郭婷婷，王兆華，張大軍

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021； 2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

大孔樹脂分離純化西洋參葉總皂苷的工藝研究△

郭婷婷1，王兆華2*，張大軍2

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130012)

目的：探索以D101型大孔吸附樹脂分離純化西洋參葉總皂苷的工藝條件及參數(shù)。方法：以總皂苷及人參皂苷Rb3的吸附率和解吸附率為指標(biāo)，對(duì)大孔樹脂分離純化西洋參葉總皂苷的工藝條件進(jìn)行考察，并對(duì)其吸附動(dòng)力學(xué)曲線和動(dòng)態(tài)解析曲線進(jìn)行探索。結(jié)果：藥材與濕樹脂量比為3∶10，上柱流速為1.5mL·min-1，重復(fù)上樣兩次，分別用3倍體積的水、3倍體積70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，減壓，濃縮，干燥，即得總皂苷提取物。提取物中總皂苷含量>75%，人參皂苷Rb3含量>10%，總皂苷提取物得率約為14%。結(jié)論：該工藝簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可用于西洋參葉中總皂苷的提取純化。

西洋參葉；大孔吸附樹脂；總皂苷；人參皂苷Rb3；工藝參數(shù)

西洋參PanaxquinquefoliusL.為五加科人參屬植物，原產(chǎn)于美國(guó)北部到加拿大南部一帶，北京、陜西、吉林等地已引種栽培成功[1]。由于西洋參葉所含的主要活性物質(zhì)—人參皂苷在種類上與主根基本一致，而在含量上明顯高于主根等其他藥用部位[2-3]，因而具有較高的開發(fā)利用價(jià)值。D101型大孔吸附樹脂分離純化總皂苷是目前國(guó)內(nèi)外常用的方法[4]，這種方法操作簡(jiǎn)單、樹脂可反復(fù)利用、成本低、安全無毒。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察了西洋參葉總皂苷的工藝參數(shù)，包括吸附量、吸附流速、脫附性能、藥液濃度等，為西洋參葉總皂苷提取物的制備工藝提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器和試藥

UV-2800紫外-可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；日本島津LC-10AT高效液相色譜儀、SPD-10A紫外檢測(cè)器(日本島津公司)；KQ-250型超聲波處理器(天津奧特賽恩斯儀器公司)；AE163電子天平(瑞士梅特勒公司)。

人參皂苷Rb3對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111686-2010002，供含量測(cè)定用)；D101大孔吸附樹脂(安徽三星樹脂科技有限公司，藥用級(jí))；西洋參葉購(gòu)自靖宇參園；甲醇為色譜純；乙醇、硫酸、冰醋酸、香草醛等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1總皂苷含量測(cè)定

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取人參皂苷Rb3對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.964mg·mL-1的溶液，搖勻。分別精密吸取上述溶液25、50、100、150、200、250μL，分別置于具塞試管中，蒸干，加入1%香草醛高氯酸試液0.5mL，置60℃水浴上加熱15min，立即取出，用冰水冷卻2min，加入77%硫酸溶液5mL，搖勻，以相應(yīng)試劑作為空白。于540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為24.10～241.0μg。

2.1.2供試品溶液的制備與測(cè)定 取西洋參葉總皂苷提取物0.15g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，精密量取續(xù)濾液10mL，蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，以水飽和正丁醇提取3次，每次20mL，合并正丁醇提取液，以正丁醇飽合水溶液洗滌2次，每次15mL，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，并轉(zhuǎn)移至10mL量瓶?jī)?nèi)，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液[5]。精密吸取供試品溶液40μL，蒸干，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法自“加入1%香草醛高氯酸試液0.5mL”起，依法測(cè)量吸收度，計(jì)算樣品的含量。

2.1.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取對(duì)照品溶液和供試品溶液，顯色后在480～620nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為540nm。光譜掃描曲線見圖1。

注：A.人參皂苷Rb3對(duì)照品；B.西洋參葉供試品。圖1 對(duì)照品和供試品光譜掃描曲線

2.2人參皂苷Rb3含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-水(32︰68)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；柱溫為室溫，理論板數(shù)按人參皂苷Rb3計(jì)算應(yīng)不低于2500。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取人參皂苷Rb3對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為 0.5 mg·mL-1的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備與測(cè)定 分別精密吸取2.1.2項(xiàng)下供試品溶液及上述對(duì)照品溶液各10 μL，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量，液相色譜圖見圖2。

注：A.對(duì)照品；B供試品；1.人參皂苷Rb3。圖2 對(duì)照品和供試品液相色譜圖

2.3工藝條件及參數(shù)的優(yōu)化

2.3.1大孔樹脂預(yù)處理 新的D101大孔樹脂在使用前，用5倍量95%乙醇浸泡24h，用水洗至無醇味，繼用5%HCl浸泡2～3h，用水沖洗至中性，再用5%NaOH浸泡2～3h，用水沖洗至中性，備用。

2.3.2上柱溶液的制備 稱取西洋參葉適量，用12倍量水煎煮2次，每次1h，濾過，合并濾液，定容至一定體積，即得上柱溶液(每mL含0.04g生藥)，備用。經(jīng)測(cè)定總皂苷含量為4.640mg·mL-1；人參皂苷Rb3含量為1.073mg·mL-1。

2.3.3大孔吸附樹脂對(duì)西洋參葉總皂苷靜態(tài)飽和吸附量與解吸率的測(cè)定 靜態(tài)飽和吸附量的測(cè)定[7]：準(zhǔn)確稱取已處理好的D101大孔吸附樹脂15.0g，置于250mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入西洋參葉上柱溶液200mL，在100r·min-1的條件下振蕩24h，使之充分吸附，濾過，取續(xù)濾液10mL，蒸干，照2.1.2項(xiàng)下方法自“殘?jiān)铀?0mL使溶解”起，依法制得供試品溶液，并測(cè)定吸附剩余液中總皂苷及人參皂苷Rb3含量，計(jì)算D101大孔樹脂在室溫條件下對(duì)西洋參葉莖葉總皂苷及人參皂苷Rb3的飽和吸附量。

吸附量=[(吸附前濃度-吸附后濃度)×溶液體積]/樹脂質(zhì)量，測(cè)定結(jié)果見表1。

靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)：經(jīng)過24h靜態(tài)吸附的樹脂淋凈液體，準(zhǔn)確加入200mL80%的乙醇，室溫下連續(xù)振蕩12h，使皂苷充分解吸附，濾過，取續(xù)濾液，測(cè)定總皂苷及人參皂苷Rb3含量，計(jì)算解吸率。

解吸率(%)=[(解吸后溶液濃度×解吸后溶液體積)/(吸附前溶液濃度×吸附液體積-吸附后溶液濃度×吸附液體積)]×100%，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 靜態(tài)飽和吸附量與解吸率的測(cè)定(n=3)

2.3.4 大孔吸附樹脂對(duì)西洋參葉總皂苷動(dòng)態(tài)飽和吸附量與解吸率的測(cè)定 動(dòng)態(tài)飽和吸附量的測(cè)定：取西洋參葉上柱溶液，緩慢通過裝有D101大孔樹脂15 g的柱，控制流速為1.5 mL·min-1，每10.0 mL為1個(gè)流份，收集20份，蒸干，照2.1.2項(xiàng)下方法自“殘?jiān)铀?0 mL使溶解”起，依法制得供試品溶液，并測(cè)定各流份中總皂苷及人參皂苷Rb3的含量。以流出液中總皂苷的含量為縱坐標(biāo)，流出液收集管數(shù)為橫坐標(biāo)繪制動(dòng)態(tài)吸附流出曲線，吸附流出曲線見圖3。

圖3 西洋參葉提取溶液動(dòng)態(tài)吸附流出曲線

結(jié)果表明，從第11流份開始，流出液顏色逐漸加深，皂苷出現(xiàn)逐漸泄漏現(xiàn)象，第16份時(shí)洗出液中總皂苷含量已達(dá)原藥液含量的50%，并一直持續(xù)至20份，但未出現(xiàn)洗出液中總皂苷含量與上柱溶液相當(dāng)?shù)牧鞣荨?/p>

動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)：動(dòng)態(tài)吸附飽和的樹脂，用水洗至近無色，再以80% 乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液，并定容至100 mL，精密吸取5 mL，蒸干，照2.1.2項(xiàng)下方法自“殘?jiān)铀?0 mL使溶解”起，依法制得供試品溶液，并測(cè)定總皂苷及人參皂苷Rb3含量，計(jì)算D101大孔樹脂在室溫條件下對(duì)西洋參葉莖葉總皂苷及人參皂苷Rb3的飽和吸附量，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 動(dòng)態(tài)飽和吸附量和解吸率的測(cè)定(n=3)

結(jié)果提示，上柱溶液反復(fù)多次通過D101吸附樹脂，可促使吸附樹脂接近飽合。為避免生產(chǎn)過程中造成總皂苷的泄漏損失，結(jié)合靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以樹脂吸附量的80%上樣，即每g大孔樹脂總皂苷的上樣量不得超過34 mg；人參皂苷Rb3的上樣量不超過6.5 mg，即10 kg樹脂上樣量不超過3 kg西洋參葉藥材。

2.3.5 洗脫溶媒的選擇 采用乙醇-水系統(tǒng)為洗脫液，取經(jīng)過24 h靜態(tài)吸附的樹脂，先用3倍柱體積的水洗脫，再依次用4倍柱體積的10%、20%、30%、50%、70%、80%的乙醇連續(xù)洗脫，各洗脫液分別定容至100 mL，取各洗脫液5～20 mL，制備供試品溶液，照含量測(cè)定方法分別測(cè)定總皂苷和人參皂苷Rb3的含量，計(jì)算洗脫率，洗脫曲線見圖4。

圖4 不同濃度乙醇洗脫曲線

由圖4可知，用70%乙醇溶液洗脫總皂苷及人參皂苷Rb3，洗脫量均最高，且累計(jì)洗脫率均在95%以上，故選擇70%乙醇溶液作為洗脫溶媒。

2.3.6 洗脫溶媒用量 取經(jīng)過24 h靜態(tài)吸附的樹脂，先用3倍柱體積的水洗柱除，去水溶性雜質(zhì)，然后用70%乙醇溶液洗脫，分段收集，定容，測(cè)定洗脫液中總皂苷的含量及人參皂苷Rb3含量，以洗脫液中人參皂苷的含量為縱坐標(biāo)，收集管數(shù)為橫坐標(biāo)繪制動(dòng)態(tài)脫附曲線。計(jì)算洗脫率，確定洗脫溶媒用量。洗脫溶溶媒用量曲線見圖5。

圖5 洗脫溶媒用量曲線

由圖5可知，三倍體積70%乙醇可使總皂苷及人參皂苷Rb3的洗脫率在90%以上，由此確定解吸洗脫溶液的用量為柱體積的3倍。

2.3.6 上柱溶液濃度和上樣流速試驗(yàn) 因素水平：以上柱液濃度(A)、吸附流速(B)為因素，總皂苷含量及提取物得率為考察指標(biāo)進(jìn)行全面試驗(yàn)。因素水平見表3。

表3 上柱溶液濃度和上樣流速試驗(yàn)水平表(n=3)

全面試驗(yàn)：稱取西洋參葉60 g，平行9份，用12倍量水煎煮2次，每次1 h，濾過，合并濾液，濃縮并定容至一定體積，制得不同濃度的上柱溶液。按表3條件，通過吸附樹脂(裝量200 g)柱，依次分別用3倍體積的水、3倍體積70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，減壓、濃縮、干燥，即得總皂苷提取物。采用2.1項(xiàng)下方法，測(cè)定總皂苷含量，結(jié)果見表4。

表4 上柱溶液濃度和上樣流速的試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

從表4可以看出，隨著上樣液濃度及吸附流速的增加，干膏得量及干膏中總皂苷含量有所變化；為保證提取效率及提取效果，選用上柱溶液濃度為0.4 g·mL-1，上樣流速為1.5 mL·min-1。

2.3.7 重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取西洋參葉3 kg，加12倍量水煎煮2次，每次1 h，濾過，濾液濃縮至6000 mL，通過裝有10 kg預(yù)處理好的D101樹脂柱，Φ200 mm×600 mm，按1.5 mL·min-1流速上樣，將流出液重復(fù)通過樹脂柱，先用蒸餾水(3 BV)洗滌，再用70%的乙醇(3 BV)洗脫，收集70%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮，減壓干燥，測(cè)定干膏中總皂苷和人參皂苷Rb3的含量。結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果(n=3)

3 討論

驗(yàn)證試驗(yàn)表明，西洋參葉加12倍量煎煮提取2次，每次1h，濃縮至每ML含0.5g生藥，以D101大孔樹脂進(jìn)行吸附，使用濃度70%的乙醇進(jìn)行洗脫，即可獲得高收率、高含量的皂苷提取物，總皂苷含量大于75%，該方法操作簡(jiǎn)便且易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。

本研究中，用分光光度法與HPLC法結(jié)合的雙指標(biāo)測(cè)定方法來考察工藝條件和參數(shù)，而在考察上柱溶液濃度和上樣流速時(shí)僅采用了分光光度法，為的是縮短分析時(shí)間，同時(shí)達(dá)到含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

在試驗(yàn)中表明，西洋參葉90℃溫浸2h，與煎煮提取1.0h的效果相當(dāng)。

棄去水及30%乙醇洗脫液，收集70%洗脫液，所得提取物中總皂苷含量沒有明顯變化，而人參皂苷Rb3含量明顯提高。

將上柱溶液重復(fù)通過樹脂柱，可提高干膏得率及提取物中總皂苷和人參皂苷Rb3的含量，但在動(dòng)態(tài)吸附考察時(shí)未找到吸附飽和點(diǎn)，初步分析可能是吸附樹脂的吸附性與時(shí)間有關(guān)，其內(nèi)在聯(lián)系有待進(jìn)一步研究。

[1] 魏曉雨，田義新，趙智靈，等.我國(guó)西洋參引種30年后遺傳穩(wěn)定性研究[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39(19)：3723-3726.

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PurificationofTotalSaponinsofLeavesofPanaxquinquefoliusbyMacroreticularResin

GUOTingting1，WANGZhaohua2*，ZHANGDajun2

(1.TheAffiliatedHospitalToChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130021，China;2.AcademyofChineseMedicalSciencesofJilinProvince,Changchun130012,China)

Objective：The study aims at purification of total saponins of leaves ofPanaxquinquefloiusby D-101macroreticular resin.Methods：Using the adsorption and desorption rates of total saponins and ginsenside Rb3as parameters，the purification technological conditions of total saponins of the leaves ofP.quinquefloiusby macroreticular resin were experimentally investigated.The curves of adsorption kinetics and dynamic adsorption kinetics of macroreticular resin were exploited.Results：The rate of medicinal materials and the wet resin content was3∶10.The flow rate of the macro-reticular resin column was1.5mL·min-1.The experiments were repeated twice.The column was eluted by water of three times volume and ethanol of three times volume.After then ethanol elution was collected.The ethanol elution was concentrated，dried，and then the total saponins extract of the leaves ofP.quinquefloiuswas obtained.The contents of total saponins in extract was more than75%.The contents of ginsenside Rb3was more than10%.The yield of total saponins extract was14%.Conclusion：This method is simple，repeatable，available for extract and purification of total saponins of the leaves ofP.quinquefloius.

Leaves ofPanaxquinquefloius；macroreticular resin；total saponins；ginsenside Rb3；technological conditions and parameters

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.025

2015-05-04)

國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2013ZX09103002-022)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃專項(xiàng)(20140311014YY)

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王兆華，主任藥師，研究方向：中藥新藥與新制劑；Tel：(0431)86058659，E-mail：wangzhaohua221@163.com