楊移斌，董　靖，胥　寧，劉永濤，楊秋紅，艾曉輝

(中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢　430223)

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黃鱔源嗜水氣單胞菌DB01分離鑒定及藥敏特性研究

楊移斌，董靖，胥寧，劉永濤，楊秋紅，艾曉輝

(中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢430223)

從患病的黃鱔(Monopterusalbus)體內(nèi)分離到一株致病菌株DB01，對該菌株進行人工感染、生理生化鑒定及16S rDNA序列分析。結果顯示：人工感染黃鱔出現(xiàn)與自然發(fā)病相同的癥狀，表明菌株DB01為發(fā)病黃鱔的病原菌。菌株DB01為革蘭氏陰性桿菌，無芽孢和莢膜，在兔血平板上能形成明顯的β-溶血。序列分析顯示，菌株DB01與嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的同源性達99%。藥敏試驗結果顯示，菌株DB01對諾氟沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素及氟苯尼考等抗生素高度敏感，五倍子、黃柏、地榆及烏梅等中草藥對菌株DB01抑菌作用強。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)；黃鱔(Monopterusalbus)；藥敏特性

黃鱔(Monopterusalbus)又名鱔魚，屬合鰓目(Synbranchiformes)合鰓科(Synbranchidae)黃鱔屬，是我國重要的淡水經(jīng)濟魚類[1]。黃鱔營養(yǎng)豐富，可食率較高，味道好，深受廣大消費者的喜愛。為滿足市場需求，養(yǎng)殖場加大養(yǎng)殖密度，提升養(yǎng)殖規(guī)模，形成了大規(guī)模高密度集約化的養(yǎng)殖態(tài)勢[2]。高密度養(yǎng)殖導致黃鱔養(yǎng)殖環(huán)境急劇惡化，在養(yǎng)殖過程中常暴發(fā)大規(guī)模疾病[3-6]，給養(yǎng)殖戶造成較大經(jīng)濟損失。本研究針對安徽一黃鱔養(yǎng)殖場暴發(fā)的大規(guī)模鱔魚死亡病例開展調(diào)查，通過現(xiàn)場診斷，采取病原分離純化，人工感染及各種鑒定手段，確定了疾病病原菌種類，并研究了其藥物敏感特性，以期豐富黃鱔疾病理論知識，供同行參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料

取安徽某特種水產(chǎn)養(yǎng)殖場具有典型出血癥狀瀕臨死亡的黃鱔，共10尾；人工感染用魚亦取自該養(yǎng)殖場，共100尾，體重(20±5)g，健康活力強，無病無傷，暫養(yǎng)7 d后無異樣后進行感染試驗。

1.1.2實驗試劑

營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、水解酪蛋白、TSA、兔血營養(yǎng)瓊脂平板等培養(yǎng)基購于北京路橋生物技術公司；細菌生化微量鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴增細菌16S rDNA試劑盒，TaqDNA聚合酶均購自上海生工生物工程技術服務有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；革蘭染料購自杭州微生物試劑有限公司；中草藥購自上海中醫(yī)大藥房。

1.1.3主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱，冰箱，高壓蒸汽滅菌鍋，搖床，PCR儀，核酸電泳儀，顯微鏡，無菌操作臺，恒溫水浴鍋，電子爐。

1.2方法

1.2.1臨床診斷

疾病臨床診斷針對安徽某特種水產(chǎn)養(yǎng)殖場發(fā)病情況進行調(diào)查，重點了解其發(fā)病的水質(zhì)、水溫及其他養(yǎng)殖環(huán)境情況；掌握黃鱔發(fā)病的典型癥狀及其活力，發(fā)病鱔魚重量規(guī)格等，確定其發(fā)病率及死亡率；取具有此疾病典型癥狀的瀕臨死亡的黃鱔保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2病原菌分離

病原菌分離純化在無菌狀態(tài)下選取具有典型發(fā)病癥狀瀕死的鱔魚進行解剖觀察，取鱔魚肝臟、腎臟及少量血水，分別劃線于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃下培養(yǎng)18 h后，選擇形態(tài)大小顏色基本一致，優(yōu)勢度很大的單個菌落再進行劃線純化，最后將分離純化好的菌株置于4 ℃條件下備用。

1.2.3人工感染

人工感染將已分離純化到的菌株接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，置于28 ℃培養(yǎng)18 h后，使用麥氏比濁法加無菌生理鹽水調(diào)整菌株濃度，使得菌株最終濃度為5.5×107CFU/mL。

取暫養(yǎng)7 d后無異樣的健康黃鱔100尾，平均分為ABCD四個組，其中A、B兩組為試驗組，C、D兩組為對照組。試驗組采取腹腔注射法，每尾鱔魚注射0.2 mL的分離菌株；對照組注射等量的無菌生理鹽水。在整個感染試驗期間，保持持續(xù)溶氧供給，水溫保持在24～26 ℃，保證良好的水質(zhì)條件。定期觀察試驗用黃鱔的動態(tài)，對其可能的狀態(tài)進行記錄，并及時對瀕臨死亡的鱔魚進行解剖觀察及病原菌再分離。

1.2.4生理生化鑒定

將分離已純化的菌株接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板及兔血平板上，置于28 ℃條件下培養(yǎng)18 h后觀察菌落的大小、形態(tài)、顏色及是否有溶血等特點。并展開革蘭氏染色，其他各項生理生化指標的測定參照文獻[7]進行。

1.2.5病原菌16S rDNA序列分析

(1)PCR模板的制備：分離菌株使用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)18h后，12 000 r/min離心收集菌體，按細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌總DNA，作為PCR的模板DNA。

(2)16S rDNA基因系列的擴增與測序：用于16S rDNA的PCR反應的引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATC (C/A)TGGCTCAG-3′(對應于E.coli的16S rRNA基因的第8～27 bp位置)。

反向引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGA-CTT-3′(對應于E.coli的16S rRNA基因的第1492～1510 bp位置)。

PCR反應條件為：95 ℃變性3 min，94 ℃平衡35 s，55 ℃退火35 s，72℃延伸1 min，此階段35個循環(huán)，72 ℃溫育10 min。經(jīng)PCR擴增后的產(chǎn)物進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測以證明PCR 擴增得到的片段是否是目的片段后，將PCR的最終產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行純化和序列測定。

(3)構建系統(tǒng)發(fā)育樹：將分離菌株的16S rDNA序列用運用NCBI數(shù)據(jù)庫中細菌的16S rDNA進行比對，從中選取數(shù)株與該株菌基因序列相似的菌株，采用Clustal w軟件進行多序列匹配分析[8]，用MEGA4.0軟件包中的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)進化樹[9]，通過1 000次Bootstrap檢驗置信度。

1.2.6藥物敏感特性研究

將購買的中草藥用FW177粉碎機粉碎后充分烘干，稱取中草藥20 g，加300 mL蒸餾水，充分浸泡后開始煎熬，沸騰后文火煮20 min，過濾出濾液后繼續(xù)煎煮，共3次，合并所得藥液濃縮成濃度為1 g/mL[10]，置于4 ℃條件下備用。使用6 mm打孔器將滅菌濾紙制成圓形紙片，分別浸入藥液中，形成藥敏紙片。

分離菌株藥物敏感性試驗通過使用通用的K-B法展開，將分離純化菌株接種于營養(yǎng)瓊脂肉湯培養(yǎng)基內(nèi)28 ℃震蕩培養(yǎng)18 h，使用涂布法取培養(yǎng)好的菌液200 μL涂布于水解酪蛋白瓊脂平板上。分別把抗生素及中草藥水提物的藥敏紙片均勻貼于平板，每個平板貼5片，置28 ℃下培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。抗生素敏感程度根據(jù)杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)說明判定，中草藥敏感程度根據(jù)文獻[11]判定。

2　結果

2.1臨床診斷結果

2013年6月安徽某特種水產(chǎn)養(yǎng)殖場暴發(fā)了一例嚴重疾病，引起了鱔魚的大量死亡，筆者通過實地臨床診斷，發(fā)現(xiàn)瀕臨死亡的鱔魚外觀呈現(xiàn)粘液增多，體表暗淡無光，體表無明細癥狀，生殖孔有血水流出；解剖發(fā)現(xiàn)體內(nèi)腹腔中有大量血水，肝臟腎臟出現(xiàn)不同程度充血，體壁有出血點，腸道無食物，顯微觀察未發(fā)現(xiàn)寄生蟲等微生物。發(fā)病較快，死亡率較高，引起了較大的經(jīng)濟損失。發(fā)病時水質(zhì)情況較差，氨氮偏高，但不足以致病，水色呈現(xiàn)暗黑色，水溫很高。

2.2病原菌分離純化

在無菌條件下，取10尾具有典型出血癥狀的瀕臨死亡的鱔魚的肝臟、腎臟及少量血水劃線于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)28℃恒溫培養(yǎng)18 h后，獲得一株優(yōu)勢度較高的菌株，編號DB01。分離純化菌株在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長良好。

2.3人工感染結果

試驗A、B兩組感染用鱔魚在注射分離菌株12 h后出現(xiàn)躁動不安，瘋狂游動等行為，生殖孔隨即有紅色液體流出，之后開始出現(xiàn)死亡，36 h內(nèi)試驗A、B組死亡率分別達到80%及85%，而對照C、D組則未出現(xiàn)異樣。對瀕臨死亡的感染用鱔魚解剖觀察發(fā)現(xiàn)，其腹腔有大量的血水淤積，肝臟腎臟嚴重充血發(fā)黑，體壁有大量的出血點，表現(xiàn)出與自然發(fā)病類似癥狀，經(jīng)過細菌再分離純化及鑒定，得到與原始分離菌株DB01一致的菌株，表明分離菌株DB01為黃鱔此疾病的病原菌。

2.4病原菌生理生化反應特性

分離菌株DB01經(jīng)革蘭氏染色后觀察確定為陰性菌，無芽胞與莢膜，在兔血營養(yǎng)瓊脂平板能產(chǎn)生β-溶血，分離菌株部分生理生化特征見表1。

表1　DB01菌株部分生理生化特征Tab.1　Physiological and biochemical characteristics of DB01

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性，“(+)”表示陽性反應超過24 h，“(-)”表示陰性反應超過24h，“d”表示11%～89%菌株為陽性。

2.5病原菌16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

分離菌株DB01的16S rDNA基因片段經(jīng)PCR擴增及測序后結果其大小為1 418 bp，將測序結果在NCBI中進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌株DB01的16S rDNA基因片段與已經(jīng)收錄的嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)同源性最高，均達到99%。通過Neighbor-Joining方法構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)分離菌株DB01與嗜水氣單胞菌聚為一支(圖1)，因此判定分離菌株DB01為嗜水氣單胞菌。

2.6藥敏特性

由表2可知，菌株DB01對諾氟沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素及氟苯尼考等13種抗生素高度敏感，對鏈霉素中度敏感，對萬古霉素、多黏霉素B、麥迪霉素等7種抗生素不敏感；由表3可得出，五倍子、黃柏、地榆及烏梅等對菌株DB01抑菌作用強。在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中采用藥物拌餌投喂方式進行疾病防控，發(fā)病時交替使用氟苯尼考、諾氟沙星等進行治療，并同時在養(yǎng)殖過程中拌餌投喂黃柏、地榆等進行疾病預防，取得了較好的效果。

圖1　根據(jù)16S rDNA基因序列同源性構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1　The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence homolog表2　DB01藥敏試驗結果Tab.2　Antibiotic sensitivity test of strain DB01

表3　中草藥提取液對病原菌的抑菌效果Tab.3　Antibacterial activity of Chinese herbs on pathogenic bacteria

注：抑菌圈直徑小于 10 mm 為無抑菌作用，用“-”表 示 ； 10～15 mm 為 抑 菌 作用弱，用“+”表示；15～20 mm 表示抑菌作用中等，用“++”表示；大于 20 mm 表示抑菌作用強，用“+++”表示。

3　討論

嗜水氣單胞菌大部分自然水域廣泛存在[12]，目前普遍認為其具有很強的致病性，能導致大部分水產(chǎn)養(yǎng)殖動物死亡，關于嗜水氣單胞菌致病的報道很多，如嗜水氣單胞菌可引起淡水魚細菌性敗血癥，蛙類的紅腿病，中華鱉的紅脖子病、紅底斑病、穿孔病、腐皮病等[13-14]，常給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。嗜水氣單胞菌引起黃鱔發(fā)病死亡病例正在增多，陳懷青等[15]、周飛等[5]分別報到了江蘇及四川黃鱔主養(yǎng)區(qū)嗜水氣單胞菌致病實例，并開展了相關的藥物敏感試驗研究。但從藥敏試驗結果來看，不同地區(qū)分離的嗜水氣單胞菌敏感程度不盡相同，究其原因很可能是因抗生素大量使用導致了耐藥菌株的產(chǎn)生，為此警示一旦發(fā)現(xiàn)此類病原菌致病應及時進行藥物敏感試驗，以找到有效的抗生素進行應急治療，最大程度減少經(jīng)濟損失。

本研究從安徽某特種水產(chǎn)養(yǎng)殖場分離純化到一株優(yōu)勢度很高的細菌DB01，經(jīng)過人感染后確定該菌株具有很強的致病性，經(jīng)過生理生化鑒定、16S rDNA基因測序及系統(tǒng)發(fā)育分析，確定該高致病菌株為嗜水氣單胞菌。對分離純化到的病原菌展開藥物敏感試驗，通過K-B法研究了菌株DB01對22種抗生素及26種中草藥的敏感程度，結果發(fā)現(xiàn)分離菌株對諾氟沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素及氟苯尼考等抗生素高度敏感，五倍子、黃柏、地榆及烏梅等中草藥對菌株DB01抑菌作用強。研究結果表明分離到的嗜水氣單胞菌對一些常用藥物產(chǎn)生耐藥性，為此進行疾病防治時選擇高度敏感藥物輪換使用，并且盡可能防止濫用。

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(責任編輯：鄧薇)

Isolation and identification of Aeromonas hydrophila DB01 from Monopterus albus and its antibiotic sensitivity

YANG Yi-bin,DONG Jing,XU Ning,LIU Yong-tao,YANG Qiu-hong,AI Xiao-hui

(HubeiFreshwaterAquacultureCollaborativeInnovationCenter/YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuhan430223,China;)

A pathogenic bacteria strain DB01 was isolated fromMonopterusalbussuffering diseases,and the strain expressed high pathogenicity.After artificial infection,physiological and biochemical identification and 16S rDNA sequence analysis,it was showed that tested fish had similar symptoms with that of natural infection,and the strain DB01 was the pathogen of theMonopterusalbusdisease.Strain DB01 was gram negative and no spore and capsule and it had β-hemolytic activity in rabbit blood agar.Sequence analysis showed that strain DB01 was identified asAeromonashydrophilawith 99% homology.Drug susceptibility test results showed that strain DB01 was highly sensitive to norfloxacin,levofloxacin,azithromycin,florfenicol,Rhuschinensis,Phellodendronchinense,SanguisorbaoffieinaliandPrunusmume.

Aeromonashydrophila;Monopterusalbus;antibiotic sensitivity

2015-11-03；

2016-04-01

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203085)

楊移斌(1988-)，男，實習研究員，主要從事水生動物病害臨床診斷及其防控技術研究。E-mail:yangyb1988@126.com

艾曉輝。E-mail:aixh@yfi.ac.cn

S943.131

A

1000-6907-(2016)05-0043-06