楊全偉，肖柳，黃雄超，張耕，余南才，譚靜玲

[1.武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢 430000；2.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢 430000；3.賽珂睿德生物醫(yī)藥科技(上海)有限公司，湖北 武漢 430000；4.湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430000]

金蟬花多糖的含量組成分析及其對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞 NF-κB 活性的研究△

楊全偉1，肖柳2，黃雄超3，張耕1，余南才1，譚靜玲4*

[1.武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢430000；2.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢430000；3.賽珂睿德生物醫(yī)藥科技(上海)有限公司，湖北 武漢430000；4.湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢430000]

目的：闡明金蟬花多糖的糖含量及單糖組成，研究其對(duì)脂多糖 (Lipopolysaccharide，以下簡(jiǎn)稱LPS)誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞NF-κB的活性。方法：以金蟬花為原料藥材，經(jīng)脫脂干燥、水提、濃縮、透析、乙醇沉淀和真空干燥后，得到金蟬花水提粗多糖。然后經(jīng)二乙氨乙基纖維素(DEAE-纖維素)陰離子交換柱純化獲得4種純化多糖。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)、高效凝膠滲透色譜(HPGPC)和氣相色譜(GC)方法對(duì)其中性糖含量、糖醛酸含量，相對(duì)分子質(zhì)量和單糖組成進(jìn)行測(cè)量分析，同時(shí)對(duì)4種純化金蟬花多糖進(jìn)行了體外細(xì)胞免疫活性測(cè)定。結(jié)果：金蟬花粗多糖的中性糖含量為48.36%，糖醛酸含量為12.39%，總多糖含量為60.75%，相對(duì)分子質(zhì)量為9.3×103Da，單糖組成物質(zhì)的量比分別為阿拉伯糖(Ara)∶木糖(Xyl)∶甘露糖(Man)∶半乳糖(Gal)∶葡萄糖(Glc)=0.42∶0.29∶4.14∶6.38∶6.8。4種金蟬花純化多糖中，只有0.2mol·L-1氯化鈉(NaCl)溶液洗脫的金蟬花純化多糖(CSTA2)在高濃度(1000μg·mL-1)時(shí)具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，其對(duì)NF-κB的活化率僅為77.2%，不僅遠(yuǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照LPS組，而且比空白對(duì)照還要低。高濃度(1000μg·mL-1)和低濃度(100μg·mL-1)的蒸餾水洗脫金蟬花純化多糖(CSTA0)均具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，且顯示良好的濃度依賴性，濃度越低抑制作用越強(qiáng)。結(jié)論：金蟬花粗多糖主要由葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)和少量的阿拉伯糖(Ara)和木糖(Xyl)組成。金蟬花純化多糖對(duì)LPS誘導(dǎo) THP-1細(xì)胞產(chǎn)生的 NF-κB的抑制作用隨著質(zhì)量濃度的升高和(或)洗脫劑種類和濃度的不同會(huì)發(fā)生明顯變化，高濃度(1000μg·mL-1)的0.2mol·L-1NaCl溶液洗脫金蟬花純化多糖(CSTA2)和低濃度(100μg·mL-1)的蒸餾水洗脫金蟬花純化多糖(CSTA0)具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，具有較高的腫瘤抑制活性，具有深入研究的價(jià)值。

金蟬花；多糖；分離純化；單糖組成；NF-κB

金蟬花別名蟬花、蟲花，為麥角菌科真菌棒束孢菌IsariacicadaeMiquel的孢梗束或大蟬草CordycepscicadaeShing的干燥子座及所寄生蟲體的干燥復(fù)合體[1]。它是一種與“冬蟲夏草”相似的菌體珍貴中藥材，其味甘性寒，無(wú)毒，具有疏風(fēng)散熱、透疹止癢、息風(fēng)止痙、明目退翳的功效。宋代唐慎微所著的《經(jīng)史證類備急本草》中就有其治療小兒夜啼驚風(fēng)的記錄。藥理實(shí)驗(yàn)表明，金蟬花具有眼部消炎、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、改善腎功能、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等方面的作用，特別是金蟬花多糖提取物具有顯著的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用[2-5]。

金蟬花含有豐富的蛋白質(zhì)、多種氨基酸和微量元素營(yíng)養(yǎng)成分[6]，還含有多糖、蟲草酸、生物堿腺苷和多球殼菌素等活性成分[7]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于金蟬花的研究較少，研究主要集中在金蟬花粗提取活性和金蟬花多糖提取和含量檢測(cè)方面。對(duì)金蟬花多糖的分離純化及純化后金蟬花多糖的單糖組成和藥理活性尚未見報(bào)道。本研究以浙江金蟬花為原料，對(duì)其中金蟬花多糖進(jìn)行單糖組成研究和分離純化，并對(duì)純化后的金蟬花多糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)的 THP-1 細(xì)胞 NF-κB 活性進(jìn)行研究，為深入開展金蟬花多糖研究，奠定了一定的有效物質(zhì)研究基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1材料

金蟬花(北京同仁堂浙江中藥材有限公司，產(chǎn)地為浙江麗水)，經(jīng)孫海林主任藥師鑒定為金蟬花正品。

半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 (中國(guó)食品藥品檢定研究院)，單糖標(biāo)準(zhǔn)品：L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖和D-葡萄糖(美國(guó) Fluka 公司，純度均為99.0%)，已知相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品：葡聚糖Dextran T-(末端-)2000、T-700、T-580、T-500、T-80、T-70、T-40、T-11、T-9.3和 T-4(瑞典 Pharmacia 公司)，二乙氨乙基纖維素(DEAE-Cellulose)(英國(guó)Whatman 公司)，碘甲烷(上海中國(guó)遠(yuǎn)航試劑廠)，牛血清白蛋白(BSA電泳級(jí)，北京紅星生物化學(xué)制品廠)，硼氫化鈉(NaBH4)、三氟乙酸(TFA)和二甲基亞砜(DMSO)(德國(guó) Merck 公司)，電透析袋(分子截留為相對(duì)分子質(zhì)量3500，上海綠鳥公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo 公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibco 公司)，G418培養(yǎng)基(德國(guó)Merck 公司)，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó) Invitrogen 公司)，脂多糖(LPS)(美國(guó)Sigma公司)。95%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮、濃硫酸、苯酚、三氯甲烷、正丁醇、氫氧化鈉、四硼酸鈉、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、硝酸鈉(NaNO3)、疊氮化鈉(NaN3)、間羥基聯(lián)苯、乙酸乙酯、吡啶、乙酸、苯胺、鄰苯二酸、甲醇、甲苯、乙酸酐、無(wú)水硫酸鈉等試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2儀器

B5-1磁力攪拌器、BSZ-100自動(dòng)部分收集器和HL-2恒流泵(上海青浦滬西儀器廠)，Beckman高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；752N紫外可見分光光度計(jì)(上海精科儀器有限公司)，II級(jí)生物安全柜(上海立康生物醫(yī)療科技公司)，SerialII細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，熒光素酶檢測(cè)儀(美國(guó)Promega公司)，Novostar全波長(zhǎng)雙板多功能儀/酶標(biāo)儀(美國(guó)BMGLabtech公司)，GC-14BPF型氣相色譜儀(日本島津)，Agilent1260Series高效液相系統(tǒng)，96孔微量培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)，微孔濾膜、抽濾瓶等均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

細(xì)胞系：THP-1/pGF1-NF-κB；穩(wěn)轉(zhuǎn)NF-κB，轉(zhuǎn)染方法：人THP-1細(xì)胞系以RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10%胎牛血清，培養(yǎng)條件為37℃，含5%CO2。將NF-κB熒光素報(bào)告質(zhì)粒pGF1-NF-κB與空白質(zhì)粒pCDNA3.1用Lipofectamine2000進(jìn)行共轉(zhuǎn)。融合后，將細(xì)胞換到含0.8mg·mL-1G418(德國(guó)Merck公司)完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。3周后分離形成的單克隆，用1μg·mL-1LPS作為刺激物在熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)。

2 方法

2.1金蟬花多糖的制備

取金蟬花藥材1kg，加入10倍體積95%乙醇水溶液脫脂，干燥后用10倍體積沸水提取，每次2h，提取3次，合并提取液，加熱濃縮至合適體積后，離心，上清液用流動(dòng)水透析2d，以除去色素和小分子無(wú)機(jī)物等。然后將透析袋內(nèi)液濃縮至約1.5L，離心后取上清液用4倍體積95%乙醇于4℃下進(jìn)行沉淀，靜置過夜，離心。沉淀物用無(wú)水乙醇和丙酮依次洗滌3次后，于60℃真空干燥器中干燥，得到金蟬花水提粗多糖。

2.2DEAE-纖維素陰離子柱色譜純化

取金蟬花粗多糖溶于蒸餾水中，制成濃度為20mg·mL-1的溶液，利用DEAE-纖維素陰離子交換柱(50cm×5cm)色譜進(jìn)行分離，上樣前以8000r·min-1高速離心20min除去不溶物。先用去離子水進(jìn)行洗脫，再依次用0.1、0.2、0.3mol·L-1的NaCl梯度洗脫，硫酸-苯酚法280nm處以紫外分光光度計(jì)進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，合并洗脫的單一高峰部分，濃縮至小體積后對(duì)去離子水透析，冷凍干燥后得到純化多糖。

2.3中性糖含量、糖醛酸含量測(cè)定和相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定 為了確定金蟬花粗多糖的純度，即總多糖含量及相對(duì)分子質(zhì)量分布，進(jìn)一步進(jìn)行了中性糖含量、糖醛酸含量的測(cè)定和相對(duì)分子質(zhì)量范圍的測(cè)定。

精確稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖50mg，置于50mL的量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，取5mL于50mL量瓶中定容，即為0.1mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別置于試管中，加水至2.0mL，再加5%的苯酚溶液1.0mL，搖勻，加濃硫酸5.0mL，搖勻，靜置10min，100 ℃沸水水浴中加熱30min，冷卻至室溫，以0mL管為參比，490nm處測(cè)定各管多糖溶液的吸光度。以吸光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取25mg金蟬花水提粗多糖(CSTA)產(chǎn)品加水30mL使溶解，離心除去沉淀，定容于50mL容量瓶中，配制成0.5mg·L-1的溶液，取0.2mL加水至2mL，加入1mL5%的苯酚溶液，搖勻，再迅速加入5mL濃硫酸，搖勻，靜置10min，100 ℃沸水水浴中加熱30min，冷卻至室溫，490nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中中性糖的含量[8]。

分別取標(biāo)準(zhǔn)半乳糖醛酸溶液(50μg·mL-1) 0、50、100、200、250μL于帶塞試管中，用蒸餾水加至250μL。在冰浴中預(yù)冷，然后加入l.5mL0.012 5mol·L-1四硼酸鈉硫酸溶液。振搖混合均勻，沸水浴加熱5min。再用冰浴冷卻至室溫，加入25μL含0.5%氫氧化鈉(NaOH)的0.15%間羥基聯(lián)苯，混合均勻，放置20min后，用紫外可見分光光度計(jì)于520nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。另取5.8mgCSTA加入50mL蒸餾水，按照上述方法測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中糖醛酸的含量。金蟬花粗多糖的純度以總多糖含量表示，總多糖含量=中性糖含量+糖醛酸含量[9]。

取濃度為0.1mol·L-1的磷酸二氫鈉(NaH2PO4)和0.3mol·L-1的硝酸鈉(NaNO3)配制緩沖液，然后用1mol·L-1的NaOH溶液調(diào)pH為7.0，再加10mL的10mg·mL-1的疊氮化鈉(NaN3)，所配制的溶液用0.45μm的濾膜過濾，超聲真空脫氣30min。取已知相對(duì)分子質(zhì)量的 葡聚糖DextranT-系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T-2000、T-700、T-580、T-500、T-110、T-80、T-70、T-40、T-11、T-9.3和T-4各2mg，溶于1mL流動(dòng)相緩沖液中，10 000r·min-1離心15min，取上清液，每次進(jìn)樣20μL，以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值對(duì)保留時(shí)間作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品按上述方法操作，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出該多糖的相對(duì)分子質(zhì)量[10-11]。

2.4單糖組成研究

為了初步確定金蟬花粗多糖的結(jié)構(gòu)組成，進(jìn)行了單糖組成研究。

取金蟬花粗多糖樣品2mg，加入3mL2mg·L-1三氟乙酸(TFA)，在110 ℃下水解3h，40 ℃下減壓濃縮蒸干，再加3mL甲醇反復(fù)減壓濃縮至干燥，重復(fù)4次，以除去殘留的TFA。將殘余物用0.5mL蒸餾水溶解，吸取5μL在纖維素板上點(diǎn)樣，與標(biāo)準(zhǔn)單糖對(duì)照進(jìn)行薄層色譜分析，展開劑為乙酸乙酯-吡啶-水-乙酸(5∶5∶3∶1)，顯色劑為苯胺-鄰苯二酸，薄層色譜板于110 ℃加熱10min顯色。在剩余溶液中加25mgNaBH4，室溫下還原3h，然后用 25%乙酸中和，再調(diào)pH值為4～5。減壓濃縮，加甲醇數(shù)次蒸干以除去反應(yīng)副產(chǎn)物硼酸及水后，加入2mL乙酸酐，100 ℃反應(yīng)1h，反應(yīng)液加甲苯，重復(fù)多次，減壓濃縮至形成干燥粉末。再用三氯甲烷萃取乙?；a(chǎn)物，加入等體積蒸餾水洗滌3次后，加入無(wú)水硫酸鈉除去三氯甲烷層中殘留水分，減壓濃縮后進(jìn)行GC分析[12-13]。

2.5對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞NF-κB抑制作用的體外細(xì)胞免疫活性實(shí)驗(yàn)分析 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 THP-1/pGF1-NF-κB細(xì)胞按每孔50 μL接種于96孔微量培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞濃度為1×106個(gè)·mL-1，培養(yǎng)24 h后每孔加入以培養(yǎng)基稀釋的多糖樣品50 μL，使得終質(zhì)量濃度分別為 100、1 000 μg·mL-1，每個(gè)質(zhì)量濃度均為2個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白對(duì)照孔(Blank組，僅加相應(yīng)體積的樣品溶解液)和陽(yáng)性對(duì)照孔(每孔加入20 μL 10 μg·mL-1LPS，終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1)。細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)15 min后，加入20 μL 10μg·mL-1LPS，使其終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1。細(xì)胞培養(yǎng) 6 h后，去除孔中的培養(yǎng)基，以蟲熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)中的裂解液1×E2661裂解細(xì)胞，每孔100μL，裂解后轉(zhuǎn)入96孔熒光檢測(cè)板，每孔加入40 μL檢測(cè)底物，立即讀取相對(duì)光單位(Relative Light Unit，RLU)，并按公式計(jì)算樣品對(duì)NF-κB的活化率。

活化率 =RLU樣品/RLU空白×100%

3 結(jié)果

3.1金蟬花多糖的分離純化

干燥的金蟬花藥材，經(jīng)脫脂干燥、水提、濃縮、透析、乙醇沉淀和真空干燥后，得到CSTA，得率為11.17%。CSTA經(jīng)DEAE-纖維素陰離子交換柱(稱取約5g樣品溶于50mL蒸餾水，離心，上樣)分離純化后，根據(jù)不同洗脫溶劑所得純化多糖分別命名為CSTA0(蒸餾水洗脫，得率7.74%)、CSTA1(0.1mg·L-1NaCl溶液洗脫，得率0.31%)和CSTA2(0.2mg·L-1NaCl溶液洗脫，得率0.86%)，CSTA3(0.3mg·L-1NaCl溶液洗脫，得率0.86%)。

3.2金蟬花多糖的中性糖含量、糖醛酸含量和相對(duì)分子質(zhì)量分析 作得中性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=13.034X+0.1928(r=0.9962)，其中Y為吸光度，X為質(zhì)量濃度(mg·mL-1)，根據(jù)CSTA吸光度為0.828計(jì)算得CSTA糖醛酸含量為48.36%。

作得糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.024X-0.081(r=0.992)，其中Y為吸光度，X為濃度(mg·mL-1)，根據(jù)CSTA吸光度為0.057計(jì)算得CSTA糖醛酸含量為12.39%。

CSTA的高效凝膠滲透色譜(HPGPC)結(jié)果見圖1，根據(jù)所作標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程Y=-0.1666X+10.914(r=0.9974)，其中Y為相對(duì)分子質(zhì)量取以10為底的對(duì)數(shù)值，X為保留時(shí)間。由于HPLC檢測(cè)使用的是示差檢測(cè)器，45.736min及后面的倒峰為緩沖溶劑的峰。根據(jù)CSTA的保留時(shí)間41.815min計(jì)算得CSTA的重均相對(duì)分子質(zhì)量9.3×103Da。 CSTA的純度即總多糖含量為60.75%。

圖1 金蟬花水提粗多糖(CSTA)HPGPC圖

3.3金蟬花多糖的糖組成結(jié)果分析

單糖標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖見圖2，金蟬花粗多糖的單糖組成見表1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算可知，金蟬花粗多糖主要由葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)以及少量的阿拉伯糖(Ara)和木糖(Xyl)組成，鼠李糖含量極少，考慮誤差因素，可以忽略不計(jì)。單糖組成物質(zhì)的量比為Ara-Xyl-Man-Gal-Glc(0.42∶0.29∶4.14∶6.38∶6.8)。

圖2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖

單糖組分名保留時(shí)間/min峰面積/uV·s面積比(%)含量(%)物質(zhì)的量比鼠李糖(Rha)4.79518220.014380.014380.02阿拉伯糖(Ara)6.107442090.348860.348860.42木糖(Xyl)7.905307970.243030.243030.29甘露糖(Man)15.4175244904.138884.138884.14半乳糖(Gal)17.1058082486.378086.378086.38葡萄糖(Glc)18.6988614436.797856.797856.80

3.4金蟬花多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞NF-κB抑制作用的體外細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)的分析 為了探索金蟬花純化多糖可能存在的免疫調(diào)節(jié)活性，利用THP-1/pGF1-NF-κB細(xì)胞系檢測(cè)不同濃度NaCl洗脫的金蟬花純化多糖對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制作用，以樣品對(duì)NF-κB的活化率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見圖3。

圖3 金蟬花純化多糖對(duì)核因子 NF-κB 的抑制作用

由于脂多糖LPS 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染的THP-1/pGF1-NF-κB細(xì)胞產(chǎn)生核因子NF-κB，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的反應(yīng)使機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)與細(xì)胞變異增殖等[14]。因此調(diào)控NF-κB活化的過程，可以控制免疫反應(yīng)的敏感性，NF-κB的活化率越小，免疫抑制作用越強(qiáng)，從而抑制腫瘤的發(fā)生。

從圖中可以看出，低濃度(100 μg·mL-1)時(shí)，活化率大小順序?yàn)椋築lank

與LPS組比較，蒸餾水洗脫CSTA0在高濃度和低濃度時(shí)活化率均下降，且低濃度時(shí)下降更多，顯示其可以產(chǎn)生抑制NF-κB活化的作用。0.2 mol·L-1NaCl溶液洗脫的CSTA2在高濃度時(shí)下降更多，但低濃度卻略有升高，顯示高濃度的CSTA2可以產(chǎn)生抑制NF-κB活化的作用，但低濃度的CSTA2會(huì)產(chǎn)生激活NF-κB活化的作用。CSTA1和CSTA3的活化率與LPS的活化率相差不大，顯示其可能沒有抑制NF-κB活化的作用。

NF-κB 轉(zhuǎn)錄活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金蟬花純化多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞NF-κB的抑制作用隨著質(zhì)量濃度的升高和(或)洗脫劑種類和濃度的不同會(huì)發(fā)生明顯變化。其中高濃度(1000 μg·mL-1)的0.2 mol·L-1NaCl溶液洗脫CSTA2和低濃度(100 μg·mL-1)的蒸餾水洗脫CSTA0對(duì)NF-κB的活化率較小，具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，具有較高的腫瘤抑制深入研究?jī)r(jià)值。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)選取金蟬花為原料藥材，通過水提醇沉獲得粗多糖，然后經(jīng)過DEAE柱色譜進(jìn)行分離純化，獲得4種初步純化的多糖。對(duì)金蟬花粗多糖的中性糖含量、糖醛酸含量和單糖組成進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明金蟬花粗多糖的中性糖含量為48.36%，糖醛酸含量為12.39%，總多糖含量為60.75%，相對(duì)分子質(zhì)量為9.3×103Da。經(jīng)分析知金蟬花粗多糖主要由葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)和少量的阿拉伯糖(Ara)和木糖(Xyl)組成。但由于多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，尚未對(duì)此多糖進(jìn)一步純化和對(duì)精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步討論，接下來(lái)本實(shí)驗(yàn)課題組擬通過部分酸水解、完全酸水解、酶解、紅外和核磁共振等分析方法進(jìn)行深入研究。

同時(shí)通過體外細(xì)胞免疫的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性實(shí)驗(yàn)，對(duì)金蟬花多糖抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞NF-κB的生物活性進(jìn)行了測(cè)定，擬尋找較好的治療癌癥的先導(dǎo)藥物，并探索其可能存在的免疫調(diào)節(jié)活性。結(jié)果表明金蟬花純化多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞NF-κB的抑制作用隨著質(zhì)量濃度的升高和(或)洗脫劑種類和濃度的不同會(huì)發(fā)生明顯變化。其中高濃度(1000μg·mL-1)的0.2mol·L-1NaCl溶液洗脫CSTA2和低濃度(100μg·mL-1)的蒸餾水洗脫CSTA0具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，具有較高的腫瘤抑制活性，具有深入研究的價(jià)值。

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PolysaccharideContentandCompositionAnalysisofGoldenCicadaFlowersandEffectonNF-κBActivityofLPSInductedTHP-1Cells

YANGQuanwei1，XIAOLiu2，HUANGXiongchao3，ZHANGGeng1，YUNancai1，TANJingling4*

[1.WuhanNo.1Hospital，Wuhan430000，China；2.WuhanhospitaloftraditionalChinesemedicine，Wuhan430000，China；3.SacCharidiaBio-PharmaceuticalTechnology(ShangHai)Co.LTD，Wuhan430000，China；4.Hubeiinstituteforfoodanddrugcontrol，Wuhan430000，China]

Objective：To clarify golden cicada flower polysaccharide content and monosaccharide composition of polysaccharides，and study the nf-kappa B activity of THP1cells induced by LPS.Methods：Polysaccharide from golden cicada flower was obtained by water extraction，dialysis purification，ethanol precipitation and vacuum drying，and further purified by DEAE cellulose-anion exchange column.4kinds of purified polysaccharides were obtained.HPGPC and GC were applied to determine uronic acid content，the relative molecular mass and the monosaccharide composition.4kinds of polysaccharides were tested for LPS induced the nf-kappa B signals of THP1cells.Results：The neutral polysaccharide content of crude Golden cicada flower was48.36%，the polysaccharide uronic acid content was12.39%.The total polysaccharide content of crude Golden cicada flower was60.75%.The relative molecular mass was9.3×103Da，molar ratio of monosaccharide composition was Xyl-Man-Gal-Glc (0.42∶0.29∶4.14∶6.38∶6.8).Polysaccharide purified by0.2mol.L-1NaCl solution elution (CSTA2) at high concentration (1000μg·mL-1) showed the strong immune inhibitory effect，the activation rate reached only77.2%，which was not only far lower than the positive control LPS group，and even lower than ck.High concentration (1000μg·mL-1) and distilled water of low concentration (100μg·mL-1)elution golden cicada flower purified polysaccharide (CSTA0) showed lower activation rate，and a good concentration dependence.Conclusion：Golden cicada polysaccharide is mainly composed of glucose (Glc)，galactose (Gal)，mannose (Man) and a small amount of arabinose (Ara) and xylose (Xyl).The purified polysaccharides shows THP1cells induced by LPS nf-kappa B inhibition.The purified polysaccharide CSTA2and CSTA0shows stronger immune inhibition，and deserve for further study.

Golden cicada flowers，polysaccharide，separation and purification，monosaccharide composition，NF-κB

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.010

2015-12-28)

武漢市科技攻關(guān)項(xiàng)目 (2013060602010263)

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譚靜玲，副主任藥師，研究方向：中藥分析；E-mail：290415991@qq.com