糖濃度約300 g/L的濃縮右旋糖酐發(fā)酵廢液，控制總糖質(zhì)量濃度在30 g/L以下(B)。

1.2.2Plackett-Burman(PB) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用MINITAB軟件設(shè)計(jì)9因素PB試驗(yàn)[12-14]，原發(fā)酵培養(yǎng)基組分濃度作為低水平，高水平選取低水平濃度的1.25倍，培養(yǎng)基配制及發(fā)酵方法如1.2.1搖瓶發(fā)酵所示，以最終丁二酸產(chǎn)量作為效應(yīng)值，設(shè)計(jì)試驗(yàn)次數(shù)20次，增加兩次中心點(diǎn)試驗(yàn)以利于誤差分析，則總試驗(yàn)次數(shù)為22次，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1　Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

注：每組數(shù)據(jù)平行3次，取平均值。

1.2.3分析方法

菌體濃度測(cè)量采用比濁法[15]，糖及有機(jī)酸的測(cè)量采用高效液相色譜法[16]。

2　結(jié)果與討論

2.1不同發(fā)酵廢液糖濃度對(duì)搖瓶發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響

以右旋糖酐發(fā)酵廢液來(lái)配制不同初始糖濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基，考察發(fā)酵廢液的糖濃度對(duì)丁二酸發(fā)酵的影響，結(jié)果如表2所示。隨著初始糖濃度的增加，菌體OD值、丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)初始糖濃度為60 g/L 時(shí)，丁二酸產(chǎn)量為35.3 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值0.65 g/g，而當(dāng)初始糖濃度高于60 g/L 時(shí)，糖酸轉(zhuǎn)化率則開(kāi)始下降，殘?zhí)窃黾樱瑫r(shí)菌體OD值也處于下降趨勢(shì)，這說(shuō)明高濃度的初糖會(huì)抑制琥珀酸放線桿菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸，這與陶生濤[17]用甘蔗渣水解液發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的結(jié)果一致。

表2　不同初始糖濃度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

注：每組數(shù)據(jù)平行3次，取平均值。

2.2以Plackett-Burman 試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組分濃度

在確定碳源糖質(zhì)量濃度為60 g/L時(shí)，采用PB試驗(yàn)篩選發(fā)酵培養(yǎng)基中主要影響因子，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及效應(yīng)值丁二酸產(chǎn)量見(jiàn)方法1.2.2，結(jié)果處理見(jiàn)表3。

表3　Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)以上數(shù)據(jù)，按各因素的P值大小排序，P值越小其對(duì)應(yīng)因素對(duì)效應(yīng)值影響越大，則原培養(yǎng)基組分中對(duì)丁二酸產(chǎn)量影響值由大到小分別排列為：NaH2PO4·2H2O>NaCl>K2HPO4·3H2O>葉酸>玉米漿>無(wú)水CaCl2>Na2S>生物素>MgCl2·6 H2O，因NaH2PO4·2H2O的P值(0.306) 遠(yuǎn)小于其他培養(yǎng)基組分的P值(>0.5)，所以NaH2PO4·2H2O是發(fā)酵培養(yǎng)基組分中對(duì)丁二酸產(chǎn)量影響的最主要因素，這可能是因?yàn)橛倚囚l(fā)酵廢液中殘留的磷酸鹽破壞了原始培養(yǎng)基中磷酸鹽緩沖體系的平衡，影響了細(xì)胞周圍的微環(huán)境，最終影響到菌體產(chǎn)酸。

對(duì)NaH2PO4·2H2O的濃度作單因素試驗(yàn)，選取2.0～3.0 g/L共6個(gè)梯度來(lái)優(yōu)化NaH2PO4·2H2O的濃度，通過(guò)比較其菌體濃度、殘?zhí)橇考岸《岙a(chǎn)量來(lái)篩選最優(yōu)濃度，結(jié)果如圖1所示。

圖1　不同NaH2PO4·2H2O 質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響Fig.1　Effects of various concentration of NaH2PO4·2H2O on succinic acid fermentation

當(dāng)NaH2PO4·2H2O濃度在2.0～3.0 g/L之間時(shí)，菌體濃度的變化不大，即NaH2PO4·2H2O濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)影響比較??；在丁二酸產(chǎn)量方面，當(dāng)NaH2PO4·2H2O濃度由2.0升高到2.4 g/L 時(shí)，丁二酸產(chǎn)量隨之升高明顯，當(dāng)NaH2PO4·2H2O濃度高于 2.8 g/L 時(shí)丁二酸產(chǎn)量則開(kāi)始下降，相應(yīng)的殘?zhí)橇恳搽S著這個(gè)規(guī)律而呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)。所以最優(yōu)的NaH2PO4·2H2O濃度為2.8 g/L，該濃度下最利于菌體產(chǎn)酸及充分利用右旋糖酐發(fā)酵廢液中糖分。

2.3琥珀酸放線桿菌利用葡萄糖與果糖的區(qū)別

右旋糖酐發(fā)酵廢液中只含有果糖和葡萄糖兩種糖分，弄清這兩種單糖對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酸的區(qū)別對(duì)提高產(chǎn)量有指導(dǎo)意義。如方法1.2.1中設(shè)計(jì)不同比例葡萄糖與果糖的WFBD組和模擬組的對(duì)照試驗(yàn)，以探究菌體利用葡萄糖與果糖的區(qū)別，同時(shí)確證右旋糖酐發(fā)酵廢液中是否有抑制菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酸的成分存在，結(jié)果如圖2所示。

圖2　不同比例葡萄糖與果糖對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酸的影響Fig.2　Effects of different proportion of glucose and fructose on cell growth and succinic acid production

在總糖濃度不變的情況下，隨著葡萄糖的含量不斷升高，菌體濃度和丁二酸產(chǎn)量也在增加，不管是WFBD組還是模擬組都呈現(xiàn)出相同的規(guī)律，這說(shuō)明葡萄糖比果糖更利于被菌體吸收利用，更能促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸過(guò)程。另外，分別從菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸來(lái)看，模擬組的發(fā)酵結(jié)果均優(yōu)于WFBD組，表明右旋糖酐發(fā)酵廢液中確實(shí)存在抑制菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的成分。

2.4右旋糖酐發(fā)酵廢液為碳源分批發(fā)酵產(chǎn)丁二酸

在3 L發(fā)酵罐中考察以右旋糖酐發(fā)酵廢液為唯一碳源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的情況，從圖3可以看出，發(fā)酵液中葡萄糖很快被消耗完，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至16 h時(shí)，菌體OD值達(dá)到最大6.18，40 h之后果糖消耗速率和丁二酸產(chǎn)生速率開(kāi)始急劇下降，至46.8 h 發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液中各組分濃度基本不變，最終產(chǎn)丁二酸40.5 g/L，果糖殘余量較高，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程總耗糖速率為1.01g/L，丁二酸生產(chǎn)強(qiáng)度為0.87 g/L/h，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.83 g/g。劉璇[11]等以葡萄糖為碳源進(jìn)行分批發(fā)酵時(shí)，以50 g/L 葡萄糖為底物發(fā)酵32 h產(chǎn)丁二酸40.7 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度1.27 g/(L·h)，糖酸轉(zhuǎn)化率0.81 g/g，相比較下，以右旋糖酐發(fā)酵廢液為碳源進(jìn)行發(fā)酵的缺陷在于發(fā)酵速率慢，生產(chǎn)強(qiáng)度比以葡萄糖為碳源時(shí)低46%，且殘?zhí)歉?，糖利用不徹底?/p>

圖3　右旋糖酐發(fā)酵廢液分批發(fā)酵產(chǎn)丁二酸Fig.3　Batch fermentation on waste fermentation broth of dextran forsuccinic acid production

2.5右旋糖酐發(fā)酵廢液與外源葡萄糖混合補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)丁二酸

補(bǔ)料分批發(fā)酵可以有效提高丁二酸的產(chǎn)量，2.3的結(jié)果顯示葡萄糖比果糖更利于菌體的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸，選擇初始發(fā)酵用右旋糖酐發(fā)酵廢液培養(yǎng)基，后續(xù)流加葡萄糖(A)和初始發(fā)酵用葡萄糖培養(yǎng)基，后續(xù)流加濃縮右旋糖酐發(fā)酵廢液(B)兩種補(bǔ)料方式，進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，見(jiàn)方法1.2.1，其發(fā)酵過(guò)程如圖4所示。

圖4　右旋糖酐發(fā)酵廢液與外源葡萄糖混合補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)丁二酸Fig.4　Fed-batch fermentation on waste fermentation broth of dextran and exogenous glucose forsuccinic acid production注：圖A為補(bǔ)料方式①發(fā)酵曲線，0 h即開(kāi)始緩慢流加外源葡萄糖，圖B為補(bǔ)料方式②發(fā)酵曲線，圖中箭頭處 8h開(kāi)始間歇流加濃縮 WFBD。

圖4A菌體生長(zhǎng)略遜于圖4B，這可能是由于B中初始發(fā)酵液以葡萄糖為唯一碳源，培養(yǎng)基中沒(méi)有右旋糖酐發(fā)酵廢液存在，菌體生長(zhǎng)未受不明成分影響。兩種補(bǔ)料方式發(fā)酵液最終的丁二酸質(zhì)量濃度雖然接近，分別是53.8 g/L 和55.0 g/L，但由于補(bǔ)料方式的不同造成不同的體積稀釋效應(yīng)，實(shí)際上B補(bǔ)料方式中生產(chǎn)的丁二酸量更多，具體的參數(shù)比較見(jiàn)表4。

從表4數(shù)據(jù)可以得知，補(bǔ)料方式B殘?zhí)菨舛鹊?，添加外源葡萄糖量少，單次發(fā)酵使用的右旋糖酐發(fā)酵廢液多，產(chǎn)生的丁二酸量多，且糖酸轉(zhuǎn)化率也更高，說(shuō)明補(bǔ)料方式B明顯優(yōu)于A，相對(duì)于分批發(fā)酵，丁二酸產(chǎn)物濃度提高了 35.8%。

2.6不同原料發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的比較

利用廢棄原料是發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸的研究熱點(diǎn)之一，主要有秸稈、酒糟、甘蔗渣、糖蜜等，如表5所示，與其他廢棄原料相比，右旋糖酐發(fā)酵廢液發(fā)酵的丁二酸產(chǎn)量相對(duì)較高，且發(fā)酵操作簡(jiǎn)單，無(wú)需水解過(guò)程，因此是一種具有良好應(yīng)用前景的原料。

表4　兩種補(bǔ)料分批發(fā)酵的參數(shù)比較

表5　不同原料發(fā)酵產(chǎn)丁二酸

3　結(jié)論

本文率先報(bào)道了以右旋糖酐發(fā)酵廢液為碳源，利用琥珀酸放線桿菌發(fā)酵丁二酸。研究表明：右旋糖酐發(fā)酵廢液作為碳源對(duì)發(fā)酵有一定影響，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中的NaH2PO4·2H2O濃度，搖瓶產(chǎn)丁二酸提高22.3%；以 60 g/L 初糖質(zhì)量濃度的右旋糖酐發(fā)酵廢液為碳源進(jìn)行分批發(fā)酵，發(fā)酵 46.8 h產(chǎn)丁二酸40.5 g/L，采用發(fā)酵起始以低葡萄糖濃度培養(yǎng)基，后續(xù)補(bǔ)加濃縮右旋糖酐發(fā)酵廢液的方式進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，最終產(chǎn)丁二酸 55.0 g/L，相對(duì)于分批發(fā)酵提高 35.8%，生產(chǎn)強(qiáng)度 1 g/L/h，糖酸轉(zhuǎn)化率為 0.83 g/g；與其它廢棄原料比較，右旋糖酐發(fā)酵廢液具有不需水解、操作步驟簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，且丁二酸產(chǎn)量相對(duì)較高，應(yīng)用前景良好。

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Fermentative succinic acid production from waste fermentation broth of dextran

ZHA Xin-hua1, ZHENG Pu1*, CHEN Peng-cheng1, WEI Zhe2

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(Shandong Jinyang Pharmaceutical Company Limited,Zibo 255100,China)

In this paper, succinic acid production by Actinobacillus succinogenes from waste fermentation broth of dextran was studied. After comparing the effect of initial sugar concentrations on succinic acid production, Plackett-Burman experiment was used to determine that NaH2PO4·2H2O was the most important factor in succinic acid production. Results from single factor experiment suggested that the optimal concentration of NaH2PO4·2H2O was 2.8 g/L for the following fermentation tests. Condensed waste fermentation broth of dextran with reducing sugar concentration of 60 g/L was used as the carbon source for batch fermentation in a 3 L fermentor, and 40.5 g/L succinic acid concentration was achieved after 46.8 h. In the fed-batch fermentation, an initial carbon source of 30 g/L glucose solution was added, followed by condensed waste fermentation broth of dextran, leading to an eventual succinic acid concentration of 55.0 g/L with a productivity of 1 g/(L·h) and conversion rate of 0.83 g/g. This work not only provided a new and efficient way to produce succinic acid using cheap raw materials, but also offered a significant promising method for solving the problems of waste liquid emission.

waste fermentation broth of dextran;optimize culture medium;fed-batch fermentation; succinic acid

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601002

碩士研究生(鄭璞教授為通訊作者，E-mail: zhengpu @ jiangnan.edu.cn)。

江蘇省產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(2015 BY2015019-37)；國(guó)家 863支持項(xiàng)目 (2006 AA027235)

2015-09-30，改回日期：2015-10-12