唐爽，包永睿，2，3，孟憲生，2，3 *，富力，王帥，2，3

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600；4.大連富生天然藥物開(kāi)發(fā)有限公司，遼寧 大連 116600)

基于一測(cè)多評(píng)法評(píng)價(jià)天麻活性成分的質(zhì)量控制方法

唐爽1，包永睿1，2，3，孟憲生1，2，3 *，富力4 *，王帥1，2，3

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116600；4.大連富生天然藥物開(kāi)發(fā)有限公司，遼寧 大連116600)

目的：采用一測(cè)多評(píng)技術(shù)建立不同產(chǎn)地天麻活性成分的質(zhì)量控制方法，為更加全面提升天麻質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。方法：采用高效液相色譜法，以天麻素為內(nèi)標(biāo)物，建立其與腺苷、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、巴利森苷A的相對(duì)校正因子，對(duì)10種不同產(chǎn)地天麻的總苷進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：采用相對(duì)校正因子法對(duì)10種不同產(chǎn)地天麻活性成分含量值進(jìn)行計(jì)算，將計(jì)算值與外標(biāo)法的實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較，二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定10種不同產(chǎn)地天麻中活性成分的含量，該方法為天麻藥材的品質(zhì)優(yōu)劣鑒定提供依據(jù)，為全面提升天麻藥材的質(zhì)量提供新方法。

天麻；天麻活性成分；一測(cè)多評(píng)；質(zhì)量控制

天麻為蘭科天麻屬植物天麻GastrodiaelataB1.的干燥塊莖，味甘，性平，歸肝經(jīng)，其功效為熄風(fēng)止痙。主產(chǎn)于我國(guó)云南、貴州、四川、陜西等地，有野生和種植之分，被列為常用名貴中藥。中藥材市場(chǎng)上天麻魚(yú)目混珠，有關(guān)天麻藥材質(zhì)量控制方法的研究已有一些報(bào)道，《中華人民共和國(guó)藥典》及部分文獻(xiàn)對(duì)天麻的質(zhì)量控制方法較為簡(jiǎn)單，僅測(cè)定了天麻素的含量，在對(duì)中藥進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，選擇單一成分存在很多不足，并且大部分文獻(xiàn)多以天麻整體藥材為研究對(duì)象，某些含量不高的有效成分無(wú)法測(cè)定，不能夠全面反應(yīng)中藥材質(zhì)量。天麻在藥理上有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、增加血流量、減少血管阻力、改善供血等作用，還具有抗氧化及細(xì)胞保護(hù)、益智健腦、延緩衰老的作用。其中腺苷、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、巴利森苷A 均具有抗血小板聚集作用，故對(duì)天麻的活性成分進(jìn)行提取、富集，得到純度較高的天麻活性成分，同時(shí)采用一測(cè)多評(píng)技術(shù)[1]同時(shí)測(cè)定天麻活性成分中腺苷、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、巴利森苷A 5種成分的含量，該方法簡(jiǎn)便、可行，為天麻藥材的質(zhì)量控制規(guī)范及標(biāo)準(zhǔn)制定奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本文收集10種不同產(chǎn)地天麻藥材，包括道地及野生，對(duì)10種不同產(chǎn)地天麻活性成分的含量進(jìn)行測(cè)定，方法可行，為天麻藥材的品質(zhì)優(yōu)劣鑒定提供依據(jù)，為中藥有效組分的質(zhì)量控制提供新方法[2-3]。

1 儀器與材料

1.1主要儀器

Agilent-1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)；CP225D電子分析天平(德國(guó)Sartorius分析天平有限公司，十萬(wàn)分之一)；MiLLi-Q超純水處理裝置(美國(guó)Millipore公司)；CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)NUAIRE公司)；AE31型倒置相差顯微鏡(Motic公司)；SUNRISE酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)。

1.2主要試藥

天麻藥材購(gòu)自安國(guó)藥材批發(fā)市場(chǎng)，產(chǎn)地分別為安徽、遼寧丹東、貴州、河北、遼寧鳳城、湖北、吉林、遼寧本溪、四川、云南麗江(野生)。天麻素對(duì)照品(批號(hào)：110807-201306)、腺苷對(duì)照品(批號(hào)：110807-201308)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品(批號(hào)：130712)、對(duì)羥基苯甲醛對(duì)照品(批號(hào)：140301)、巴利森苷A對(duì)照品(批號(hào)：140320)均購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈(色譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1混合對(duì)照品溶液的制備

分別稱取腺苷、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、巴利森苷A對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1mL含腺苷0.116mg、天麻素1.080mg、對(duì)羥基苯甲醇0.100mg、對(duì)羥基苯甲醛0.010mg、巴利森苷A3.266mg的對(duì)照品溶液，搖勻，即得[4-5]。

2.2供試品溶液的制備

取天麻藥材約5g，粉碎(過(guò)40目篩)，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入50mL70%乙醇，回流提取3次，每次1h，過(guò)濾，濾液濃縮至10mL，上AB-8樹(shù)脂柱(10g)，用10mL蒸餾水除雜，再用50mL90%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移定容至10mL量瓶中，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得[6]。

2.3色譜條件

AglientTC-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.04%甲酸水溶液，梯度洗脫(0→3→10→12→30→60min，2%→2%→8%→9%→9%→30%乙腈)；檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm；流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5μL[7-8]。色譜圖見(jiàn)圖1、2。

注：1.腺苷；2.天麻素；4.對(duì)羥基苯甲醇；8.對(duì)羥基苯甲醛；11.巴利森苷A；下同。圖1 天麻供試品HPLC色譜圖

圖2 對(duì)照品HPLC色譜圖

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍考察 精密吸取上述混和對(duì)照品溶液1、3、5、10、14、18μL，注入高效液相色譜儀中，按照上述色譜條件分析，測(cè)定各自峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，得各對(duì)照品的線性回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。表明各化合物在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各被測(cè)成分的線性回歸分析結(jié)果

2.4.2 精密度試驗(yàn) 吸取混合對(duì)照品溶液5 μL，按上述色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各色譜峰的峰面積，結(jié)果測(cè)得腺苷、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、巴利森苷A峰面積值的RSD分別為0.79、1.03、1.83、2.50、1.08%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣，測(cè)定各指標(biāo)性成分峰面積，結(jié)果測(cè)得腺苷、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、巴利森苷A峰面積值的RSD分別為0.94%、1.10%、2.87%、2.02%、1.98%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測(cè)定各指標(biāo)性成分峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，結(jié)果測(cè)得腺苷、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、巴利森苷A含量分別為0.177、4.330、0.112、0.026、9.754 mg·g-1，其RSD分別為1.47%、1.32%、1.26%、2.88%、0.97%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取天麻樣品2.5 g，共6份，分別精密加入腺苷0.225 mg·mL-1、天麻素5.25 mg·mL-1、對(duì)羥基苯甲醇0.076 mg·mL-1、對(duì)羥基苯甲醛0.027 mg·mL-1、巴利森苷A12.005 mg·mL-1混合對(duì)照品2 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按上述方法測(cè)定樣品含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果腺苷、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、巴利森苷A的平均加樣回收率分別為99.07%、98.10%、98.81%、100.00%、98.51%，RSD分別為0.82%、1.21%、1.07%、2.34%、0.95%，結(jié)果表明該方法法具有良好的回收率。

2.5相對(duì)校正因子的計(jì)算

在標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=aX+b中，由于b值通常為誤差引起，在a/b值大于100時(shí)，b/a值可以忽略不計(jì)，此時(shí)可以X=Y/a直接計(jì)算，故相對(duì)校正因子(fk/s)可以用二者的斜率a之比來(lái)直接計(jì)算，相對(duì)校正因子計(jì)算公式為：fk/s=(ak/as)，即可以參照物快速推算其余待測(cè)化學(xué)成分的含量，計(jì)算公式為：Ck=Ak/(as×fk/s)。式中 as為參照物斜率，ak為待測(cè)組分對(duì)照品斜率，Ck為待測(cè)組分濃度，Ak為待測(cè)組分峰面積[9-10]。結(jié)果腺苷、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、巴利森苷A的fk/s分別為9.208、2.634、44.654、0.476。見(jiàn)表2。

表2 天麻中4種成分的相對(duì)校正因子的計(jì)算

2.6相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察

本試驗(yàn)考察2套色譜系統(tǒng)(Agilent1100和Waters2695)以及不同色譜柱(AglientTC-C18和PhenomenexLunaC18)對(duì)相對(duì)校正因子的影響，表2結(jié)果顯示各成分的相對(duì)校正因子RSD≤2.17%。表明各成分的相對(duì)校正因子重復(fù)性良好。

2.7一測(cè)多評(píng)法與常規(guī)法測(cè)定結(jié)果的比較

分別取10批不同產(chǎn)地的天麻藥材粉末各5g，精密稱定，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，再分別用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算10批不同產(chǎn)地天麻中5種成分的含量，見(jiàn)表3。結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)及person相關(guān)分析證明2種方法結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可見(jiàn)一測(cè)多評(píng)在天麻的多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用是可行的。由數(shù)據(jù)可知天麻活性成分中天麻素含量為0.594～4.364 mg·g-1、腺苷含量為0.178～0.397 mg·g-1、對(duì)羥基苯甲醇含量為0.038～0.648 mg·g-1、對(duì)羥基苯甲醛含量為0.006～0.034 mg·g-1、巴利森苷A含量為7.024～14.345 mg·g-1。以上5種成分均與血小板作用密切相關(guān)，因此可通過(guò)進(jìn)一步的藥效實(shí)驗(yàn)來(lái)制定天麻活性成分中該5種成分的定量標(biāo)準(zhǔn)。

表3 天麻中4種成分含量測(cè)定結(jié)果 /mg·g-1

3 討論

中藥的質(zhì)量控制研究是中藥研究的重要部分，在天麻的質(zhì)量控制研究中，在以往文獻(xiàn)中多以天麻整體藥材為研究對(duì)象，某些含量不高的有效成分無(wú)法測(cè)定，相關(guān)研究表明其主要的化學(xué)活性成分為天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛等成分，故本文以組分中藥為出發(fā)點(diǎn)，在前期的組分富集基礎(chǔ)上，對(duì)純度較高的天麻活性成分進(jìn)行質(zhì)量控制，該方法為現(xiàn)代化進(jìn)程中新藥研發(fā)和中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供研究思路及研究路線。

天麻屬名貴中藥材，分布遍及全國(guó)各地，分為野生和栽培，道地主產(chǎn)區(qū)有貴州、四川，同時(shí)安徽產(chǎn)地在市場(chǎng)流通中占據(jù)很大一部分，但其偽品也有很多，優(yōu)劣難辨，嚴(yán)重影響天麻藥材的質(zhì)量，故本文收集10種不同產(chǎn)地的天麻(包括道地、市場(chǎng)流通較多及野生品種)，建立其質(zhì)量控制方法，該方法可行，為天麻藥材的品質(zhì)優(yōu)劣鑒定提供依據(jù)，有效評(píng)價(jià)天麻藥材的安全性和有效性，從而建立更加全面的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

本文采用QAMS技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)天麻中5種有效化學(xué)成分同時(shí)段進(jìn)行多指標(biāo)含量測(cè)定，一測(cè)多評(píng)技術(shù)的研究思路側(cè)重從量上闡明主要成分或藥效成分間的相互關(guān)系，多用于同類型或同系列化合物，因?yàn)樵擃惢衔餃y(cè)定波長(zhǎng)基本一致，即使換不同儀器其重現(xiàn)性也較好。一測(cè)多評(píng)技術(shù)更是解決中藥對(duì)照品難以分離或性質(zhì)不穩(wěn)定、易分解等一系列問(wèn)題。相對(duì)校正因子的運(yùn)用能夠?qū)崿F(xiàn)在對(duì)照品短缺或特別昂貴情況下的多指標(biāo)成分含量測(cè)定。天麻中對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、巴利森苷A對(duì)照品價(jià)格較貴，而采用本文方法，僅以價(jià)格便宜的天麻素對(duì)照品即可實(shí)現(xiàn)天麻中多指標(biāo)成分定量，即以一個(gè)內(nèi)參對(duì)照品控制多個(gè)與藥效相關(guān)的化學(xué)成分，其測(cè)定方法具有一定應(yīng)用價(jià)值。

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StudyonQAMSMethodforQualityControlofTotalGlycosidesinGastrodiaElata

TANGShuang1，BAOYongrui1，2，3，MENGXiansheng1，2，3*，F(xiàn)ULi4*，WANGShuai1，2，3

(1.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China；2.Liaoningprovincemulti-componentChineseMedicineEngineeringTechnologyResearchCenter，Dalian116600，China；3.LiaoningProvinceModernTraditionalChineseMedicineResearchandEngineeringLaboratory，Dalian116600，China；4.DalianFushengNaturalDrugDevelopmentCo，Ltd，Dalian116600，China)

Objective：To establish a quality control method of the active ingredients inGastrodiaelatafrom10batches by quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS) technology and provide the basis for more comprehensively improving the quality control method ofG.elata.Methods：The HPLC was adopted for establishing the relative correction factors between gastrodin used as internal standard and adenosine，p-hydroxybenzyl alcohol，p-hydroxybenzaldehyde and parishin A，and then determined the contents of multiple components.Results：Using relative correction factor method for10different origins ofG.elataactive ingredients content value calculation，the calculated value compared with measured values，there was no significant difference.Conclusion：The QAMS is feasible and accurate to evaluate the contents of the active ingredients ofG.elatafrom10batches，the method provide the basis for quality identification ofG.elataand a new way to improve Chinese traditional medicine quality control standards.

Gastrodiaelata；active ingredients ofGastrodiaelata；QAMS method；quality control

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.011

2015-10-22)

*

孟憲生，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥效物質(zhì)和作用機(jī)制，Tel：(0411)85890185，E-mail：mxsvvv@126.com；富力，博士，教授級(jí)高級(jí)工程師，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，Tel：(0411)39962699，E-mail：2729677386@ qq.com