王星星，劉莉莉，吳云，于丹，王振中，蕭偉*

(1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222067；2.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222067)

痛寧凝膠臨床研究模擬劑中檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)的含量測(cè)定△

王星星1，2，劉莉莉1，2，吳云1，2，于丹1，2，王振中1，2，蕭偉1，2*

(1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222067；2.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222067)

目的：建立紫外分光光度法對(duì)痛寧凝膠臨床研究模擬劑中檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)3種色素的含量測(cè)定方法，用于監(jiān)控模擬劑的質(zhì)量及穩(wěn)定性。方法：應(yīng)用紫外分光光度法測(cè)定檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)在痛寧凝膠臨床研究模擬劑中的含量，確定色素的最大吸收波長(zhǎng)及最大吸收波長(zhǎng)處的吸收系數(shù)和摩爾吸收系數(shù)，并測(cè)定樣品中色素的含量。結(jié)果：檸檬黃在426 nm處的a=41.2 L·g-1·cm-1，ε=2.201 3×104mol·L-1·cm-1；誘惑紅在503 nm處的а=45.5 L·g-1·cm-1，ε=2.225 6×104mol·L-1·cm-1；亮藍(lán)在629 nm處的а=141.3 L·g-1·cm-1，ε=1.207 1×105mol·L-1·cm-1；在(40±2)℃、RH 65%±5%條件下，亮藍(lán)的含量未發(fā)生變化，檸檬黃和誘惑紅的含量明顯下降。在(25±2)℃、RH 60%±10%條件下，3種色素含量穩(wěn)定無(wú)變化。結(jié)論：建立的紫外分光光度法能夠準(zhǔn)確地測(cè)定模擬劑中色素的含量；通過(guò)紫外分光光度法的測(cè)定，模擬劑在高溫高濕[(40±2)℃、RH 65%±5%]條件下不穩(wěn)定，色素含量下降，在常溫[(25±2)℃、RH 60%±10%]條件下色素含量無(wú)變化，穩(wěn)定性好，此方法可以較好地監(jiān)控模擬劑的質(zhì)量及穩(wěn)定性。

紫外分光光度法；檸檬黃；誘惑紅；亮藍(lán)；穩(wěn)定性

檸檬黃、誘惑紅、亮藍(lán)作為我國(guó)允許使用的食用合成色素，其規(guī)定最大用量為0.1 g·Kg-1。合成色素常采用比值導(dǎo)數(shù)波譜法[1]、主成分回歸光度法[2]、示波極譜法[3-4]、因子分析-光度法[5]、高效液相色譜法[6-7]、多波長(zhǎng)線性回歸-導(dǎo)數(shù)分光光度法[8-9]、多元線性回歸K系數(shù)法[10-11]、薄層色譜掃描分析法[12]、計(jì)算機(jī)差譜法[13]、毛細(xì)管電泳法[14-15]、導(dǎo)數(shù)吸附伏安法[16]、固定PH值滴定法[17]、高聚物萃取分光光度法[18]、三維熒光光譜結(jié)合平行因子算法[19]等進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于兩組分及以上人工合成色素多采用紫外分光光度法[20]、雙波長(zhǎng)K系數(shù)法[21]等進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

痛寧凝膠臨床研究模擬劑(安慰劑)主要用于突顯痛寧凝膠藥物的臨床療效，其由卡波姆加水溶脹，與檸檬黃、誘惑紅、亮藍(lán)3種色素配制而成，色素的使用量符合國(guó)家規(guī)定。由文獻(xiàn)報(bào)道[22]得出，檸檬黃和誘惑紅在高溫高濕條件下不穩(wěn)定。本文將研究建立檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)3種色素的含量測(cè)定方法，以考察和控制模擬劑的質(zhì)量，為監(jiān)控樣品穩(wěn)定性提供有效的評(píng)價(jià)方法。紫外分光光度法雖然不是最先進(jìn)的檢測(cè)方法，但它多用于食品工業(yè)的色素測(cè)定，本研究旨在將其用于藥品色素的檢測(cè)中，為藥品的色素檢測(cè)提供一種方法。

1 儀器和試劑

UV-2450 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津)；聚酰胺樹(shù)脂(浙江永在化工有限公司)；檸檬黃、誘惑紅、亮藍(lán)[浙江吉高德色素科技有限公司(中意合資)]；檸檬酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；甲醇-甲酸(3∶2)、乙醇-氨水-水混合溶液(7∶2∶1)、冰乙酸(南京化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為一次蒸餾水。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

當(dāng)3種吸光物質(zhì)的吸收光譜兩兩互相重疊，且其最大吸收互有干擾時(shí)，可依據(jù)吸光度的加和性，通過(guò)解聯(lián)立方程組來(lái)進(jìn)行測(cè)定[23-25]。設(shè)試樣中有A、B、C 3種吸光組分，根據(jù)其吸收光譜，確定A、B、C 3種組分的最大吸收波長(zhǎng)λ1、λ2和λ3，然后分別測(cè)定3種組分在λ1、λ2和λ3處的吸收系數(shù)，再分別測(cè)量三組分在波長(zhǎng)為λ1、λ2和λ3處的吸光度值，設(shè)為Aλ1和Aλ2，Aλ3，解聯(lián)立方程：

(1)

(2)

(3)

(4)

ε=α·M

(5)

其中，α為吸收系數(shù)，M為色素的摩爾質(zhì)量。

2.2方法與結(jié)果

2.2.1 模擬劑的制備 卡波姆加水溶脹，色素加適量水溶解制成溶液，緩慢加入溶脹后的卡波姆中，攪拌均勻后灌裝，備用。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別準(zhǔn)確稱取檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)0.100 0 g，用pH≈6的蒸餾水分別溶解定容100 mL，配成質(zhì)量濃度為1 g·L-1的儲(chǔ)備液。稀釋成0.1 g·L-1的對(duì)照品溶液，此溶液每1.0 mL相當(dāng)于0.1 mg的商品合成色素。

2.2.3 吸收光譜的測(cè)定 分別準(zhǔn)確吸取0.5 mL檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)色素對(duì)照品溶液，置于10 mL比色管中，蒸餾水稀釋至刻度。在UV-2450全波長(zhǎng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上選擇重疊掃描方式，在330～700 nm掃描3種色素的吸收光譜，確定最大吸收波長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

注：1.檸檬黃；2.誘惑紅；3.亮藍(lán)。圖1 檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)的吸收光譜

結(jié)果表明，檸檬黃在330～520 nm處有明顯吸收，最大吸收波長(zhǎng)為λmax=426 nm；誘惑紅在430～580 nm處有明顯吸收，最大吸收波長(zhǎng)為λmax=503 nm；亮藍(lán)在580～670 nm處有明顯吸收，最大吸收波長(zhǎng)為λmax=629 nm。

2.2.4 檸檬黃、誘惑紅、亮藍(lán)在不同波長(zhǎng)下吸收系數(shù)的測(cè)定 依據(jù)2.2.3，在波長(zhǎng)426、503、629 nm處分別測(cè)定檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)的吸光度，由式(4)、(5)計(jì)算出檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)的吸收系數(shù)а及摩爾吸收系數(shù)ε，結(jié)果見(jiàn)表1～3。

表1 檸檬黃色素在不同波長(zhǎng)處的ε值

表2 誘惑紅色素在不同波長(zhǎng)處的ε值

表3 亮藍(lán)色素在不同波長(zhǎng)處的ε值

2.2.5 檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 分別準(zhǔn)確吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL檸檬黃和誘惑紅色素對(duì)照品溶液，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL亮藍(lán)色素對(duì)照品溶液，置于10 mL比色管中，蒸餾水稀釋至刻度。UV-2450全波長(zhǎng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，1 cm比色皿，蒸餾水為參比，分別在426、503、629 nm處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得到方程，檸檬黃：Y=41.52X-0.003，r=0.999 0；誘惑紅：Y=45.73X+0.009，r=0.999 0；亮藍(lán)：Y=141.3X+0.175，r=0.994 0，其斜率即為待測(cè)組分的吸收系數(shù)。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)值與所述計(jì)算值基本相符，證明此方法可行。

2.3 模擬劑中色素含量的測(cè)定

2.3.1 供試品溶液的制備 稱取制備好的模擬劑5 g，放入100 mL燒杯中，加入50%乙醇溶液30 mL，溫?zé)崛芙?，加熱?0 ℃。將1 g聚酰胺粉加少許水調(diào)成糊狀，倒入試樣溶液中，攪拌片刻，以G3垂融漏斗抽濾，用60 ℃、pH值為4的水(檸檬酸水)洗滌3～5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液(3∶2)洗滌3～5次，再用蒸餾水洗至中性。用乙醇-氨水-水混合溶液(7∶2∶1)解吸3～5次，每次5 mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸發(fā)至近干，加水溶解，定容至5 mL。

2.3.2 空白樣品吸收光譜的測(cè)定 卡波姆加水溶脹制得空白樣品，按照2.3.1方法處理得供試品溶液，測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，空白樣品在426、503、629 nm處均無(wú)吸收，排除了卡波姆的干擾。

2.3.3 模擬劑吸光度的測(cè)定 利用紫外分光光度計(jì)分別在426、503、629 nm處測(cè)定模擬劑的吸光度值，解聯(lián)立方程(1)、(2)、(3)，計(jì)算模擬劑中檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)的濃度，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 模擬劑中檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)的含量

2.3.4 回收率的測(cè)定 在模擬劑50%乙醇溶液中分別加入0.126 μg·mL-1的檸檬黃、0.079 μg·mL-1的誘惑紅和0.01 μg·mL-1的亮藍(lán)對(duì)照品溶液1 mL，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)6次。利用2.3.1的方法處理樣品，分別在426、503、629 nm處測(cè)定樣品的吸光度值，解聯(lián)立方程(1)、(2)、(3)，計(jì)算樣品中檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)的濃度及回收率。結(jié)果見(jiàn)表5～7。

由表5～7得出，檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)的回收率分別為96.8～100.0、97.2～100.2、98.2～100.3，均在合格范圍內(nèi)。

2.3.5 影響因素實(shí)驗(yàn) 高溫高濕實(shí)驗(yàn)：將制備好的模擬劑放入加速箱內(nèi)[(40±2)℃、RH 65%±5%]及常溫[(25±2)℃、RH 60%±10%]，分別于0、3、6、8、10 d觀察其形態(tài)及顏色的變化，并測(cè)定色素的含量。色素的分離及吸光度的測(cè)定同2.3.1和2.3.3。結(jié)果見(jiàn)表8～9。

表5 檸檬黃的回收率

表6 誘惑紅的回收率

表7 亮藍(lán)的回收率

表8 模擬劑在高溫高濕條件下的測(cè)定結(jié)果

注：1.顏色依據(jù)工業(yè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)色卡對(duì)照表；2 d樣品的顏色為8003土棕褐色。

表9 模擬劑在常溫條件下的測(cè)定結(jié)果

由表8得出，模擬劑在(40±2)℃、RH 65%±5%的條件下，放置時(shí)間≥6 d時(shí)，形態(tài)無(wú)變化，但顏色發(fā)生了改變，模擬劑中的檸檬黃和誘惑紅兩種色素的濃度明顯降低，RSD值分別為47.8%和58.9%，因此濕度是導(dǎo)致樣品顏色發(fā)生改變的原因。此實(shí)驗(yàn)證明，檸檬黃和誘惑紅兩種色素在此條件下不穩(wěn)定。因此我們要降低貯藏溫濕度為(25±2)℃、RH 60%±10%。由表9得出，模擬劑在(25±2)℃、RH 60%±10%的條件下，形態(tài)和顏色均無(wú)變化，穩(wěn)定性好。

強(qiáng)光照射實(shí)驗(yàn)：制備好的模擬劑于照度為(45 001±5001)x條件下放置10 d，保持室溫為(25±2)℃、RH 60%±10%，分別于0、5、10 d取樣檢測(cè)，色素的分離及吸光度的測(cè)定同2.3.1和2.3.3。結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 模擬劑在強(qiáng)光照射條件下的測(cè)定結(jié)果

由表10得出，模擬劑在強(qiáng)光照射10 d后，形態(tài)和顏色均無(wú)變化，穩(wěn)定性好。

2.3.6 18個(gè)月穩(wěn)定性試驗(yàn) 制備好的3批模擬劑，常溫[(25±2)℃、RH 60%±10%]放置，分別于0、1、2、3、6、9、12、18個(gè)月取樣，觀察性狀及顏色的變化，并測(cè)定色素的含量。結(jié)果見(jiàn)表11。

由表11可以看出，0～18個(gè)月，樣品的形態(tài)和顏色均無(wú)變化，同時(shí)紫外分光光度法檢測(cè)數(shù)據(jù)也未發(fā)生明顯改變。因此，模擬劑可以在常溫[(25±2)℃、RH 60%±10%]的條件下貯藏，質(zhì)量基本穩(wěn)定。

表11 18個(gè)月穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

研究擬定的紫外分光光度法同時(shí)測(cè)定模擬劑中檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)的檢測(cè)方法，可以靈敏的檢測(cè)出模擬劑中色素的含量，該方法準(zhǔn)確度高、靈敏度好、重現(xiàn)性強(qiáng)，可用于模擬劑的質(zhì)量及穩(wěn)定性的監(jiān)控。

4 討論

我們考察了模擬劑在高溫高濕、光照影響因素條件下的形態(tài)和顏色變化，在(40±2)℃、RH 65%±5%條件下模擬劑的顏色和濃度均發(fā)生變化，故又考察了溫濕度(25±2)℃、RH 60%±10%對(duì)模擬劑18個(gè)月穩(wěn)定性的影響，以確定樣品的貯藏條件。

檸檬黃和誘惑紅在高溫高濕條件下不穩(wěn)定，提示此類色素在模擬劑制備過(guò)程中需要嚴(yán)格控制產(chǎn)品的貯藏條件。應(yīng)用紫外分光光度法檢測(cè)可以準(zhǔn)確反應(yīng)樣品中色素含量的變化，且變化規(guī)律與樣品實(shí)際顏色發(fā)生改變存在明顯正相關(guān)系，說(shuō)明檢測(cè)的靈敏度明顯優(yōu)于肉眼觀察，可以更加準(zhǔn)確地監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量。

本研究也提示，模擬劑的貯藏條件是不應(yīng)忽視的問(wèn)題。消除不穩(wěn)定因素，才能確保模擬劑在臨床使用過(guò)程中的質(zhì)量穩(wěn)定，進(jìn)而保證樣品的穩(wěn)定、均一及安全。

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ContentsDeterminationofLemonYellow，F(xiàn)ancyRedandBrightBlueinClinicalPlaceboofTongningGel

WANG Xingxing1，2，LIULili1，2，WUYun1，2，YUDan1，2，WANGZhenzhong1，2，XIAOWei1，2*

(1.JiangsuKanionPharmaceuticalCo.Ltd.JiangsuLianyungang222067，China；2.StateKeyLaboratoryofNew-TechforChineseMedicinePharmaceuticalProcess，JiangsuLianyungang222067China)

Objective：To establish a quantitative method of three pigments lemon yellow，fance red and bright blue for quality control of the placebo.Method：The pigments were determined by UV spectrophotometry，and the maximum absorption and absorption coefficient and molar absorption coefficient of the pigments were determined，and their contents o in clinical placebo of Tongning gel were thereafter quantified.Result：The results were follows：lemon yellow：α=41.2 L·g-1·cm-1，ε=2.201 3×104 mol·L-1·cm-1on 426 nm，fancy red：α=45.5 L·g-1·cm-1，ε=2.225 6×104 mol·L-1·cm-1on 503 nm，and bright blue：α=141.3 L·g-1·cm-1，ε=1.207 1×105 mol·L-1·cm-1on 629 nm；The concentration of bright blue was unchanged，but lemon yellow and fancy red were unstable.Conclusion：The established UV spectrophotometry method is suitable for determination the pigments in placebo of Tongning gel at room temperature and destructive test.It can accurately control quality and stability of the placebo.

UV spectrophotometry；lemon yellow；fancy red；bright blue；stability

2014-11-26)

重大新藥創(chuàng)制(2013ZX09402203)

*

蕭偉，博士，研究員級(jí)高級(jí)工程師，研究方向：中藥新藥的開(kāi)發(fā)與研究；Tel：(0518)81152367，Email：kanionlunwen@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.024